ВЕКТОР РЕL25А, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОГО ДНК Российский патент 1997 года по МПК C12N15/09 

Изобретение относится к области биотехнологии, генетической инженерии и может быть использовано для получения плазмид, синтезирующих рекомбинантные белки.

Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных генов на основе промоторов фага лямбда (см. например, Н. Bernard and D. R. Helinski. Methods Enzymol. vol. 68, рр. 482-492, 1979). Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном с Its857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32^oС, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42^oС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связаться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК рЕХ2 и рЕХ3, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания (K. K. Stanley and J.P. Luzio. The EMBO Journal, vol.3, pp. 1429-1434, 1984). Последовательности ДНК для экспрессии можно вставить в полилинкер, расположенный в 3'-конце гена lacZ. В указанных плазмидах P_R промотор бактериофага лямбда обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК, и продукт составляет значительную часть суммарного бактериального белка. Экспрессируемый белок в клетке накапливается в виде водонерастворимых агломератов.

Однако у этих векторов есть недостаток: для выделения водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка необходимо разрушать клеточную стенку бактерии.

Вектор рЕХ1 выбран в качестве прототипа для получения вектора рЕL5a. Преимущество заявленного вектора рЕL5a заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима (фиг. 1), одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E.coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка.

Сущность изобретения состоит в том, что сконструирован вектор рЕL5a размером 6,4 тысячи пар оснований (т.п.о.), состоящий из следующих элементов (фиг. 1):
-Xbal-Xbal-фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХ1 размером 5,8 т. п.о. который содержит слитный cro-lacZ, ген кодирующий слитный белок под контролем промотора Р_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена;
-BamH1-BamH1-фрагмента ДНК плазмиды pLysS (A.C.Y. Chang and S. N. Cohen. J. Bacteriol. vol.134, pp. 1114, 1978), содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.

Для конструирования плазмиды рЕL5a ДНК плазмиды рЕХ1 гидролизуют рестриктазой Хbal и достраивают по два нуклеотида в липких концах с помощью ДНК-полимеразы PollK. Параллельно получают BamH1 рестрикт размером 0,6 т.п. о. из плазмиды рLysS (A.C.Y. Chang and S.N. Cohen. J. Bacteriol. vol. 134, pp. 1141, 1978), содержащий ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющий два достроенных с помощью PollK нуклеотида в липких концах. Фрагмет рЕХ1 лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli, содержащие в хромосоме температурочувствительный ген бактериофага лямбда с Its857, например клетки штамма PLT90. Трансформанты высевают на среду с ампициллином при 30^oС. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^oС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду рEL5a. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^o С.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение векторной плазмиды рEL5a с оперонной системой экспрессии и лизиса.

Клетки бактерий E.coli PLT90, содержащие плазмиду pEX1 (K.K. Stanley and J. P. Luzio. The ЕМВО Journal, vol. 3, pp. 1429-1434, 1984), выращивают в 50 мл бульона 2YT (16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды), содержащего 100 мкг/мл ампициллина до титра 10₉ кл/мл.

Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 2 мл раствора (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 4 мл раствора 0,2 М NaOH, 1% додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют 10 мин во льду, добавляют 3 мл охлажденного 5 М раствора ацетата калия, рН 4,8, перемешивают, оставляют на 10 мин во льду, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА) и добавляют равный объем насыщенного раствора ацетата натрия. После инкубации в течение 30 мин при минус 20^oС осадок удаляют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропанола и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом и ресуспендируют в 100 мкл ТЕ8-буфера.

Плазмидную ДНК (1 мкг рЕХ1) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Xba1 (10 ед.) в буфере А (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl, 4 мМ спермидина) в течение 2 часов. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E. coli, достраивают два из четырех нуклеотидов в липких Xba1-концах. Белки удаляют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл ТЕ8.

Для получения фрагмента ДНК с геном лизоцима проводят рестрикцию 10 мкг ДНК плазмиды pLysS (A. C. Y. Chang and S. N. Cohen. J. Bacteriol, vol.134, pp.1141, 1978) рестриктазой BamH1. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E. coli достраивают два из четырех нуклеотидов в липких BamH1-концах. Фрагмент -BamH1-BamH1- с частично достроенными липкими концами размером 0,6 т. п. о. выделяют с помощью электрофореза сорбцией на бумагу ДЕ81. Бумагу промывают, инкубируют 30 мин при 80^oС в буфере 2 М ацетата натрия, 50 мМ трис-НCL, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА. ДНК, перешедшую в раствор, удаляют с бумаги центрифугированием, к раствору добавляют 2 объема этанола. После инкубации при -20^oС в течение 1 часа осадок собирают центрифугированием и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ8.

0,5 мкг фрагмента ДНК вектора рЕХ1 смешивают с 0,2 мкг ДНК, содержащей ген лизоцима бактериофага Т4. Соединение фрагментов проводят с помощью 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в буфере: 30 мМ трис-НCl, рН 7,2, 10 мМ хлористого магния, 2 мг/мл желатины, 1 мМ спермидина, 0,1%-меркаптоэтанола, 0,2 мМ АТФ при 20^oС в течение 2 часов.

Полученной смесью трансформируют клетки E.coli PLT90, содержащие clts857 репрессор. Для этого ночную культуру клеток разводят средой LB с 10 мМ MgSO₄ в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до плотности А550=0,3 ОЕ. После 15 мин охлаждения при 0^oС клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 1/3 первоначального объема буфером 30 мМ ацетата калия, рН 5,8, 100 мМ RbCL, 50 мМ MnCl₂, 15% глицерина, и оставляют на 30-60 мин на льду. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 1/12,5 первоначального объема в буфере 10 мМ MOPS, рН 6,8, содержащем 10 мМ RbCl, 75 мМ СаCl₂, 15% глицерина и инкубируют 15 мин на льду. К суспензии клеток добавляют лигированные фрагменты ДНК, инкубируют 40 мин при 0^oC, затем 2 мин при 34^oС, 2-3 мин при 0^oС, разбавляют в 5 раз средой 2YT, растят 30 мин при 30^oС и высевают на агаризованную среду 2YT с ампициллином (50 мг/мл).

Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^oС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду рЕL5а. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10мМ трис, рН 8,0, 1 ЭДТА при -20^oС.

Пример 2. Использование вектора рЕL5а для получения рекомбинантных белков в виде водонерастворимых агломератов.

Клетки PLТ90, содержащие плазмиду pEL5а, инокулируют в 1 мл среды LB со 100 мкг/мл ампициллина и растят ночь при 30^oС. Ночную культуру разводят в 2 мл этой же среды в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до 0,2 ОЕ при 550 нм, затем повышают температуру до 42^oС для индукции синтеза слитного белка и растят еще 2 часа. Затем добавляют хлороформ до 1% и инкубируют при 37^oС еще час. Далее лизат центрифугируют, ресуспендируют осадок в 75 мкл буфера ТЕ8 и добавляют равный объем буфера для электрофореза (160 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 4% додецилсульфата натрия, 4 мМ ЭДТА, 6%-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего). Клеточные белки анализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли (U.K. Lammli. Nature, vol.227, рр. 680-685, 1970). После окончания электрофореза белки в геле фиксируют и окрашивают кумасси ярко-голубым R-250.

Анализ полученных результатов показывает, что в результате действия лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных белков в среду, что проявляется в ослаблении минорных белковых полос. В контроле, в случае использования плазмиды рЕХ1, такого эффекта нет.

Таким образом, изобретение позволяет получать водонерастворимые агломераты рекомбинантных белков без использования дополнительных методов разрушения клеточных стенок.

Изобретение относится к области биотехнологии, и в частности к генетической инженерии, и может быть использовано при создании плазмид и соответствующих штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, а также для очистки белковых продуктов. Вектор pEL5а содержит оперон, состоящий из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима, одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E. coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка. 1 ил.

Вектор рЕL5а, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК, размером 6,4 т.п.о, содержащий: XbaI-XbaI фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХI размером 5,8 т.п.о. со слитным cro-LacZ геном, кодирующим белок под контролем промотора Р_R бактериофага лямбда и полилинкером в 3'-конце LacZ-гена; BamHI-BamHI фрагмент ДНК плазмиды pLys S с геном лизоцима бактериофага Т4 размером 0,6 т.п.о. уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК на 3'-конце гена LacZ, SmaI, BamHI, SalI, PstI; оператор O_R и промотор P_R бактериофага λ терминаторы транскрипции фага fd; генетический маркер устойчивость к ампициллину; спектр хозяев - бактерии Escherichia coli с геном clts 857 бактериофага лямбда.