Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита B /HBsAg/ при производстве препаратов для диагностики и профилактики гепатита B.
Известные штаммы дрожжей S. cerevisiae, используемые для получения HBsAg: YNN 27/p2 μ-S11 (J. -H. Hsieh, K.-Y. Shih. H.-F. Kung e.t. Biotech/Bioeng., V. 32, pp. 334-340, 1988): ДВУ 746/pSGL2 (С.3. Чеперегин, И.П. Арман, Н.Н. Грановский. Оптимизация экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита B в дрожжах. Мол. генетика, микробиология, вирусология, 1990, 5, с. 17-20); GRF-18/pJ ДВ (О.Ф. Крупнова, Н.И. Сизова, А.Р. Смоляницкий. Повышение выхода рекомбинантных белков в дрожжах S. cerevisiae в результате оптимизации условий их культивирования. Прикл. биохимия и микробиология, 1995, т. 31, 1, N 3, с. 311-315) не могут быть использованы при промышленном культивировании в связи с низким уровнем продукции.
Прототипный штамм ЛД-5 /Воропаева Л.А., 1992, Автореферат на дис. на соиск. степени канд. биол. наук/ используют для синтеза рекомбинантного дрожжевого HBsAg вируса гепатита B. Штамм получен в результате скрещивания гаплоидных штаммов с последующей трансформацией плазмидой pCGA7, в составе которой ген HBsAg клонирован под промотором PH05. Стандартная схема культивирования дрожжевых рекомбинантных штаммов с регуляцией экспрессии клонированного гена HBsAg со стороны системы гена PH05 (кислой фосфатазы дрожжей) включает две стадии. Вначале в среде с высоким содержанием фосфора - 1 г/л - происходит только прирост биомассы, а экспрессия гена - мишени отсутствует вследствие репрессии PH05 промотора. На второй стадии культивирования после переноса клеточной массы в среду с низким содержанием неорганического фосфора - 0,03 г/л - происходит собственно синтез антигена. Стадия синтеза у прототипа имеет протяженность 26-28 часов, через 12-14 часов роста количество антигена составляет в титрах РНГА (реакции непрямой гемагглютинации) 1/1024 - 1/2048.
Недостатком прототипа является большая длительность стадии синтеза антигена, что в целом делает процесс культивирования трудоемким.
Целью изобретения является сокращение времени синтеза у штамма-продуцента при сохранении двухстадийной схемы культивирования.
Для обеспечения указанной цеди предлагается штамм, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВНИИ Генетика промышленных микроорганизмов) под номером Y-1678.
Штамм имеет следующие характеристики:
Родословная штамма: получен при скрещивании штаммов YF-135 и 5Д-П3016; клетки являются диплоидными, гетерозиготами по типу спаривания, гомозиготами по мутации leu 2-3, 2-112, потребность в лейцине компенсируется маркерным геном Leu2 на плазмиде pCGA7, которой трансформированы клетки штамма.
Культурально-морфологические особенности штамма: клетки шаровидные, на плотной поверхности агара формируют округлые колонии диаметром 1-5 мм, с ровным краем, белого цвета. Консистенция колоний пастообразная. При росте в жидкой среде образуют осадок на дне, поверхностный слой слегка мутный.
Способ и условия хранения штамма (Банк Рабочих Клеток Изготовителя). Клетки хранят в замороженном состоянии при -70oC и -193oC в жидком азоте, состав среды: 1 УАРД/1 глицерин; концентрация клеток 109 кл/мл.
Контаминация. Культура клеток штамма стерильна, и при посевах на различные типы сред не выявлены заражения бактериями и грибами.
Пример. Гаплоидные родительские штаммы дрожжей S. cerevisiae YF-135 и 5Д-П3016 перекрестными штрихами засевают в чашку Петри на органическую среду УЕРД (по 2% глюкозы, пептона, агар-агара, 0,2% дрожжевого экстракта) и инкубируют в течение 18 ч, после чего переносят на селективную для диплоидов среду YB ("Difco") и инкубируют при тех же условиях и экспозиции. Полученные диплоиды трансформируют вектором pCGA7, в составе которого клонирован ген HBsAg под промотором PH05, экспрессия которого происходит только в среде с низким содержанием неорганического фосфора (0,03 кг/л). Трансформацию клеток проводят обработкой диплоидных клеток 0,2 М водного раствора хлористого лития при 30oC в течение 2 ч с последующим добавлением 70% полиэтиленгликоля -4000 и 40 мкг ДНК вектора. Смесь инкубируют при 30oC в течение 1 ч, после чего высевают на среду YNB в чашках Петри. Появление колоний наблюдают через 7-9 дней.
Отдельные колонии трансформантов контролируют на активность β-лактомазы (Chevallier M.R., Aigle M., FEB Lett., 1979, v. 108, p. 179-180). Для этого их переносят на индикаторную питательную среду, содержащую, мас.%: глюкоза - 0,1, крахмал - 0,2, питательная основа YB - 0,67, агар - 2,0, 0,1 М фосфатный буфер pH 7,0 - остальное. Через 18 ч инкубирования при 30oC образовавшиеся колонии заливают растопленной при 42oC той же средой, дополнительно содержащей по 0,3 мас.% ампициллина и иода и 1,5 мас.% йодистого калия и повторно инкубируют при 30oC. Фиксируют время начала просветления индикаторной среды под действием β-лактамазы. Отбирают клон, в котором просветление среды под действием β-лактамазы наблюдается уже через 1 ч инкубирования (против 3-9 ч у остальных клонов) и анализируют его на продолжительность стадии синтеза антигена.
Для получения клеточной массы штамма-продуцента HBsAg, экспрессирующей антиген, используют двустадийную схему культивирования. На первом этапе происходит оживление клеток и накопление биомассы. Клетки из замороженного состояния оттаивают в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего их засевают в среду Hpi с высоким содержанием неорганического фосфора - 1 г/л, а также в г/л: MgSO4 - 0,5, KCl - 1,0, NaCl -0,1, CaCl2 - 0,1, L-аспарагин - 2,0, Д-глюкоза - 20 г, β-аланин 5•10-4; биотин, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотиновая кислота, пантотенат кальция, парааминобензойная кислота - по 2•10-4, дистиллированная вода - остальное. Начальная концентрация клеток составляет 1-5•10-6 кл/мл и выращивание происходит в течение 18-20 часов при температуре 30oC в водяном шейкере "Elpan". После концентрирования клеток путем центрифугирования и однократной отмывки физиологическим раствором суспензию засевают в среду с Lpi, в которой по сравнению с Hpi снижена концентрация неорганического фосфора до 0,03 г/л, и в которой происходит синтез антигена в клетках вследствие дерепрессии PH05 промотора. Исходное количество клеток составляет 2-5•10-6 кл/мл. Каждые 2 часа роста отбирают аликвоты клеток для подсчета их концентрации и определения активности антигена. Как видно из таблицы, штамм Y-1678 не имеет скрытой фазы роста, и клетки начинают делиться непосредственно после засева, при этом время удвоения составляет 1,5 часа, и удельная скорость роста имеет значение μ = 0,48 ч. Выход на стационарную фазу роста происходит уже через 8-10 часов при максимальном урожае клеток 2,4•10-8 кл/мл. Прототипный штамм имеет скрытую фазу роста около 4-х часов, удвоение количества клеток происходит через 2 часа при μ = 0,14 ч. К 8-10 часам роста количество клеток составляет 1,7•107 кл/мл. Существует также большое отличие между штаммами в динамике синтеза антигена. Так, штамм 1678 к 10 часам роста в РНГА активность синтезируемого антигена на уровне 1/6144-1/8192, тогда как прототип только 1/512-1/1024. Экспрессия гена HBsAg в клетках Y-1678 начинается практически сразу после засева, и заметные количества белка определяются в культуре уже после 4-6 часов роста - 1/128 -1/512 в титрах РНГА. Прототип синтезирует антиген гораздо медленнее, и к 8 часам роста его количество составляет всего 1/64. К 14-16 часам культивирования количество антигена в популяции Y-1678 имеет максимальные показатели - 1/16384 - 1/32768, тогда как время ферментации для прототипа составляет 26-28 часов. Быстрый рост количества Y-1678 в среде Lpi, сопровождаемый интенсивным синтезом антигена, позволяет сократить время синтеза HBsAg и, следовательно, всего цикла культивирования в среднем на 10 часов, что снижает материалоемкость (среды и оборудования), трудоемкость и энергоемкость.
Изобретение предназначено для производства препаратов для диагностики и профилактики гепатита В. Штамм получен при скрещивании штаммов YF-135 и 5D-П3016. Для получения клеточной массы штамма-продуцента HBsAg используют двустадийную схему культивирования. На первом этапе происходит оживление клеток и накопление биомассы. Штамм Y-1678 не имеет скрытой фазы роста. Клетки начинают делиться непосредственно после засева. При этом время удвоения составляет 1,5 ч и удельная скорость роста имеет значение μ = 0,48 ч. Выход на стационарную фазу роста происходит уже через 8 - 10 ч при максимальном урожае клеток 2,4•10-8 кл/мл. В процессе культивирования известных штаммов значительное время занимает стадия синтеза HBsAg. Использование предлагаемого штамма позволяет за счет увеличения количества клеток и более интенсивного синтеза HBsAg сократить время культивирования в среднем на 10 ч, что в целом снижает трудоемкость, материалоемкость и энергоемкость процесса культивирования. 1 табл.
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y 1678, продуцент поверхностного антигена вируса гепатита B.
