СРЕДСТВО, ПОТЕНЦИРУЮЩЕЕ ПРОТИВОТУРБЕРКУЛЕЗНОЕ ДЕЙСТВИЕ ИЗОНИАЗИДА Российский патент 1995 года по МПК A61K38/00 

Изобретение относится к медицине, точнее к средствам, потенцирующим действие туберкулостатических препаратов, и предназначено для усиления противотуберкулезного действия изониазида.

Благодаря широкому применению туберкулостатических препаратов, в частности изониазида, в лечении туберкулеза достигнуты большие успехи. Однако специфическая терапия имеет свои пределы и от 5 до 20% больных туберкулезом остаются неизлечимыми. Это особенно относится к больным с запущенными формами туберкулеза (фиброзно-кавернозным), когда в результате фиброзных изменений доступ туберкулостатических препаратов к очагу инфекции затруднен.

В связи с этим поиск средств, непосредственно усиливающих действие туберкулостатиков, в частности изониазида, для повышения эффективности терапии туберкулеза является актуальным.

Известно применение ДНК-тропных веществ различных классов химических соединений в качестве средств, потенцирующих туберкулостатическую активность противотуберкулезных препаратов. К ним относятся акридины, нитрофураны, актиномицин D, ДНК-аза и РГК-аза, фенотиазины, диаминодифенилсульфон.

Однако, перечисленные вещества в силу своей высокой токсичности не нашли широкого клинического применения. Это относится к актиномицину D, акридинам и производному нитрофуранового ряда фурадонину, который при длительном применении вызывал явления лекарственной непереносимости у больных. Из производных фенотиазинов в клинике туберкулеза применяли аминазин, который в последние годы не применяют вследствие большого количества противопоказаний (заболевания печени, почек, желудка, сердечно-сосудистой системы) и, в первую очередь, в связи с выраженным угнетением центральной нервной системы. Препараты ДНК-аза и РНК-аза также не нашли клинического применения, поскольку они оказывают потенцирующий эффект лишь в пробирочных опытах и в таких высоких концентрациях (5 50 мг/мл), которые недопустимо создавать в организме.

Известно также средство, потенцирующее действие изониазида при лечении экспериментального туберкулеза морских свинок и белых мышей. В качестве средства, усиливающего действие изониазида, применяли различные фракции основных ядерных белков, богатые как лизином, так и аргинином. Однако, несмотря на повышение терапевтического эффекта изониазида при совместном действии отдельных белковых фракций, введение их в организм животных сопровождалось побочными явлениями: в месте инъекции белка появлялось выраженное асептическое воспаление. Аргининбогатые фракции белков обладает выраженной пирогенной активностью, а лизинбогатая фракция белка обладает антигенными свойствами индуцирует выработку комплементсвязывающих антител в организме животного. Поэтому практическое применение отдельных фракций гистоновых белков для усиления действия изониазида, особенно при длительном их использовании для лечения туберкулеза не представляется возможным.

Кроме того, фракционирование белков является технологически трудоемкой и дорогостоящей операцией.

Целью изобретения является создание средства, потенцирующего действие туберкулостатического препарата изониазида и не обладающего побочными эффектами.

Эта цель достигается применением суммарного гистона в качестве средства, потенцирующего противотуберкулезное действие изониазида.

Суммарный гистон является известным основным компонентом хроматина ядер клеток эукариот. Состоит суммарный гистон из пяти индивидуальных белков, находящихся в препарате в эквимолярном соотношении. Получают его стандартным методом из ткани тимуса телят, имеющейся в достаточном количестве на мясокомбинатах. Суммарный гистон используют в молекулярной биологии в модельных экспериментах для изучения структуры хроматина.

Усиление суммарным гистоном потенцирующего действия изониазида наряду с уменьшением его токсических свойств, оцененных по тестам на пирогенную и иммуногенную активности, обусловлено, по-видимому, тем, что, во-первых, в растворах низкой ионной силы (физиологический раствор NaCl или 5 мМ фосфат Na) и в средах организма суммарный гистон существует в виде белкового комплекса таким образом, что области молекул, обогащенные основными аминокислотами, остаются свободными и обеспечивают высокую плотность положительного заряда всей молекулы, а антигенно- и пирогенноактивные области молекулы при этом маскируются. В силу этого, положительные эффекты суммарного гистона вероятно усиливаются, а отрицательные биологические эффекты суммарного гистона ослабляются. Во-вторых, сохранение в суммарных препаратах гистона положительных эффектов, присущих отдельным фракциям гистонов и снижение отрицательных эффектов должно быть обусловлено тем, что первые однотипны и присущи всем фракциям, а вторые различны у разных фракций и как бы "разводятся" в суммарном препарате. Это подтверждается данными о том, что при внутривенном введении в организм животного суммарный гистон практически не проявляет пирогенной и иммуногенной активности.

Изобретение проверено в лабораторных условиях путем ряда опытов на культуре микобактерий туберкулеза и на экспериментальном туберкулезе у кроликов.

Потенцирующий эффект суммарного гистона был предварительно установлен в пробирочных опытах, что подтверждается следующим примером.

П р и м е р 1. Влияние суммарного гистона на туберкулостатическую активность изониазида in vitro было проведено методом двухкратных серийных разведений в среде Ливенштейна. В качестве тест-штамма была использована культура микобактерий туберкулеза H37RV, чувствительная к туберкулостатическим препаратам. Плотность микробной суспензии составляла 50 млн. клеток на 1 мл. Концентрация суммарного гистона в среде составляла 50 мкг на 1 мл. Суммарный гистон в этой концентрации не оказывал ингибирующего влияния на рост микобактерий туберкулеза, т.е. не обладал при данных концентрациях самостоятельным бактериостатическим эффектом.

Проведенные опыты показали существенное усиление туберкулостатической активности изониазида под влиянием суммарного гистона. Минимальная задерживающая концентрация изониазида в контроле составляла 0,06 мкг на 1 мл. В сочетании с суммарным гистоном изониазид в концентрации 0,03 мкг на 1 мл полностью подавлял рост микобактерий туберкулеза, а в концентрации 0,015 мкг на 1 мл частично (при оценке роста колоний микобактерий туберкулеза по трехбалльной системе, рост в контроле на среде с изониазидом в концентрации 0,015 мкг на 1 мл + + +, в опыте +).

Таким образом, суммарный гистон в концентрации 50 мкг на 1 мл в 2 4 раза усиливает туберкулостатическую активность изониазида.

Потенцирующий эффект суммарного гистона устанавливали в опытах in vivo при совместном применении суммарного гистона и изониазида при лечении экспериментального туберкулеза у кроликов.

П р и м е р 2. Методика эксперимента.

У всех подопытных кроликов определяли способность к инактивации изониазида, и животные, являющиеся очень сильными или слабыми инактиваторами были исключены из опыта.

Все отобранные подопытные животные (62) были внутривенно заражены лабораторным штаммом микобактерий туберкулеза BoV 109 в дозе 0,1 мг на 1 кролика.

С дня заражения 24-м подопытным животным ежедневно в течение 40 дней вводили внутривенно суммарный гистон. Однократная доза вводимого гистона составляла 15 мг на 1 кг веса животного (0,2 LD₅₀). Одновременно подопытные животные получали изониазид в дозе 3 мг на 1 кг веса животного, что составляло 1/6 обычно применяемой в эксперименте терапевтической дозы химиопрепарата.

Две группы животных являлись контрольными. Одну в количестве 20 кроликов составляли зараженные животные, которым вводился только изониазид, другую 18 зараженных кроликов оставляли без лечения.

Через две недели после начала лечения у животных определяли фагоцитарную активность лейкоцитов. Фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов изучали в отношении убитой культуры золотистого стафилококка с концентрацией взвеси 1,5 мл микробных тел в 1 мл после 30 мин экспозиции в термостате при 37^оС. При этом оценивали показатели фагоцитарной активности лейкоцитов (% фагоцитирующих нейтрофилов из общего числа подсчитанных) и фагоцитарный индекс (общее количество микробов, поглощенных одним фагоцитом).

Через 1 мес после заражения животных произвели количественную оценку интенсивности кожной туберкулиновой аллергии. Кроликам в кожу боковой поверхности грудной клетки вводили 0,1 мл туберкулина PPDL (1:10). Через 48 ч после введения туберкулина определяли интенсивность реакции по наибольшему диаметру папулы.

По окончании эксперимента, на 40-й день после заражения, все животные были убиты. Эффективность лечения оценивали по данным морфологического и бактериологического исследований внутренних органов. Легкие, селезенку, печень и почки исследовали гистологически.

Результаты эксперимента.

Применение суммарного гистона совместно с изониазидом показало снижение кожной туберкулиновой аллергии у подопытных кроликов по сравнению с данными показателями у животных, лечение одним изониазидом. Только у 4-х из 24-х кроликов подопытной группы внутрикожная туберкулиновая реакция оказалась положительной, а средний диаметр папулы составил у них 15,2 мм, тогда как у животных, получавших один изониазид, положительная реакция была обнаружена у 17 из 20 животных, а средний диаметр папулы составлял 20,5 мм.

У кроликов, леченых изониазидом в сочетании с суммарным гистоном, было отмечено повышение фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов. Фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс у животных указанной группы составляли соответственно 32,1 ± 3,4 и 9,3 ± 0,8, а у контрольных животных, леченых одним изониазидом 25,4 ± 2,5 и 5,6 ± 0,6 при статистически достоверном Р < 0,01.

Таким образом, применение суммарного гистона в комбинации с изониазидом стимулировало неспецифические факторы иммунологической защиты организма животных.

Результаты опытов показали также значительное различие в развитии экспериментального туберкулеза у подопытных и контрольных животных. В табл. 1 представлена характеристика морфологических изменений в легких у кроликов опытной и контрольных групп.

Из табл. 1 видно, что в легких у большинства подопытных кроликов, получавших комбинированное лечение, специфические морфологические изменения не были обнаружены, а в ряде случаев определялись лишь единичные субмилиарные и милиарные эпотелиоидноклеточные бугорки. В то же время у контрольных кроликов при применении одного изониазида в легких наблюдались, как правило, множественные туберкулезные бугорки.

Были отмечены и качественные различия в характере морфологических изменений в легких у подопытных животных по сравнению с контрольными: у контрольных животных в 6 случаях из 20 при гистологическом исследовании в эпителиоидноклеточных гранулемах были выявлены очаги творожистого некроза. У животных подопытной группы таких изменений не было обнаружено.

У животных всех групп туберкулезная диссеминация локализовалась преимущественно в легких. Однако у 8 из 20 контрольных кроликов, леченых одним изониазидом, субмилиарные и милиарные бугорки были обнаружены также и в почках. Ни у одного подопытного кролика, получавшего лечение изониазидом совместно с суммарным гистоном, не было выявлено очагов внелегочной туберкулезной диссеминации. Таким образом, как по данным вскрытия, так и при гистологическом исследовании морфологические изменения во внутренних органах у животных, получавших изониазид совместно с суммарным гистоном, были значительно менее выражены, чем у леченых одним изониазидом.

Далее, у кроликов опытной группы наблюдалась выраженная задержка размножения микобактерий туберкулеза в органах. Индекс высеваемости микобактерий (по интенсивности роста колоний в пробирках) из органов подопытных животных был значительно меньше, чем у контрольных кроликов, леченых одним изониазидом. Данные представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что индекс высеваемости микобактерий туберкулеза из легких почти в 8 раз ниже у кроликов, леченых изониазидом совместно с суммарным гистоном, чем у кроликов, леченых одним изониазидом, в полтора раза меньше из селезенки и печени, и совсем не наблюдалось высеваемости микобактерий из почек.

При оценке токсичности суммарного гистона по тесту на пирогенную активность при внутривенном введении кроликам было выявлено незначительное проявление пирогенности, заключающееся в кратковременной монофазной лихорадочной реакции с повышением температуры через 1 ч после введения суммарного гистона и оканчивающейся к 1,5 ч после введения, что иллюстрируется данными табл. 3.

Оценка токсичности суммарного гистона по тесту на иммуногенную активность при длительном (в течение 6 недель) внутривенном введении кроликам проводилась на основе сравнения титров сывороток крови группы животных, иммунизированных суммарным гистоном в смеси с полным адъювантом Фрейнда (1:1), и группы животных, иммунизированных суммарным гистоном. Титры сывороток оценивали в РСК (реакция связывания комплемента) при использовании в качестве антигена препарата суммарного гистона.

Анализ сывороток группы животных, иммунизированных с применением полного адъюванта Фрейнда (сыворотки получали через 10 дней после последней инъекции) показал, что значения титров колебались в пределах 1:20 1:32. При анализе сывороток крови группы животных, которым вводили суммарный гистон внутривенно, установлено, что антитела в сыворотках крови кроликов выявлялись, начиная с 50-го дня от начала иммунизации. Значения титров сывороток, полученных на 50, 64 и 75-й дни от начала иммунизации, составляли соответственно 1:64, 1:64 и 1:32.

Сравнение значений титров антител в сыворотках крови обеих групп животных не выявило резких различий в отношении продукции антител. Отсутствие более сильного гуморального иммунного ответа после иммунизации с адъювантом Фрейнда подтверждает низкую иммунологическую активность суммарного гистона.

Таким образом, проведенные опыты показали, что применение суммарного гистона в сочетании с изониазидом при лечении экспериментального туберкулеза существенно усиливало туберкулостатическую активность изониазида, не вызывая пирогенной реакции и выработки антител. Применение суммаpного гистона совместно с изониазидом усиливает неспецифическую иммунологическую реактивность организма, в частности стимулирует фагоцитоз, а также обладает антиаллергическим эффектом по сравнению с одним изониазидом.

При этом технология получения суммарного гистона существенно проще и примерно в 10 раз дешевле, чем получение индивидуальных фракций белков, что имеет большое значение для применения его в практической медицине.

Проведенные исследования на животных позволяют судить о возможности клинического применения суммарного гистона при лечении туберкулеза совместно с изониазидом.

Изобретение может быть использовано для усиления противотуберкулезного действия изониазида. В качестве потенцирующего противотуберкулезное действие изониазида предлагается применение суммарного гистона. При лечении экспериментального туберкулеза применение суммарного гистона в сочетании с изониазидом не вызывало пирогенной реакции и выработки антител, при этом существенно усиливало туберкулостатическую активность изониазида. 3 табл.

Применение суммарного гистона в качестве средства, потенцирующего противотуберкулезное действие изониазида.