СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1995 года по МПК A61K39/114 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению вакцины для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота и овец.

Некробактериоз инфекционное заболевание крупного рогатого скота, овец, лошадей и других видов домашних животных. Пораженность животных в отдельных хозяйствах достигает 40-50%
Для боробы с некробактериозом используют различные лечебные препараты антибиотики, сульфаниламиды и др. позволяющие снизить смертность животных, но не обеспечивающие формирование иммунитета к заболеванию. В связи с этим основное внимание исследователей направлено на разработку средств специфической профилактики, в частности вакцин.

Несмотря на предпринимаемые усилия достигнуты лишь незначительные успехи в получении вакцины для профилактики некробактериоза. В частности, известная вакцина Pietivac, полученная на основе инактивированных формалином микробных клеток Bacteroides, F'necrophotum, Clostridium, Staph с добавлением адъюванта фосфата кальция, обладает низкой иммуногенностью и реактогенна [1]
Известен также способ получения вакцины против некробактериоза, заключающийся в извлечении и использовании в качества антигена инактивированного эндотоксина F.necrophorum [2] Однако получаемая в результате вакцина не содержит полного набора антигена и, вследствие этого, недостаточно эффективна.

Наиболее близким аналогом является способ получения вакцины против некробактериоза, в состав которой входят компоненты, участвующие в патогенезе инфекционного процесса: клеточный экстракт (эндотоксин) бактерий некроза и выделяемые ими экзотоксины, содержащиеся в фильтрате бактериальной суспензии [3] Для получения вакцины берут культуру возбудителя некробактериоза, выделенную из местного очага, выращивают и отделяют микробные клетки от культуральной жидкости. Для получения эндотоксина микробные клетки разрушают ультразвуком, разрушенные клеточные стенки отделяют центрифугированием и определяют содержание общего белка по Лоури. Для получения экзотоксина культуральную жидкость обрабатывают сульфатом аммония и очищают диализом. Далее полученные эндотоксин и экзотоксин инактивировали добавлением формалина и смешивали с адъювантом на основе легкого минерального масла и ланолина. Вакцину применяют двукратно с интервалом 4-6 недель. Эффективность вакцины 85-87%
Однако известный способ получения вакцины предусматривает использование мощных ультразвуковых генераторов, постоянная работа возле которых вызывает декальцинацию зубов и костной ткани у технического персонала и потерю их здоровья. Кроме того, получаемая вакцина не достаточно иммуногенна, так как требует двукратного введения и обеспечивает иммунитет только в течение 3,5-4 мес.

Задачей изобретения является разработка технологического способа получения вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и обеспечивающей эффективную защиту животных от некробактериоза при однократном введении.

Технический результат заключается в получении вакцины, вызывающей формирование длительного и напряженного иммунитета против некробактериоза у однократно привитых животных.

Сущность изобретения заключается в следующем: для изготовления вакцины используют эпизоотическую культуру возбудителя некробактериоза, выделенную из местного очага, выращивают, инактивируют и отделяют выращенную культуру от культуральной жидкости. Антигенные субстанции извлекают как из биомассы, так и из культуральной жидкости, используя щадящие методы обработки, способствующие сохранению активности антигенов при извлечении. В частности, для извлечения антигена из микробных клеток, отделенную биомассу ресуспендируют в дистиллированной воде до получения суспензии с концентрацией 150-250 млрд. кл/мл. Экстракцию антигена осуществляют из полученной суспензии путем последовательного трехкратного замораживания оттаивания клеток и их гомогенизации. Далее гомогенат центрифугируют при 15000-20000 g и из супернатанта выделяют протективный антиген, представляющий собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин. Параллельно из культуральной жидкости выделяют экзотоксин путем осаждения его желатином в концентрации 0,03-0,06 мас. Применение желатина позволяет почти полностью извлечь белки из культуральной жидкости. При этом образуемый на дне сосуда плотный осадок, содержащий осажденные белки, легко отделяется без центрифугирования после удаления надосадочной жидкости по принципу разделительной воронки, что удобно при обработке больших объемов культуральной жидкости. Желатин не токсичен, в составе вакцины не вызывает образования нерассасывающегося отека тканей у животных и поствакцинальных осложнений. Антиген из микробных клеток, представляющий собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин, объединяют в соотношении 1:3 с экзотоксином (общее содержание белка 30 мг/мл), повторно добавляют формалин и соединяют с масляно-ланолиновым адъювантом в соотношении 1: 1.

Полученная формолэмульсионная вакцина имеет следующий состав, мл: Цитоплазматическая фракция, содержащая эндотоксин, и экзотоксин, взятые в соотношении 1: 3 с общим содержанием белка 30 мг/мл 450-550 Формалин 3,5-5,0 Минеральное масло 391,0-487,0 Ланолин Остальное до 1 л
Вакцину применяют однократно подкожно: крупному рогатому скоту в нижнюю треть шеи по 2 см³, молодняку с 4 мес. возраста до года 1 см³; овцам по 0,5 см³, ягнятам с 4 мес. возраста до года 0,2-0,3 см³.

П р и м е р 1. Для приготовления вакцины производят предварительное выделение эпизоотического штамма возбудителя болезни из местного очага. Культуру возбудителя выращивают реакторным непрерывным способом в модифицированной жидкой питательной среде на основе ферментативного мясного гидролизата по Хоттингеру. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и регулируют рН. Выращенную культуру инактивируют 0,3%-ным раствором формалина и центрифугируют при 19000 g. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 200 млрд. кл/мл. Суспензию подвергают лизису трехкратным замораживанием-оттаиванием при температуре -40 и +37^оС. Лизированную бактериальную массу дополнительно подвергают разрушению в гомогенизаторе. Гомогенат центрифугируют при 15000 g. Из супернатанта выделяют антиген, представляющий собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин. Параллельно в освобожденной от бактерий культуральной жидкости определяют содержание белка по Лоури (или другими общепринятыми методами), который затем осаждают желатином в конечной концентрации 0,05 мас. при комнатной температуре в течение 5 ч. В полученном осадке, представляющем собой экзотоксин, вновь определяют содержание белка. Цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин, объединяют с экзотоксином в соотношении 1:3 (общее содержание белка 30 мг/мл). Повторно добавляют 0,2% раствор формалина, регулируют рН до 7,4 и выдерживают при температуре 40^оС в течение 6 ч. Полученную смесь антигенов соединяют с масляно-ланолиновым адъювантом в соотношении 1:1, эмульгируют до получения гомогенного препарата. Полученная формолэмульсионная вакцина имеет следующий состав, мл: Цитоплазматическая фракция, содержащая эндотоксин, и экзотоксин, взятые в соотношении 1: 3 с общим содержанием белка 30 мг/мл 500,0 Формалин 5,0 Минеральное масло 487,0 Ланолин Остальное до 1 л
Полученную вакцину апробируют на 220 головах клинически здорового крупного скота массой 350-400 кг. Вакцину вводят в нижнюю треть шеи по 2 мл, а молодняку с 4 мес. возраста до года 1 мл. У привитых животных иммунитет проявляется через 14-21 день после однократной вакцинации и сохраняется до 6 мес. (срок наблюдения). Эффективность вакцины составляет 98%
П р и м е р 2. Для приготовления вакцины используют штамм возбудителя некробактериоза, выделенный от больных овец из местного очага. Вакцину получают аналогично примеру 1. Вакцину испытывают на 20 овцах, из которых 5 голов используют для титрации живой культуры бактерий. Титры антител у овец после вакцинации, динамика антителообразования у овец, однократно привитых формалинизированной масляно-эмульсионной вакциной и стойкость их к контрольному заражению живой культурой возбудителя через 5 месяцев приведены в таблице.

После однократной прививки новых случаев заболевания, проявляющего некрозом тканей челюстей и падежа овец не отмечено. Эффективность вакцины 98%
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать противонекробактериальную инактивированную формолэмульсионную вакцину, эффективность применения которой при однократном подкожном введении составляет 98% Способ прост в исполнении, не требует специального дорогостоящего оборудования и может быть использован в промышленных условиях.

Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, получение вакцины для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота и овец. Сущность изобретения: для изготовления вакцины используют эпизоотическую культуру возбудителя некробактериоза, выделенную из местного очага, выращивают, инактивируют и отделяют выращенную культуру от культуральной жидкости. Антигенные субстанции извлекают как из биомассы, так и из культуральной жидкости, используя щадящие методы обработки, способствующие сохранению активности антигенов при извлечении. Для извлечения антигена из микробных клеток отделенную биомассу ресуспендируют в дистиллированной воде до получения суспензии с концентрацией 150 250 млрд. кл/мл. Экстракцию антигена осуществляют из суспензии путем последовательного трехкратного замораживания оттаивания клеток и их гомогенизации. Гомогенат центрифугируют при 15 000 20 000 g и из супернатанта выделяют протективный антиген, представляющий собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин. Параллельно из культуральной жидкости выделяют экзотоксин путем осаждения его желатином в концентрации 0,03 0,06 мас. Антигены объединяют в соотношении 1 3, повторно добавляют формалин и соединяют с масляно- ланолиновым адъювантом в соотношении 1 1. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА РОГАТОГО СКОТА, включающий выращивание эпизоотической культуры возбудителя некробактериоза, выделенной из местного очага, разделение выращенной культуры на биомассу и культуральную жидкость, экстракцию антигена из биомассы и параллельно осаждение экзотоксина из культуральной жидкости, инактивацию антигенов формалином, объединение инактивированных антигенов с последующим добавлением адъюванта на основе минерального масла и ланолина и получением целевого продукта, отличающийся тем, что перед разделением проводят дополнительную инактивацию выращенной культуры 0,3 0,4%-ным раствором формалина, отделенную биомассу ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 150 250 млрд.кл/мл, экстракцию антигена осуществляют из полученной суспензии путем последовательного трехкратного замораживания-оттаивания клеток и гомогенизации, гомогенат центрифугируют при 15000 20000 g, из супернатанта выделяют антиген, представляющий собой цитоплазматическую фракцию, содержащую эндотоксин, осаждение экзотоксина проводят желатином в концентрации 0,03 - 0,06 мас. антигены объединяют в соотношении 1 3 соответственно и после добавления адъюванта получают целевой продукт со следующим содержанием компонентов, мл:
Цитоплазматическая фракция, содержащая эндотоксин и экзотоксин, взятые в соотношении 1 3, с общим содержанием белка 30 мг/мл 450,0 550
Формалин 3,5 5,0
Минеральное масло 391 487
Ланолин Остальное до 1 л