Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики гепатита С.
Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит Д, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение вирусом гепатита С, как правило, осуществляется при переливании крови. Вирус гепатита С при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В, однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени.
Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени. Поэтому для проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять людей, инфицированных вирусом гепатита С.
Многочисленные исследования вируса гепатита С позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. Вирус гепатита С имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Геном вируса гепатита С содержит единственную открытую рамку считывания, которая перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010 3011 аминокислотных остатков, являющийся предшественником индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков. К структурным белкам вируса гепатита С относятся Cor (ядерный) антиген (молекулярная масса 19 кДа) и два гликопротеина с молекулярными массами 32 кДа и 72 кДа. Все они процессируются с N-концевого участка вирусспецифического полипротеина. Cor-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид вируса гепатита С. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона вируса гепатита С, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком вируса гепатита С (NS1). Белок NS2 вируса гепатита С размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 размером 60 кДа обладает нуклеотид трифосфатсвязывающей геликазной активностью и, вероятно, участвует в репликации генома вируса гепатита С.
Кроме того, он имеет ферментативную активность сериновой протеазы и, по-видимому, обеспечивает процессирование неструктурных белков. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, белок NS4 гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью и, вероятно, участвует в репликации вирусного генома.
Большинство методов диагностики инфицированности вирусом гепатита С основано на определении антител к белкам вируса гепатита С в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита С, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты вируса гепатита С вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов вируса гепатита С, и, в частности, рекомбинантного белка NS4 вируса гепатита С (патенты ЕР NO 445423 А2, кл. G 01 N 33/576, 1990; EP NO 419182 A1, кл. C 12 N 15/51, 1990; EP NO 388232 A1, кл. C 12 N 15/51, 1990; EP NO 406511 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 416725 A2, C 12 N 15/51, 1990 и др.).
В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕР NO 388232), так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант (ЕР NO 455423) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов вируса гепатита С (ЕР NO 377303 А1, С 12 N 5/51, 1989).
Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный искусственно созданный полипептид, состоящий из продукта экспрессии фрагмента генома вируса гепатита С, слитного с бета-галактозидазой E. coli, связывающий антитела к продукту гена NS4 вируса гепатита С, кодирующий их фрагмент ДНК НС280, штамм E.coli НС88 ВКПМ N В-6598, трансформированный рекомбинантной плазмидой рНС280, содержащей фрагмент ДНК НС2820.
Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37 град. С колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30 32 град. С, колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37 град. С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30 32 град. С Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39 - 42 град.С. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1х10 кл/мл. Белок стабилен при температуре 4 град.С в течение 5 6 месяцев.
Полипептид, выделенный и очищенный из штамма-продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к NS4 антигену вируса гепатита С в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N ВКПМ В-6598.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение фрагмента ДНК НС280.
Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды:
cr1 5' -CCNCGGANCCTTGACAACAGGCAGTGTGGTCATTGTAGGTAGGATTGTCTTGTCCGGAAGG - 3'
cr2 5' CCGGCCGTTGTTCCAGACAGAGAGCTTCTCTA 3'
cr3 5' CCAGGAATTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCCTCGCACCTTCCTTACATCGAGCAAGGG 3'
cr4 5' AATGCAGCTCGCCGAGCAATTCAAG 3'
cr5 5' CAGAAGGCGCTCGGCTTACTGCAAACAGCCTCCAAGCAACGGGAGGCTGCTGCTCCAGTGGTG 3'
cr6 5' GAGTCCAAGTGGCGAGCACTTGAGGCATTCTAACTGCAGGTCCGC 3'
rc1 5' CTACCTACAATGACCACACAGCCTGTTGTCAAGGATCCGAGG 3'
rc2 5' - CATCGAATTCCTGGTAGAGAAGCTCTCTGTCTGGAACAACGGCCGGCCTTCCGGACAAGACAATC 3'
rc3 5' AAGGRGCGAGGAGCACTCTTCCATCT 3'
rc4 5' GCCGAGCGCCTTCTGCTTCAATTGCTGGCGAGCTGCATTCCTTGCTCGATGTAAGG 3'
rc5 5' CCTCCGCTTGCTTGGAGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc6 5' GCGGACCTGCAGTTAGAATGCCTCAAGTGCTCGCCACTTGGACTCCACCACTGGAGCAAGCAG 3'
Олигонуклеотиды cr 1, 2, 3, 4, 5, 6 и rc 1, 2, 3, 4, 5, 6 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фаза Т4. Для этого, в эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмолей каждого из олигонуклеотидов, 50 мкл десятикратного буфера для киназы (0,5М трис HCl, рН 7,6, 0,1М MgCl 50 мМ дитиотреитол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмолей (150 мкКИ) [гамма- Р] АТФ (удельная активность 3000 Ки/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага Т4, бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30 60 минут при 37 град.С. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98 град.С, охлаждают до 16 град.С. 100 мкл смеси, обработанных киназой олигонуклеотидов, смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66 М трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl 12, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), добавляют 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 4 град. С в течение 5 часов. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65 град. С в течение 15 минут для инактивирования фермента.
10 мкл раствора, обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 280 п.н.).
100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотреитол) в течение 5 часов при температуре 37 град.С. Ферменты инактивируют нагреванием при 70 град.С.
10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 280 п.н.).
ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pUCl18, обработанной рестриктазами BamHI и PstI.
Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5 альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма НСВК имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 280 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК НС280.
Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК НС280:
C C T C G G A T C C T T G A C A A C A G G C T G T G T G G T C A T T G T A G G
T A G G A T T G T C T T G T C C G G A A G G C C G G C C G T T G T T C C A G A
C A G A G A G C T T C T C T A C C A G G A A T T C G A T G A G A T G G A A G A
G T G C T C C T C G C A C C T T C C T T A C A T C G A G C A A G G A A T G C A
G C T C G C C G A G C A A T T C A A G C A G A A G G C G C T C G G C T T A C T
G C A A A C A G C C T C C A A G C A A G C G G A G G C T G C T G C T C C A G T
G G T G G A G T C C A A G T G G C G A G C A C T T G A G G C A T T C T A A C T
G C A G G T C C G C
Фрагмент ДНК, аналогичный НС280, был также получен известным методом цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc6.
Пример 2. Получение плазмиды рНС280.
Синтезированный фрагмент ДНК НС280 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл дистиллированной воды. 10 мкл фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5A.
Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT90. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1%-ным LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. ДНК обрабатывают рестриктазами PstI и BamHI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2%-ном агарозе.
Отбирают штамм, имеющий на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 280 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС280. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что фрагмент ДНК в плазмиде рНС280 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида рНС280 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотную последовательность NS4 белка вируса гепатита С, слитную с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.
Пример 3.
Выделение полипептида.
Штамм E. coli, содержащий плазмиду рНС280, выращивают в 100 мл среды LB при 30 град.С до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 39 град.С и растят клетки еще в течение 2-х часов. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по одному из известных методов.
Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли. В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PLT90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий плазмиду рНС280. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E.coli HC280, содержащий плазмиду рНС280, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 120 130 кД. Аминокислотная последовательность полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, кодирующего участок гена NS4, представлена ниже:
X-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Gly-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val- Leu-Ser-Gly-Arg-Pro-Ala-Val-Val-Pro-Asp-Arg-Glu-Leu-Leu-Tyr-Gln- Glu-Phe-Asp-Gln-Met-Glu-Glu-Cys-Ser-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu- Gln-Gly-Met-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu- Leu-Gln-Thr-Ala-Ser-Lys-Gln-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Pro-Val-Val-Glu- Ser-Lys-Irp-Arg-Ala-Leu-Glu-Ala-Phe, где X аминокислотная последовательность β галактозидазы E.coli.
Пример 4. Контроль антигенной активности.
Контроль антигенной активности полипептида осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем переносят электрофоретически разделенные белки на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 часа. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером ТВS (0,15М NaCl, 20 mM трис-HCL, pH 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 час при 37 град.С обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к вирусу гепатита С, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конюъгатом при 37 град С в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полученный полипептид связывается с антителами к вирусу гепатита С.
Таким образом, данное изобретение представляет собой полипептид, взаимодействующий с антителами к белку NS4 вируса гепатита С, позволяющий определять антитела к вирусу гепатита С.
Использование: иммунобиотехнологическая диагностика вируса гепатита С человека. Сущность: получение фрагмента ДНК НС 280, определяющего синтез полипептида, который обладает свойствами белка NS4 вируса гепатита С человека. Полипептид получают с помощью штамма бактерий Escherichia coli, трансформированного плазмидой, содержащей фрагмент ДНК НС 280. Данный полипептид способен связывать антитела к продукту гена белка NS4 вируса гепатита С. 3 с.п. ф-лы.
содержащий на 3'-конце стоп-кодон и определяющий синтез рекомбинантного полипептида НС 280, обладающего способностью связывать антитела к продукту гена белка NS4 вируса гепатита C.
где X аминокислотная последовательность бета-галактозидазы.
