ПОЛИПЕПТИЛ Р102, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК НР 102, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД Р102, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РН А102, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Р102, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА Р102 Российский патент 1997 года по МПК C12N15/48 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии генной инженерии и иммунологии и представляет собой гибридный полипептид, состоящий из полипептида, продукта фрагмента гена pol вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), ответственного за синтез обратной транскриптазы ВИЧ в β-галактозидазы E.coli, синтезируемый бактериальным штаммом E.coli, несущим рекомбинантную плазмиду, имеющую в своем составе клонированный фрагмент гена pol ВИЧ-1 (pol1) слитный с геном b-галактозидазой E.coli и связывающийся с антителами к продуктам этого гена, что позволяет проводить серодиагностику синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

СПИД возникает в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ при попадании в организм поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Заболевание характеризуется длительным (от 2-х до 10-ти лет) бессимптомным периодом, в течение которого в крови инфицированного определяются только антитела к вирусным белкам, затем следует прогрессирующая деградация иммунной и центральной нервной системы. Поэтому для проведения экстренных противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного начала лечения ВИЧ-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять инфицированных ВИЧ на ранних этапах инфекции.

Многочисленные исследования ВИЧ позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. В настоящее время известно два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), имеющих сходную организацию генома и различающихся по антигенной структуре вирусных белков.

ВИЧ имеет наиболее сложное из всех известных ретровирусов строение генома. Помимо генов gag, pol и env, направляющих синтез основных вирионных белков и общих для всех ретровирусов, геном ВИЧ-1 содержит еще шесть генов: vif, tat, rev (или art, или trs), 3'-nef, vpr и vpu. Геном ВИЧ-2, в отличии от ВИЧ-1, не содержит гена vpu, но содержит ген vpx (Science, 1986, 231, р. 1549; Cell, 1986, 46, р. 807-817).

Ген pol вируса иммунодефицита человека кодирует три белка. Один из них, белок PT (reverse transcriptase) обратная транскриптаза является основным белком полимеразного комплекса вируса и выполняет функции, связанные с воспроизводством генетической информации. Хотя обратная транскриптаза - неструктурный белок, антитела к нему находят в сыворотке крови практически у всех инфицированных ВИЧ лиц, и появление таких антител служит одним из критериев полной сероконверсии. Другой важной особенностью этого белка является его относительная инвариантность от изолята к изоляту. Все это говорит о диагностической важности обратной транскриптазы ВИЧ. Известно, что обратная транскриптаза ВИЧ имеет три антигенноактивные детерминанты на которые в первую очередь, у инфицированных ВИЧ образуются антитела (AIDS Research and human retroviruses, 1989, 5, p. 61).

Большинство методов диагностики ВИЧ-инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в сыворотках крови и других биологических жидкостях (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлюоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных белков ВИЧ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВИЧ, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВИЧ, и в частности гена env (патенты ЕПВ, N 0265 785, C 12 N 15/00, 1986; ЕПВ, 0 270 114, С 12 N 15/00, 1986; ЕПВ, 0276 591, С 12 N 15/00, 1986 и др.).

В настоящее время ведется поиск полипептидов наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики СПИД. Исследования ведут как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕВП, 0265 785, С 12 N 15/00, 1986; РСТ, 89/03878, С 12 N 15/00, 1989), так и в направлении выбора наиболее антигенноактивных детерминант (ЕВП, NN 0306219 и 0311228, С 12 N 15/00,1986 и 1987, соответственно) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВИЧ (РСТ, 91/05864, С 12 N 15/48, 1989; ЕПВ, 0361749, С 12 N 15/48, 1989).

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный гибридный полипептид Р102, содержащий три антигенноактивные детерминанты обратной транскриптазы и b-галактозидазу E.coli, связывающий антитела к обратной транскриптазе, продукту гена pol ВИЧ-1; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид Р102 и входящий в состав рекомбинантной плазмиды рНР102; штамм E.coli ВКПМ N В-5876, содержащий рекомбинантную плазмиду рНР102 и экспрессирующий белок Р102.

Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Eschrichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^oС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32 ^oС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37 ^oС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага l проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32^oС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^oС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага l составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1 х 10⁸ кл/мл. Белок стабилен при температуре 4^oС в течение 3-4 месяцев.

Рекомбинантный полипептид Р102, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена pol ВИЧ-1 в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов N И-5876.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК НР102.

У ВИЧ-инфицированного человека отбирают из вены 10 мл гепаринизированной крови, к которой добавляют 30 мл лизирующего раствора (155 mM NH₄ Cl; 10 mM KHCO₃; 0,1 mM EDTA). Смесь инкубируют 15 мин на льду. Центрифугируют при 2000 G 10 мин при 4^oС. Белые клетки ресуспендируют в 10 мл SE (75 mM NaCl, 2 mM EDTA) добавляют протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и 1 мл 20% SDS. Смесь инкубируют 4 ч при 37^o, добавляют 1/2 объема (5 мл) водонасыщенного фенола и такое же количество хлороформа с изоамиловым спиртом (24: 1). Полученную смесь встряхивают на качалке 15 мин и центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин. К отобранной водной фазе добавляют 1/30 объема NaOAc (рН 5,5) и равный объем изопропилового спирта. ДНК осаждают центрифугированием и промывают 70%-ным раствором этилового спирта. Осадок ДНК растворяют в буфере ТЕ (10mM Трис-HCl, 1mM EDTA, рН 8,0) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

В эппендорфовскую пробирку на 0,5 мл вносят следующие компоненты: деионизированная вода 43,5 мкл, реакционный буфер 10 мкл х 10 (конечная концентрация 25 mM Трис-HCl, рН 8,3 (при 25 ^oС), 50 mM KCl, 2mM MgCl₂, 1 mM b-меркаптоэтанол, желатин 200 мкг/мл), смесь dNTP 16 мкл (конечная концентрация 200 мкМ), праймер N1 5' TGTACTGATCCCGGATCC 3' 5 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), праймер N2 5' AGCCTCAGGACCTTGCC 3' 5 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), праймер N3 5' GCAAAGCAGCCTCAGGACC 3', 5 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), праймер N4 5' CTGCAGTGGTACCCATGCC 3', ДНК (матрица для амплификации) 10 мкл (конечная концентрация 1 нг), Tag полимеразу 0,5 мкл (2,5 единицы на пробу).

Содержимое пробирки перемешивают на вортексе 3-4 с и осаждают на микроцентрифуге в течение 5-10 с.

В пробирку добавляют 50 мкл минерального масла и помещают в аппарат для амплификации ДНК N 801-0177 DNA Thermal Cycler Perkin-Elmer Corporation.

Реакционную смесь инкубируют при 94^oС 7 мин, а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 2 мин при 37^oС (гибридизация праймеров), 5 мин при 72^oС (достройка праймеров), 2 мин при 94^oС (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72^oС 10 мин.

В пробирку вносят 50 мкл хлороформа, материал с хлороформом встряхивают 5 с на вортексе, а затем центрифугируют на микроцентрифуге 10 с. Отбирают водную (верхнюю) фазу (около 100 мкл), которая образуется в форме сферической капли, и переносят в чистую пробирку.

10 мкл водной фазы используют для анализа продуктов амплификации в 2% агарозном геле с бромистым этидием (видны два фрагмента размерами 600 и 170 п.н.). Синтезированные на ДНК-матрице фрагменты ДНК гидролизуют рестриктазой MstII в буфере для рестрикции (10 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl и 1 mM дитиотрейтол рН 7,5) в течение 14 ч при температуре 37 ^oС. Фермент анактивируют нагреванием при 70^oС 15 мин. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 10 мкл Н₂О. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК помещают в эппендорфовскую пробирку, содержащую 3 мкл лигазного буфера (50 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM дитиотрейтол, 1,0 mM АТФ, 50 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 1 мкл (100 ед.) Т4 ДНК лигазы и 16 мкл Н₂О. Смесь инкубируют 3 ч при 16^oC. В результате лигирования получают фрагмент ДНК НР102 размером 770 п.о.

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК НР102.

GGATCCGGGATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCC
AAAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCT
ATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACAA
AAATAGAGGAGCTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGACTTACCACACCAGACAAGAAAC
ATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGGTTATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAG
TACAGCCTGTAGTACTGCCAGAAAAGGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAGTTAG
TGGGGAAATTGAATTGGGCAAGTCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGTA
AACTCCTTAGAGGAACCAAAGCACTAACAGAAGTAGTACCATTAACAGAAGAAGCAGAGC
TAGAACTGGCAGAAAACAGAGAGATTCTAAAAGAACCAGTACATGGGGTGTATTATGACC
CATCAAAAGACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCAGGGGCAAGGTCCTGAGGCTGCTTTGC
AGGATTCAGGATTAGAAGTAAACATAATAACGGACTCACAATATGCATTAGGAATCATTC
AAGCACAACCAGATAAAAGTGAATCAGAGTTAGTCAATCAAATAATAGAGCAGTTAATAA
AAAAGGAAAAGGTCTATCTGGCATGGGTACCACTGCAG
Пример 2. Получение плазмиды рНР102.

Синтезированный на ДНК-матрице фрагмент ДНК гидролизуют рестриктазами BamH1 и Pst1 в буфере для рестрикции (10 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl и mM дитиотрейтол рН 7,5) в течение 14 ч при температуре 37^oС. Ферменты инактивируются нагреванием при 70^oС 15 мин. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл Н₂О. 10 млк обработанного рестриктазами фрагмента ДНК помещают в эппендорфовскую пробирку, содержащую 3 мкл лигазного буфера (50 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM дитиотрейтол, 1,0 mM АТФ, 50 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 2 мкл (0,2 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pEL5B, обработанной рестриктазами BamH1 и Pst1 и 4 мкл H₂О. К смеси добавляют 1 мкл (100 ед) 14 ДНК лигазы и инкубируют 3 ч при 16^oС.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT90 по обычной методике (Molecular cloning. New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB:агаром, содержащие 25 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазой BamH1 и Pst1 и гидролизат исследуют электрофорезом в 1% агарозе.

Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HP102 имеет на электрофорезе 2 полосы ДНК размерами 6400 и 770 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК. При определении нуклеотидной последовательности плазмиды, названной рНР102, установлено, что синтезированный нами фрагмент ДНК НР102 через BamH1 сайт соединен с 3'-концом гена b-галактозидазы E.coli.

Пример 3. Штамм E.coli НР102, содержащий плазмиду рНР102, выращивают в 100 мл среды LB при 30^oС до плотности 8 х 10 кл/нл. После этого температуру повышают до 37^oС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680-685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLT90, содержащий векторную плазмиду рЕL5B и не содержащий полученную нами плазмиду рНР102. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli HP102, содержащий плазмиду рНР102, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 140-150 кД. Этот полипептид назван Р102. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность b-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента провирусной ДНК гена pol ВИЧ-1 представлена ниже:
IRDQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTK
IEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPVVLPEKDSWTVNDIQKLV
GKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVVPLTEEAELELAENREILKPVHGVYYDP
SKDLIAEIQKQGQGPEAALQDSGLEVNIITDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQLIK
KEKVYLAWVP
слитный с b-галактозидазой E.coli.

Пример 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2 Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,5 M NaCl1, 20 mM трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37^oС обрабатывают сывороткой, содержащей антитела к вирусу ВИЧ-1, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^oС в течение 1 ч. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1 М трис-НСl, рН 8,0). Анализ показывает, что полипептид Р102 связывается с антителами к вирусу иммунодефицита человека первого типа.

Таким образом, данное изобретение позволяет определять антитела к продуктам гена pol ВИЧ-1 с высокой эффективностью и специфичностью, а сам процесс определения не требует работы с высокоинфекционным вирусным материалом.

Область использования - биотехнология, генная инженерия и иммунология. Сущность изобретения заключается в том, что создан гибридный полипептид Р102, состоящий из полипептида, способного связывать антитела к обратной транскриптазе продукту гена pol ВИЧ-1 и β-галактозидазы E.coli. Гибридный полипептид синтезируется бактериальным штаммом Esherichia coli ВКПМ N B-5876. Штамм получен в результате трансформации плазмидной ДНК рН Р 102, несущей фрагмент гена pol ВИЧ-1.

1. Полипептид Р 102, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, полученный в штамме бактерий Escherichia coli ВКПМ N В-5876, трансформированном рекомбинантной плазмидой pНР102, кодирующий полипептид со следующей аминокислотной последовательностью:

слитой с бета-галактозидазой E.coli, и обладающей способностью связываться с антителами к обратной транскриптазе продукту гена pol ВИЧ-1 с мол. м. 140 150 килодальтон при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле. 2. Фрагмент ДНК НР 102, кодирующий полипептид Р 102 и полученный с помощью цепной реакции полимеризации с нуклеотидной последовательностью

содержащий на 3'-конце стоп-кодон. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pНР 102, кодирующая полипептид Р 102, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, размером 7170 п.о. содержащая BamHI Pst фрагмент ДНК вектора pЕL5В, включающий ген бета-галактозидазы E.coli размером 6400 п.о. PstI Bam HI фрагмент ДНК НР 102, кодирующий полипептид Р 102 размером 770 п.о. по одному участку расщепления рестриктазами BamHI и Pst I; промотор бактериофага лямбда cro LacZ; генетические маркеры: Amp^R ген устойчивости к ампициллину. 4. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ N В-5876 продуцент полипептида Р 102, предназначенного для определения антител к вирусу иммунодефицита человека 1-го типа.