СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В Российский патент 1995 года по МПК G01N33/53 A61K39/29 

Изобретение относится к способу получения поверхностного антигена гепатита В путем микробиологического синтеза, который может быть использован в медицинской промышленности для изготовления вакцины против гепатита В.

Известны вакцины против гепатита В на основе НBs-антигена из сыворотки доноров [1] Однако такие вакцины небезопасны для человека, так как могут содержать инфекционные частицы гепатита В и могут быть контаминированы другими вирусами, например, ретровирусами, содержащимися в сыворотке.

Способ получения вакцин из сывороток является многостадийным, содержит 2-3 стадии инактивации, а выход поверхностного антигена не превышает 10%
Известен способ получения HBs-антигена из штамма-продуцента дрожжей, заключающийся в культивировании штамма-продуцента в среде с богатым содержанием фосфора, в переносе клеток в среду с низким содержанием фосфора для репродукции HBs-антигена с последующим отмыванием клеток на центрифуге с проточным ротором. Далее клеточную пасту, освобожденную от среды, разводят до исходного объема фосфатным буфером и разрушают клетки с помощью гомогенизатора высокого давления. Конечный продукт получают с выходом 29% и с содержанием примесного белка до 20% что делает его применение в качестве вакцины невозможным [2]
Наиболее близким к заявленному по совокупности признаков является способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В, включающий культивирование штамма-продуцента дрожжей в среде, сбалансированной по свободным аминокислотам в концентрации 20-160 г/л, и при температуре 25^оС. Среда содержит также глюкозу в концентрации 6 г/л, соли и витамины. При культивировании подается дополнительно среда с концентрацией глюкозы 400 г/л. Выход биомассы составляет 177 г при расходе глюкозы 1630 г. [3]
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода поверхностного антигена гепатита В.

Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В включает в себя культивирование и инкубацию штамма-продуцента дрожжей на питательной среде с последующим разрушением клеток дрожжей и выделением целевого продукта HBsAg отличием которого является то, что культивирование проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора 40-200 мг/л, а инкубацию проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора 5-50 мг/л. При этом в инкубационную среду постоянно добавляют пептон, глюкозу и дрожжевой экстракт в весовом соотношении 0,05-0,15:1:0,05-0,15 соответственно.

Использование на стадии культивирования дрожжей и биосинтеза антигена питательной среды, лимитированной по неорганическому фосфору позволяет получать оптимальный выход антигена независимо от вида сырья.

Дополнительная подача на стадии синтеза антигена питательной среды, содержащей пептон, глюкозу и дрожжевой экстракт в весомом соотношении 0,05-0,15: 1: 0,05-0,15 соответственно, приводит к повышению накопления биомассы дрожжей с одновременным повышением выхода антигена.

Использование питательной среды как на стадии выращивания биомассы, так и на стадии биосинтеза антигена, с содержанием неорганического фосфора в количестве, выходящем за пределы оптимальных значений предлагаемого способа, не приводит к получению антигена с хорошим выходом.

При культивировании используют штамм дрожжей, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном HBsAg и способную продуцировать иммуногенный HBsAg. В качестве такого исходного штамма может быть использован любой штамм дрожжей продуцент HBsAg, например, штамм Saccharomyces cerevisiae DBY 746/pNMVG-46, полученный включением трансформированной плазмиды рNMVG-46 в реципиентный штамм DBY 746. Плазмида pNMVG-46 получена путем генноинженерной модификации из известной плазмиды рADG47 (Мол. генетика, микробиология и вирусология, 1986, N 8, 12-19).

П р и м е р 1. В биореактор с рабочим объемом 10 л, содержащим 9 л стерильной среды состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 40-45 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей S.с. DBY 746/pNMVG-46 в количестве 1,0 л, выращенную на минимальной среде (см. состав 1) и имеющую титр клеток 4,2 ˙ 10⁷ в см³ культуральной жидкости. Культивирование ведут при температуре 29 + 1^оС в течение 20 ч. Получают накопительную культуру с титром клеток 2,0 ˙ 10⁸ кл/см³ культуральной жидкости.

Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор с рабочим объемом 100 л, содержащий 70 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 1,5, экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 0,1; глюкоза 1,0; соли, микроэлементы, витамины (состав 2), содержащей фосфора неорганического 5,0-6,0 мг/л при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 40 ч. В процессе культивирования дополнительно подают, начиная с 6 ч культивирования, 20 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 5,0; глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 4,2 (или в соотношении 0,12:1:0,1 соответственно), соли, микроэлементы, витамины (состав 3).

Культуральную жидкость с содержанием клеток 6,7 ˙ 10⁸ кл/см³ подают на проточную центрифугу типа Westfalia со скоростью протока 500 л/ч. Клеточную пасту освобождают от среды промыванием 0,05 М карбонатным буфером с рН 9,0 методом микрофильтрации с использованием мембранных фильтров с диаметром пор 0,2-0,45 мкм либо трехкратной отмывкой в буфере того же состава с последующим отделением биомассы на проточной центрифуге типа Westfalia при скорости протока 500 л/ч. Получают 5,0 кг биомассы, которую суспендируют в 50 л карбонатного буфера состава: 0,05 М Na₂CO₃ NaHCO₃, 0,15 M NaCl, 10 mM ЭДТA, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,3% Twenn-20. Разрушают с помощью гомогенизатора типа Gaulin APV при давлении 600-700 атм в 3 цикла. Гомогенизат осветляют с помощью проточной центрифуга типа Westfalia при скорости протока жидкости 60 л/ч. Получают 70 л осветленного гомогенизата, в котором определяют содержание антигена. Титр антигена составляет 28 мкг/мл. Выход антигена 19,5 мг с одного литра культуральной жидкости. Содержание HBsAg определяют методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Abbott Auszyme II. Антигенную активность измеряют в мкг/мл, используя в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности НBsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемый ГИСК им. Л.А.Тарасевича. На электрофореграммах в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях рекомбинантный антиген представлен в виде полосы мономера 24 kD. Иммуноспецифичность этой полосы показана методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих анти-НBs, меченных йодом-125.

П р и м е р 2. В биореактор с 9 л стерильной питательной среды состава (мас. ): пентон с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5,0 мг/г 2,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 1,0; глюкоза 2,0 содержащей фосфора неорганического 195-200 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л, выращенную на минимальной среде (состав 1) и имеющую титр 4,4 ˙ 10⁷ кл/см³ культуральной жидкости. Культивирование ведут при 29+1^оС в течение 24 ч. Получают накопительную культуру с титром 2,8 ˙ 10⁸ кл/см³ культуральной жидкости.

Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор, содержащий 70 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5,0 мг/г 1,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 0,1; глюкоза 1,0; моли, микроэлементы, витамины (состав 2), содержащей фосфора неорганического 50 мг/г, при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 48 ч. В процессе культивирования дополнительно подают, начиная с 10 ч роста, 18 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5 мг/г 5,0, глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 4,2 (или в соотношении 0,12: 1: 0,1 соответственно); соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Культуральную жидкость, содержащую 8,8 ˙ 10⁸ кл/см³ подвергают обработке аналогично описанному в примере 1.

Вес сырой биомассы составляет 6,2 кг, а количество осветленного гомогенизата 70 л, который содержит 32 мкг/мл антигена. Выход антигена 22,5 мг с одного литра культуральной жидкости.

П р и м е р 3. Процесс ведут аналогично примеру 2; на стадии выращивания биомассы используют питательную среду с содержанием неорганического фосфора 300 мг/л. Среду готовят из 2 мас. пептона с содержанием неорганического фосфора 8 мг/г и 1,0 мас. экстракта дрожжевого с исходным содержанием неорганического фосфора 15,0 мг/г. На стадии биосинтеза антигена используют питательную среду с содержанием неорганического фосфора 100 мг/л, составленную из 1,0 мас. пептона и 0,1 мас. экстракта дрожжевого с вышеуказанным содержанием неорганического фосфора. Питательную среду для дополнительной подачи готовят из вышеуказанных пептона и экстракта дрожжевого, взятых в соотношении пептон-глюкоза-экстракт дрожжевой, равном 0,20:1:0,20. Получают 8,0 кг сырой биомассы. Биосинтез антигена отсутствует.

П р и м е р 4. В биореактор с 9 л стерильной питательной среды состава (мас.) пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 105-110 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л, выращенную на минимальной среде (состав 1) и имеющую титр 4,3 ˙ 10⁷ кл/см³ культуральной жидкости. Культивирование ведут при 29+1^оС в течение 20 ч. Получают накопительную культуру с титром 2,3 ˙ 10⁸ кл/см³ культуральной жидкости.

Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор, содержащий 70 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 1,5; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 0,1; глюкоза 1,0; соли, микроэлементы, витамины (состав 2), содержащей фосфора неорганического 10 мг/л, при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при 30^оС в течение 44 ч. В процессе культивирования дополнительно подают, начиная с 8 ч роста, 20 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 5,0; глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 4,2; соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Соотношение пептон-глюкоза-экстракт дрожжевой составляет 0,12:1: 0,10. Получают культуральную жидкость, содержащую 7.8 ˙ 10⁸ кл/см³. Отделение биомассы, освобождение биомассы от остатков питательной среды, разрушение клеток и осветление гомогенизата осуществляют аналогично описанному в примере 1. Получают 5,8 кг сырой биомассы и 70 л осветленного гомогенизата с содержанием антигена 30 мкг/мл. Выход антигена составляет 21,0 мг с одного литра культуральной жидкости.

П р и м е р 5. Выращивание накопительной культуры, биосинтез антигена проводят в условиях, аналогичных описанным в примере 1. На стадии биосинтеза в ферментер дополнительно подают, начиная с 6 ч роста, 22 л стерильной питательной среды, состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 2,1; глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 5,0-5,3 2,1 (или в отношении 0,05:1:0,05 соответственно); соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Культуральную жидкость с содержанием клеток 6,3 ˙ 10⁸ кл/см³ подают на центрифугу. Процедура отделения биомассы, промывки биомассы, разрушения клеток и осветления полученного гомогенизата аналогична примеру 1. Получают 4,7 кг сырой биомассы; количество осветленного гомогенизата с титром антигена 25 мкг/мл 70 л. Выход антигена составляет 17,5 мг с одного литра культуральной жидкости.

П р и м е р 6. Отличается от примера 1 тем, что на стадии синтеза антигена в биореактор дополнительно подают, начиная с 6 ч роста, 20 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 6,90; глюкоза 46,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 6,90 (или соотношении 0,15: 1: 0,15 соответственно); соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Получают культуральную жидкость с титром клеток 8,0 ˙ 10⁸ кл/см³, которую подвергают обработке аналогично описанному в примере 1.

Вес сырой биомассы составляет 5,9 кг, количество осветленного гомогенизата 70 л. Титр антигена в осветленном гомогенизате 35 мкг/мл. Выход антигена 24,5 мг с одного литра культуральной жидкости.

Таким образом, предложенный способ позволяет в 80 раз повысить выход рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и использовать сырье различного вида (пептон и экстракт дрожжевой как отечественные, так и различных фирм).

Состав 1, мас. KH₂PO₄ 0,100 NaCl 0,010 CaCl₂ безводный 0,020 MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,102 (NH₄)₂SO₄ 0,500 глюкоза 2,000 р-р микроэлементов 0,50 мл/л р-р витаминов 1,00 мл/л Дистил. вода До 100,0 Раствор микроэлементов, мг% KJ 20,0 H₃BO₃ 2,0 MnSO₄ 2,0 MoO₄(NH₄)₂ 2,0 FeSO₄ 10,0 Дистил. вода До 100 мл Раствор витаминов, мг% Тиамин хлорид 20,00 Пиридоксин 20,00 Рибофлавин (моно- нуклеотид) 20,00 Пантотенат кальция 20,00 Никотиновая кислота 20,00 п-Аминобензойная кислота 20,00 Биотин 0,20 Инозитол 1000,0 Дистил. вода До 100 мл Состав 2, мас. KCl 0,100 NaCl 0,010 CaCl₂ безводный 0,020 MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,102 (NH₄)₂SO₄ 0,500 р-р микроэлементов 0,50 мл/л
(см. состав 1) р-р витаминов 1,00 мл/л
(см. состав 1) Состав 3, мас. KCl 0,350 NaCl 0,035 CaCl₂ безводный 0,070 MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,350 р-р микроэлементов 1,75 мл/л
(см. состав 1) р-р витаминов 3,50 мл/л
(см. состав 1)

Использование: в области биотехнологии, в частности для получения поверхностного антигена гепатита В. Сущность изобретения: рекомбинантный поверхностный антиген гепатита В получают путем культивирования штамма-продуцента дрожжей на питательной среде, включающей в состав пептон и дрожжевой экстракт и содержащей 40-200 мг/л неорганического фосфора, с последующей инкубацией антигена на питательной среде, содержащей 5-50 мг/л неорганического фосфора, с дополнительной подачей среды, содержащей пептон, глюкозу и дрожжевой экстракт в весовом соотношении 0,05-0,15:1:0,05-0,15 соответственно.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В, включающий культивирование и инкубацию штамма продуцента дрожжей на питательной среде с последующим разрушением клеток дрожжей и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование проводят в питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора в питательной среде 40-200 мг/л, а инкубацию проводят в питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора в питательной среде 5-50 мг/л, при этом в инкубационную среду постоянно добавляют пептон, глюкозу и дрожжевой экстракт в массовом соотношении 0,05-0,15:1:0,05-0,15 соответственно.