РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PDES20, КОДИРУЮЩАЯ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBSAG/AYW), ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК PDES20 - ПРОДУЦЕНТ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBSAG/AYW) Российский патент 1997 года по МПК C12N15/51 C12N1/19 A61K39/29 

Изобретения относятся к биотехнологии и, в частности, генной инженерии, а также медицине и могут быть использованы для производства рекомбинантного НВsAg/ayw культивированием трансформированных клеток дрожжей и получения на его основе вакцины против гепатита В.

В настоящее время известно достаточно много вакцин против гепатита В на основе рекомбинантных поверхностных антигенных детерминант этого вируса (US 5098704; Fr 2635532; Fr 2606281).

При этом наиболее безопасные и эффективные медицинские иммунобиологические препараты, содержащие антиген вируса гепатита В, получены культивированием трансформированных клеток S.cerevisiae. Как правило, в них используют плазмиды с природными участками генома вируса гепатита В (серотипы adr и adw), кодирующими его поверхностную антигенную детерминанту, экспрессируемыми под контролем сильных конструктивных промоторов дрожжевых генов (ЕР 0533492б, US 5133961). Подобные конструкции хотя и обеспечивают получение высокого уровня экспрессии целевого продукта, обладают рядом существенных для промышленных продуцентов недостатков: не позволяют эффективно контролировать экспрессию целевого белка, недостаточно стабильны при наращивании больших количеств биомассы, часто вынуждают использовать для роста клеток реципиентов сложные и дорогостоящие питательные среды.

Этих недостатков практически лишены векторные ДНК, в которых для экспрессии гетерологичного белка используют регулируемые дрожжевые промоторы и, в частности, промотор гена кислой фосфатазы (РН05).

Наиболее близкими техническими решениями к настоящим изобретениям из указанных стабильных микробиологических систем для наработки рекомбинантных поверхностных антигенных детерминант вируса гепатита В на основе S.cerevisiae являются рекомбинантная плазмидная ДНК р АН 203 с участком генома вируса гепатита В природной структуры под контролем РН05-промотора и трансформированный ею штамм-продуцент S.cerevisiae АН 22/р АН 203 (US 4778761).

Однако плазмида р АН 203 не обеспечивает высокий уровень экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита В, а трансформированный ею штамм-продуцент недостаточно эффективен.

Известна рекомбинантная дрожжевая вакцина против гепатита В, содержащая поверхностный антиген вируса гепатита В, адъювант, консервант и физиологически приемлемый разбавитель (WO 93/12815). Однако указанная вакцина недостаточно иммуногенна.

Заявляемые рекомбинантная плазмидная ДНК p DES 20 и штамм ДАН-041/рDES 20 являются новыми и в литературе не описаны.

В основу изобретений положена задача создания эффективного микробиологического дрожжевого продуцента, обеспечивающего повышение выхода рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа ayw (HBsAg/ayw), и получения на его основе высокоиммуногенной, нетоксичной, не обладающей побочными эффектами вакцины.

Задача решена тем, что заявляемая рекомбинантная плазмидная ДНК, согласно изобретению, содержит следующие существенные для ее функционирования структурные элементы:
бактериальный ориджин репликации СоlEl [необходим для работы в E.coli] NN н.п.4211-4841
бактериальный оперон bla, экспрессирующий E.coli функционально активный белок β -лактамазу (необходим для отбора целевых клонов при конструировании рDES20) NN н.п. 1253-2303
фрагмент природной дрожжевой 2 m -плазмиды, содержащий все необходимые нуклеотидные последовательности для обеспечения в S.cerevisiae ее эффективной автономной репликации и размножения до уровня 50-200 копий на клетку NN н.п. 2311-4203
дрожжевой оперон leu2, экспрессия которого в штамме S.cerevisiae ДАН-041/рDES20 придает ему способность расти на селективной среде без лейцина (необходим как селективный маркер при трансформации штамма S.cerevisiae YPH501) NN н.п. 4848-7062
искусственный дрожжевой оперон НВsAg/ayw (обеспечивает эффективную контролируемую уровнем свободного экзогенного фосфата экспрессию целевого полипептида НВsAg/ayw), включающий: минимальный фрагмент 5' нетранслируемой области дрожжевого оперона рh05, обеспечивающий контролируемую инициацию транскрипции NN н.п. 7-313 минимальный фрагмент 3' нетранслируемый области дрожжевого оперона рh05, обеспечивающий эффективную терминацию транскрипции и процессинг мРНК NN н.п. 1058-1237 модифицированный синтетический участок, кодирующий лидерную нетранслируемую область мРНК секретируемой кислой фосфатазы (ген РН05): AAAAAAAACAACAACAAATAGA- GCAAGCAAATTCGAGATTACCA NN н.п. 314-357 синтетичекий ген полипептида НВsAg/ayw NN н.п. 358-1035
ATGGAAACATTACTTCTGCTTTCCTAGGTCCATTGTTGGTTTTGCAAGCTGGTTTTTTC CTGCTGACTAGAATTTTGACTATTCCACAAAGTCTAGACTCTTGGTGGACTTCTTTGAAT TTTTTGGGTGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATAGATGGATGTGTTTGAGAAGATTT ATTATTTTCTTGTTCATTTTGTTGTTGTGTTTGATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTAT СAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCTTCAACTACTTCTACTGGTCCA TGTAGAACTTGTATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACC AAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAA Заявляемая плазмида р DES 20 включает искусственный дрожжевой оперон НВsAg/ayw с синтетическим геном полипептида НВsAg/ayw, первичная структура которого составлена с учетом кодонов, наиболее часто используемых в интенсивно экспрессируемых генах S. cerevisiae (T. Maryama, T.Gojobort,S-I.Aota, T.Ikemura. Nucl. Acids Res. 1986. V.14, Suppl. P.151-197), и модифицированным синтетическим участком, кодирующим лидерную нетранслируемую область m РНК секретируемой кислой фосфатазы (ген РН05), обусловливающими повышение выхода рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В культивированием заявляемого штамма ДАН-041/рDES 20 по сравнению с известным.

Заявляемый штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В получен трансформацией клеток дрожжевого штамма S.cerevisiae YPH501 (Stratagen).

Клетки заявляемого штамма ДАН-041/рDES 20 слегка овальной формы размером около 12 мкм. Деление клеток происходит в форме почкования, максимальный титр культуры в жидкой полноценной среде достигает 3,5х10 кл/мл. На твердой среде клетки штамма ДАН-041/рDES20 образуют характерные для сахаромицетов гладкие с ровными краями колонии светло-серо-коричневого цвета. На некоторых специальных средах клетки S.cerevisiae ДАН-041/рDES20 претерпевают мейоз и превращаются в аск с четырьмя спорами в общей оболочке. Эффективность споруляции высокая.

Плазмида pDES20 не претерпевает структурных перестроек в S.cerevisiae. Клетки штамма ДАН-041/рDES20 практически всегда содержат большое (50-200) число копий плазмиды pDES20. Это обеспечивает ее исключительную стабильность в условиях митотического деления, что весьма важно при промышленном культивировании этого микроорганизма.

В контрольных экспериментах на богатой неселективной среде не удавалось выявить заметную фракцию клеток S.cerevisiae, утративших плазмиду рDES20 [неспособных расти на селективной (leu) среде] даже через 120-150 циклов деления.

Дрожжи S. cerevisiae штамма ДАН-041/рDES20 растут в пределах широкого диапазона температур и рН. Оптимальные условия роста: 30^oС, рН 5,8-6,0. В качестве источника углерода могут использовать различные моно- и дисахариды (дыхание), а также лактат, ацетаты, глицерин, этанол (брожение). В условиях промышленной культивации дрожжи S.cerevisiae штамма ДАН-041/рDES20 позволяют получать до 5 мг высокоиммуногенного полипептида НВsAg/ayw на 1 л плотной стационарной культуры.

Штамм депонирован во Всесоюзной Коллекции Промышленных Микроорганизмов, получив номер ВКПМ Y-2203.

Заявляемая вакцина против гепатита В, согласно изобретению, содержит в 1 мл (одна прививочная доза) 20 мкг очищенного полипептида НВsAg/ayw, полученного с помощью штамма S.cerevisiae ВКПМ Y-2203, 0,5 мг геля гидроокиси алюминия (в пересчете на AL) в буфере ПБС (50 mM Na-фосфатный буфер, рН 6,8+0,13 М NaCl) с 0,005%-ным мертиолятом натрия.

Иммуногенность вакцины в тесте на мышах линии Ваlb/c c массой 12-14 г составляет 0,2-0,25 мкг в расчете на ED 50 (доза вакцины, вызывающая сероконверсию у 50% мышей).

В испытаниях на волонтерах заявляемая вакцина по сравнению с известными обнаруживает наиболее высокие иммуногенные свойства на фоне самого низкого побочного реактогенного эффекта.

Изобретение может быть проиллюстрированно следующими примерами. При этом все рутинные генно-инженерные (Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М. Мир, 1984) и микробиологические (Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ. Москва, Мир, 1988) операции, а также процедуры ПЦР (Saiki R.K. Gelfand D.H. Stoffel S. Sharf S.J. Higuchi R. Horn G.T. Mullis K.B. Erlich H.A. Science, 1988. V.239, N 4839, p. 487-491) и секвенирования ДНК (Sanger F. Nicklen S. Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 1977, V.74, p. 5463-5467) проводили по известным методикам.

Пример 1. Получение челночной (Е.coli/ S.cerevisiae) рекомбинантной плазмиды рDES20 с искусственным опероном для экспрессии в дрожжах S.cerevisiae синтетического гена полипептида НВsAg/ayw.

А. Химический синтез однотяжевых фрагментов ДНК (олигодезоксирибонуклеотидов).

Синтетические олигонуклеотиды получены стандартным твердофазным амидофосфитным методом на отечественном автоматическом синтезатора ASM102Q (Новосибирск) и очищены электрофорезом в 12% -ном полиакриламидном геле (Matteucci M.D. Caruthers M.H. J.Amer.Chem.Soc. 1981, V.103, N 11, p. 3185- 3191).

5'-Фосфорилирование олинонуклеотидов приводили с помощью АТР и полинуклеотидкиназы фага Т4 по стандартной прописи (Королева О.Н. Друца В.Л. Долинная Н. Г. Цытович А.В. Шабарова З.А. Молекуляр.биология, 1984, т.18, с. 146-160).

В работе использовано 48 синтетических олигонуклеотидов: рGCAGCAATGGCAACAAC= p17rpst; pCGGCATCGTGGTGTCACGC= p19pst; pATCGGAGGACCGAAGGA=p17rpvu; pGGTTGTCAGAAGTAAGTTG=p19pvu; pTAGGATCCTCGAGGCCGCGTTGCTGG=p26ao; pACCCCGTAGAAAAGATCA= p18rao; pAACCCCTATTTGTTTATTTTTC=p22rab; pGCTGCAGCTATCGCGAGATTATCAAAAAGGATCT= p34ab; CGGATCCAACGAACGCAACTGC=22ap; TTCTCATGAGAGATGAAG=18rap; CGGATCCTGGTACTCCTCAAGGT= 23at; CCGCTGCAGAAGTCAGTACCGGCT= 24rat; CGGCTCGAGAACTTCTAGTATATC= 24al; CCGCTCGAGTACGTCGTAAGGCCG= 24ral; GACGGTAACCAGCTTCTCAATGATATT= 27au; GTCGGTTACCAAGCTTTGAAGAAAAATGC= 29rau; CATCTCTCATGAGA=14gl; pCTTGCTCTATTTGTTGTTGTTTTTTTTCTCATGAGAGATG=p40rg2; pTAGAGCAAGCAAATTCGA=p18g3; pGAAAGCAGAAGTAATGTTTTCCATTGGTAATCTCGAATTTGp41rg4; pTCTGCTTTCCTAGGTCC=p17g5; pCAGGAAAAAACCAGCTTGCAAAACCAACAATGGACCTAG=p39rg6; pGTTTTTTCCTGCTGACTAGAp20g7; pCACCAAGAGTCTAGACTTTGTGGAATAGTCAAAATTCTAGTCAG= p44rg8; pCTCTTGGTGGACTTCTTT= p18g9; pCGAATTTTGGCCAAGACACACGGTAGTTCCACCCAAAAAATTCAAAGAAGTC p52rg10; pCCAAAATTCGCAGTCCCC= p18g11; pGACAAGTTGGAGGACAGGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTGGGGACTG= p49rg12; pCAACTTGTCCTGGTTATAG p19g13; pAACAAGAAAATAATAAATCTTCTCAAACACATCCATCTATAACCAG= p46rg14; pTTTTCTTGTTCATTTTGTTG=p20g15; pCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATCAAACACAACAACAAAATG= p50rg16; pGACTATCAAGGTATGTTGC p19g17; pCAGTAGAAGTAGTTGAAGATCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACATAC= p51rg18; pCTTCTACTGGTCCATGTA p18g19; pGATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGTAGTCATACAAGTTCTACATGGAC= p48rg20; pTCTATGTATCCCTCCTGTT= p19g21; pGATGGGAATACAGGTGCAATTTCCGTCCGAAGGTTTGGTACAGCAACAGGAGG= p53rg22; pATTCCCATCCCATCATCC= p18g23; pGCTGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTCCGAAAGCCCAGGATGATGG= p47rg24; pGCCTCAGCCCGTTTCTC= p17g25; pCATTGAACAAATGGAACCAACAAAGACAACCAGGAGAAACGG p42rg26; pTTGTTCAATGGTTCGTTGG=p19g27; pCCAATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGTTGGAGACAAACCAACGAAC p58rg28; pTGGTATTGGGGTCCATCT p18g29; pCCACAAACAGAAGAAAATTGGCAACAATGGCAAAAATGGAGACAAAATAGAGTACAAAGATGGACCp66rg30; pTGTTTGTGGGTTTACATTTA=p20g31; CGGATCCTACTTAGCTATCATTAAATGTAAAC 32rg32.

Б. Сборка синтетического гена полипептида НВsAg/ayw с лидерной нетранслируемой областью мРНК секретируемой кислой фосфатазы, кассетой кодонов-терминаторов и 3'-концевым сайтом рестрикции BamHI.

Реакционную смесь (500 мкл), содержащую буфер L (50 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ МgCl₂, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА), АТР (1 мМ) и олигонуклеотиды: 32rg32 (100 пмоль, 0,0318 О.Е./260 нм), р20g31 (102 пмоль, 0,0191 О.Е. /260 нм), р66rg30 (104 пмоль, 0,0772 О.Е./260 нм), р18g29 (106 пмоль, 0,0175 О. Е. /260 нм), р58rg28 (108 пмоль, 0,0654 О.Е./260 нм), р19g27 (110 пмоль, 0,0192 О. Е. /260 нм), р42rg26 (112 пмоль, 0,0522 О.Е./260 нм), р17g25 (114 пмоль, 0,0156 О.Е./260 нм), р47rg24 (116 пмоль, 0,053 О.Е./260 нм), р18g23 (118 пмоль, 0,0181 О.Е./260 нм), р53rg22 (120 пмоль, 0,0649 О.Е./260 нм), р19g21 (122 пмоль, 0,0194 О.Е./260 нм), р48rg20 (124 пмоль, 0,0599 О.Е./260 нм), р18g19 (126 пмоль, 0,0202 О.Е./260 нм), р51rg18 (128 пмоль, 0,0698 О.Е. /260 нм), р19g17 (130 пмоль, 0,0245 О.Е./260 нм), р50rg16 (132 пмоль, 0,0727 О. Е. /260 нм), р20g15 (134 пмоль, 0,0226 О.Е./260 нм), р46rg14 (136 пмоль, 0,0664 О. Е. /260 нм), р19g13 (138 пмоль, 0,0246 О.Е./260 нм), р49rg12 (140 пмоль, 0,0713 О.Е./260 нм), р18g11 (142 пмоль, 0,0235 О.Е./260 нм), р52rg10 (144 пмоль, 0,0768 О. Е. /260 нм), р18g9 (146 пмоль, 0,0223 О.Е./260 нм), р44rg8 (148 пмоль, 0,0663 О.Е./260 нм), р20g7 (150 пмоль, 0,027 О.Е./260 нм), р39rg6 (152 пмоль, 0,0636 О.Е./260 нм), р17g5 (154 пмоль, 0,0215 О.Е. /260 нм), р41rg4 (156 пмоль, 0,065 О.Е./260 нм), р18g3 (158 пмоль, 0,0309 О. Е. /260 нм), р40rg2 (160 пмоль, 0,0574 О.Е./260 нм), 14g1 (162 пмоль, 0,0217 О. Е. /260 нм), нагревали до 65^oС, выдерживали 3 мин и медленно (3 ч) охлаждали до 10^oС. Добавляли Т4-ДНК-лигазу (100 ед.акт.), выдерживали при этой температуре 18 ч, добавляли смесь 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов SdNTP до концентрации каждого 0,2 мМ и Т4-ДНК-полимеразу (60 ед.акт.), выдерживали при комнатной температуре 1 ч, снова добавляли Т4-ДНК-лигазу (30 ед.акт.) и выдерживали при комнатной температуре еще 3 ч. Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/ хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), добавляли 1/10 объема буфера А (ТЕ с сахарозой (40%) и красителями ксиленцианолом и бромфеноловым синим) и выделяли целевой ген (758 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы. Для извлечения ДНК из геля кусочек легкоплавкой агарозы с соответствующим по электрофоретической подвижности фрагментом ДНК расплавляли при 65^oС (5 мин), обрабатывали ферментом b-агаразой (1 ед.акт. 1 ч), раствор перевара агарозы экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ.

В. Получение минимального фрагмента 5'-нетранслируемой области дрожжевого оперона рho5, обеспечивающего контролируемую инициацию транскрипции.

Копию фрагмента промоторной области оперона рho5 получали методом полимеразных цепных реакций (ПЦР). Реакционную смесь (100 мкл), содержащую суммарную ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа (100 мкг), олигонуклеотиды 22ар (0.1 нмоль, 0,022 О.Е./260 нм) и 18rap (0,1 нмоль, 0,019 О.Е./260 нм), смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dGTP, dCTP и dTTP (ΣdNTP; каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Тag 10 ед.акт.) в буфере П (67 мМ трис-НСl/рН 8,8 при 25^oС), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 1,5 мМ MgCl₂, 0,1% ТВИН-20) подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94^oС 0,5 мин; 50^oС 1 мин; 72^oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ПЦР-продукт (316 н.п.) в 1,0%-ном геле легкоплавкой агарозы.

Г. Присоединение промотора к синтетическому гену мРНК полипептида НВsAg/ayw с кассетой кодонов-терминаторов и 3'-концевым сайтом рестрикции BamHl.

Соединение фрагмента промотора и синтетического гена полипептида НВsAg/may проводили методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую полученный в примере N 3 ПЦР-продукт (0,1 мкг), собранный и очищенный (пример N 2) синтетический ген полипептида НВsAg/ayw (0,2 мкг), олигонуклеотиды 22 ар (0,1 нмоль, 0,022 О.Е./260 нм) и 32rg32 (0,1 нмоль, 0,032 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таg (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (8 циклов: 94^oС 0,5 мин; 42^oС 2 мин; 72^oС 1,5 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24: 1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р (10 мМ трис-НСl (рН 7,5 при 37^oС), 10 мМ МgCl₂, 50 мМ NaCl) расщепляли эндонуклеазой рестрикции BamНl (50 ед.акт. 1 ч, 37^oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (1051 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.

Д. Получение минимального фрагмента 3'-нетранслируемой области дрожжевого оперона рho5, обеспечивающего эффективную терминацию транскрипции и процессинг мРНК.

Копию минимального терминатора дрожжевого оперона pho5 получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую суммарную ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа (100 мкг), олигонуклеотиды 23at (0,1 нмоль, 0,021 О.Е./260 нм) и 24rat (0,1 нмоль, 0,023 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94^oС 0,5 мин; 50^oС 1 мин; 72^oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24: 1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHl и Pstl (по 20 ед. акт. 1 ч, 37^oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (186 н. п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы. Е. Получение фрагмента дрожжевой ДНК с опероном leu2.

Копию фрагмента дрожжевой ДНК с опероном leu2 получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую суммарную ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа (100 мкг), олигонуклеотиды 24аl (0,1 нмоль, 0,023 О.Е./260 нм) и 24ral (0,1 нмоль, 0,022 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНКполимеразу Таq (10 ед. акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94^oС 0,5 мин; 48^oС 1 мин; 72^oС 3 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р расщепляли эндонуклеазой рестрикции Xhol (50 ед.акт. 1 ч, 37^oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (2221 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.

Ж. Получение фрагмента природной дрожжевой 2m-плазмиды.

Копию фрагмента природной дрожжевой 2m-плазмиды получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую 100 мкг суммарной ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа [cir⁺] олигонуклеотиды 27au (0,1 нмоль, 0,027 О.Е./260 нм) и 29 rau (0,1 нмоль, 0,03 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94^oС 0,5 мин; 48^oС 1 мин; 72^oС 3 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р расщепляли эндонуклеазой рестрикции Eco91l (50 ед.акт 1 ч, 37^oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (1990 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.

З. Получение бактериального оперона β -лактамазы.

Копию оперона b-лактамазы, не содержащего сайтов рестрикции Pvul и Pstl, получали в два этапа.

З. 1. На первом этапе методом ПЦР получали модифицированные копии двух фрагментов (4235 и 126 н.п.) плазмиды pBR322. Модификации замены одной н.п. в каждой копии, уничтожающие сайты рестрикции Pvul и Pstl без нарушения аминокислотной последовательности b -лактамазы.

З. 1.1. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду pBR322 (10 нг), олигонуклеотиды р19рvu (0,1 нмоль, 0,02 О.Е./ 260 нм) и р17rpst (0,1 нмоль, 0,018 О.Е./260 нм), смесь SdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед. акт. ) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (8 циклов: 94^oС 0,5 мин; 52^oС 1 мин; 72^oС 6 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед. акт. 15 мин, 37^oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (4235 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.

З. 1.2. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду pBR322 (10 нг), олигонуклеотиды р19pst (0,1 нмоль, 0,017 О.Е./260 нм) и р17rpvu (0,1 нмоль, 0,018 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед. акт) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (14 циклов: 94^oС 0,5 мин; 52^oС 1 мин; 72^oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед.акт. 15 мин, 37^oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/ хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (126 н.п.) в 1,0%-ном геле легкоплавкой агарозы.

З.1.3. Реакционную смесь (10 мкл), содержащую ПЦР-дуплексы, полученные в экспериментах "З. 1.1" (0,2 мкг) и "З.1.2" (0,1 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт.) в буфере L выдерживали при комнатной температуре 18 ч и использовали для трансформации E. coli: добавляли к 200 мкл компетентных клеток штамма JM109, выдерживали полученный коктейль 30 мин во льду и 3 мин при 45^oС, разбавляли его 1 мл питательной среды dyt (16 г/л бакто-триптон, 10 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl), инкубировали 40 мин при 37^oС и высевали на чашки с агаризованной (1,2%) средой dyt, содержащей ампициллин (100 мг/л). Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (рBR322-PP) не расщеплялась рестриктазами Рvul и Pstl.

3.2. На втором этапе с помощью ПЦР получали копию оперона β -лактамазы, не содержащего сайтов рестрикции Pvul и Pstl.

Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду рBR322- PP (10 нг), олигонуклеотиды р34аb (0,1 нмоль, 0,034 О.Е./260 нм) и р22rab (0,1 нмоль, 0,019 О.Е./260 нм), смесь SdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед. акт. ) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (8 циклов: 94^oС 0,5 мин; 56^oС 1 мин; 72^oС 1,5 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед. акт. 15 мин, 37^oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (1071 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.

И. Получение бактериального ориджина репликации СоlEl.

Копию бактериального ориджина репликации СоlEl получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду рВR322 (10 нг), олигонуклеотиды р26ао (0,1 нмоль, 0,025 О.Е./260 нм) и р18rao (0,1 нмоль, 0,019 О.Е. /260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (12 циклов: 94^oС 0,5 мин; 54^oС 1 мин; 72^oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед. акт. 15 мин, 37^oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (647 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.

К. Сборка челночной (E.coli/S.cerevisiae) рекомбинантной плазмиды рDES20 с искусственным опероном для экспрессии в дрожжах S.cerevisiae синтетического гена полипептида НВsAg/ayw.

Конструирование плазмиды рDES20 проводили путем сборки из ориджина репликации СоlEl и оперона bla базового вектора рВ1 и последовательного встраивания в него фрагмента 3'-нетранслируемой области дрожжевого оперона рho5 (вектор рВ2), фрагмента 2m-плазмиды (вектор рВ3), фрагмента дрожжевой ДНК с опероном leu2 (вектор рВ4) и кассеты экспрессии: модифицированный промотор дрожжевого оперона рh05 + синтетический ген полипептида НВsAg/ayw.

К. 1. Реакционной смесью (10 мкл), содержащий ПЦР-дуплексы, описанные в примерах З (50 нг) и Д (50 нг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки E. coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (1718 н.п.) расщеплялась рестриктазой Eco911 (этот сайт рестрикции возникает при "правильной" стыковке соединявшихся ДНК-дуплексов). Первичную структуру полученной плазмиды рВ1 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.

К. 2. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды РВ1 (0,5 мкг) с эндонуклеазами рестрикции ВаmHl (20 ед.акт.) и Рstl (20 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37^oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазами рестрикции BamHl и Pstl плазмиду рВ1 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере Д (50 нг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки E.coli JM109. Отбирали клоны, из плазмидной ДНК которых (1895 н.п.) рестриктазами BamHl и Pstl выщеплялся фрагмент величиной 186 н.п. Первичную структуру полученной плазмиды рВ2 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.

К. 3. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды РВ2 (0,5 мкг) с эндонуклеазой рестрикции Eco911 (10 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37^oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазой рестрикции Есо91l плазмиду рВ2 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере Ж (0,5 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНКлигазу (10 ед. акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки Е. coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (3795 н.п.) рестриктазой Есо91l расщеплялась на фрагменты величиной 1895 и 1900 н.п. Ориентацию вставки проверяли методом ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды р26ао и 29rau. Первичную структуру полученной плазмиды рВ3 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.

К. 4. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды рВ3 (0,5 мкг) с эндонуклеазой рестрикции Хhоl (10 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37^oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазой рестрикции Хhol плазмиду рВ3 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере Е (0,5 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт. ) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки Е.Coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (6016 н.п.) рестриктазой Хhol расщеплялась на фрагменты величиной 2221 и 3795 н. п. Ориентацию вставки проверяли методом ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды 24ral и р18rao. Первичную структуру полученной плазмиды рВ4 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.

К. 5. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды рВ4 (0,5 мкг) с эндонуклеазой рестрикции ВamНl (10 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37^oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазой рестрикции BamHl плазмиду рВ4 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере (0,5 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед. акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки E. coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (7067 н.п.) рестриктазой ВamHl расщеплялась на фрагменты величиной 1051 и 6016 н.п. Ориентацию вставки проверяли методом ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды 22ар и 24 rat. Первичную структуру полученной плазмиды рDES20 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.

Пример 2. Получение штамма S.cerevisiae ДАН-041/рDES20 продуцента искусственного полипептида НВsAg/ayw.

Для получения продуцента полипептида НBsAg/mayw плазмидой рDES20 трансформировали дрожжи S. cerevisiae штамма YPH501 (Stratagene). Клетки свежей культуры S.cerevisiae YPH501 (100 мл, А₆₀₀ 0,4) дважды центрифугировали при 2500g с ресуспендированием в буфере ТЕ, суспендировали клетки в 1,5 мл буфера ТЕ с 0,1 М LiCl и выдерживали полученную суспензию 3 ч при 4^oС. К 0,2 мл выдержанной суспензии добавляли 6 мкл буфера ТЕ, содержащего 15 мкг ДНК плазмиды рDES20, выдерживали смесь при комнатной температуре 30 мин, добавляли при тщательном перемешивании 1,5 мл стерильного 40%-ного раствора ПЭГ4000 в буфере ТЕ, выдерживали смесь при комнатной температуре еще 1 ч, прогревали суспензию 5 мин при 42^oС, отделяли клетки центрифугированием (2500g), дважды промывали осадок стерильной водой (суспендирование пипетированием + центрифугирование), ресуспендировали трансформированные клетки в 100 мкл стерильной воды и высевали их на (leu^-) агар. Клоны с (leu^-)-агара тестировали на способность продуцировать полипептид НВsAg/mayw с помощью стандартных РПГ- и ИФ-анализов.

Пример 3. Микробиологическое получение полипептида HBsAg/ayw. Свежую культуру (1 л) штамма S.cerevisiae ДАН-041/рDES20, выращенную на минимальной среде до титра 4х10⁷ клеток/мл, соблюдая стерильность, вносят в ферментер с 9 л стерильной богатой питательной среды, содержащей, мас. пептон из кислого гидролизата казеина (неорганический фосфор 0,5-0,6 мг/г) 3,0; дрожжевой экстракт (неорганический фосфор 2,0-2,5 мг/г) 1,0; глюкоза 2,0; КСl 0,1; NaCl 0,01; СаСl₂ (безводный) 0,02; MgSO₄•7H₂O 0,1; (NH₄)₂SO₄ 0,5; раствор микроэлементов (Кl 20 мг% Н₃ВО₃ 2 мг% MnSO₄ 2 мг% (NH₄)₂MoO₄ 2 мг% FeSO₄ 10 мг%) 0,50 мл/л; раствор витаминов (тиамин хлорид 20 мг% пиридоксин 20 мг% рибофлавин (мононуклеотид) 20 мг% пантотенат кальция 20 мг% никотиновая кислота 20 мг% п-аминобензойная кислота 20 мг% биотин 0,2 мг% инозитол 1000 мг%) 1 мл/л; дистиллированная вода остальное; рН 5,8-6,0 с содержанием неорганического фосфора 40-42 мг/л и культивируют 20 ч при 30^oС.

Полученную накопительную культуру (10 л) с титром 2х10⁸ клеток/мл, соблюдая стерильность,переносят в ферментер с 90 л новой стерильной питательной среды, cодержащей, мас. пептон из кислого гидролизата казеина (неорганический фосфор 0,5-0,6 мг/г) 1,5; дрожжевой экстракт (неорганический фосфор 2,0-2,5 мг/г) 0,1; глюкоза 2,0; КСl 0,1; NaCL 0,01; СаСL₂ (безводный) 0,02; MgSO₄•7H₂O 0,1; (NH₄)₂SO₄ 0,5; раствор микроэлементов (Кl 20 мг% H₃BO₃ 2 мг% MnSO₄ 2 мг% (NH₄)₂MoO₄ 2 мг% FeSO₄ 10 мг%) 0,50 мл/л; раствор витаминов тиамин хлорид 20 мг% пиридоксин 20 мг% рибофлавин (мононуклеотид) 20 мг% пантотенат кальция 20 мг% никотиновая кислота 20 мг% п-амино-бензойная кислота 20 мг% биотин 0,2 мг% инозитол 1000 мг%) 1 мл/л; дистиллированная вода остальное; рН 5,8-6,0 с содержанием неорганического фосфора 5,0-6,0 мг/л и культивируют 22 ч при 30^oС.

Клеточную массу отделяют центрифугированием на препаративном проточном роторе (Beckman) и освобождают от остатков культуральной жидкости трехкратной промывкой буфером К (0,05 M Na₂CO₃/NaHCO₃ (рН 9,0), 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,3 мас. твин-20) с последующим центрифугированием. Подготовленные таким образом 1,2 кг биомассы суспендируют в 10 л буфера К и разрушают дрожжевые клетки на гомогенизаторе Gaulin APV (или аналогичном) при давлении 600-700 атм. (3 цикла), получая 15 л осветленного гомогенизата.

Содержание в гомогенизате целевого полипептида НВsAg/ayw определяют стандартным ИФ-анализом, с помощью любых коммерчески доступных наборов для ИФ-анализа на НВsAg вируса гепатита В.

Титр полипептида НВsAg/ayw в осветленном гомогенизате 34 мкг/мл, выход - 510 мг или 5,1 мг с одного литра культуральной жидкости.

Антигенную активность измеряют в мкг/мл, используя в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности НВsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемый ГИСК им Л.А.Тарасевича и откалиброванный по международному стандарту активности.

На электрофореграммах в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях рекомбинантный антиген представлен в виде полосы мономера 24 кD. Иммуноспецифичность этой полосы показана методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих анти-НВs, меченых йодом 125.

Пример 4. Получение вакцины против гепатита В.

Рекомбинантный поверхностный антиген НВsAg/ayw, полученный по примеру 3, очищают способом, описанным в авторском свидетельстве SU, 1389060, A 61 K 39/29.

Из очищенного полипептида НВsAg/ayw готовят композицию, содержащую в 1 мл (одна прививочная доза) 20 мкг НВsAg, 0,5 мг геля гидроокиси алюминия (в пересчете на Аl ) в буфере ПБС (50 mM Na-фосфатный буфер, рН 6,8 + 0,13 М NaCl) с 0,005%-ным мертиолятом натрия.

Иммуногенность вакцины в тесте на мышах линии Ваlb/c c массой 12-14 г составляет 0,2-0,25 мкг в расчете на ЕD 50 (доза вакцины, вызывающая сероконверсию у 50% мышей).

В испытаниях на волонтерах полученная вакцина по сравнению с известными обнаруживает наиболее высокие иммуногенные свойства на фоне самого низкого побочного реактогенного эффекта.

Использование: медицинская биотехнология, профилактика гепатита В. Сущность: получение рекомбинантной плазмидной ДНК р ДЕS 20, кодирующей синтез поверхностного антигена вируса гепатита В (НВsAg/ayw), штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ДАН-041/р ЕS20, продуцирующего НВsAg/ayw, и вакцины на его основе. Сконструированная рекомбинантная плазмидная ДНК р DES 20 содержит ген HBsAg/ayw под контролем модифицированной промоторной области дрожжевого гена РН05 и способна автономно реплицироваться в Е.сoli и S.serevisiae. При трансформации клеток дрожжей рекомбинантной плазмидой рDES 20 получают штамм S.serevisiae ДАН-041/pDES20, способный продуцировать антиген НВsAg/ayw с уровнем экспрессии до 5 мг на 1 л культуры и обладающий 100%-ной стабильностью плазмиды в неселективных условиях роста. Вакцина против гепатита В включает эффективное количество рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В (НВsAg/ayw), адъювант, консервант, физиологически приемлемый разбавитель и обнаруживает высокую иммуногенность на фоне минимального побочного реактогенного эффекта. 3 с.п.ф-лы.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pDES 20, кодирующая поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg/ayw), мол. м. 4,53 MDa и размером 7067 н.п. содержащая следующие структурные элементы: бактериальный ориджин репликации CoLEI размером 0,62 т.н.п. бактериальный оперон β -лактамазы размером 1,05 т. н.п. фрагмент природной дрожжевой 2μ -плазмиды, обеспечивающий автономную репликацию pDES20 в Saccharomyces cerevisiae, размером 1,89 т.н.п. дрожжевой оперон Leu 2 размером 2,21 т.н.п. дрожжевой оперон HBsAg/ayw с промотором размером 0,35 т.н.п. терминатором размером 0,18 т.н.п. дрожжевого гена РН05 и синтетическим геном полипептида HBsAg/ayw, первичная структура которого составлена с учетом частоты использования кодонов в S. cerevisiae:

при этом область стыковки РН05-промотора и гена полипептида HBsAg/ayw имеет первичную структуру
AAAAAAAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTACCA,
а область стыковки гена полипептида HBsAg/ayw и РН05-терминатора имеет первичную структуру
TAATGATAGCTAAGTAGGATCC. 2. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pDES 20, продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/ayw). 3. Вакцина против гепатита В, содержащая эффективное количество поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/ayw), адъювант, консервант и физиологически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что она содержит антиген вируса гепатита В, полученный путем культивирования штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203.