РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ SALMONELLA MINNESOTA - ПРОДУЦЕНТ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 1995 года по МПК C12N15/31 C12N1/21 C12R1/42 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам использования штаммов-продуцентов для выделения биологически активных препаратов.

В настоящее время капсульный белок FI чумного микроба выделяют специальными методами из вакцинного штамма Yersinia pestis ЕВ НИИЭГ. Однако синтез FI происходит преимущественно при 37^оС, когда чумной микроб имеет ограниченную скорость роста и повышенные питательные потребности. Это приводит к необходимости использования дорогих питательных сред и удлинению срока культивирования штамма до 2 сут.

Для чумного микроба характерно нарушение сборки липополисахарида (ЛПС), на уровне присоединения О-цепей к кору. Полимерное строение FI способствует тому, что белок выделяется вместе с О-цепями и R-фрагментами ЛПС. В результате понижается степень чистоты препарата.

Имеются авирулентные штаммы микроорганизмов с редуцированными ЛПС. В частности ЛПС клеток Salmonella minnesota R595 (гликолипид хемотипа Re) состоит только из липида А и кетодезоксиоктоната. Эти структуры являются общими для подавляющего большинства грамотрицательных бактерий. Присутствуют они также и в ЛПС чумного микроба. Гликолипид Re обладает повышенной гидрофобностью и солюбилизируется при применении специальных методов экстракции, что уменьшает вероятность загрязнения FI при использовании S. minnesota R595 в качестве продуцента.

Целью изобретения является получение штамма-продуцента капсульного антигена чумного микроба с максимальным выходом, минимальными примесями ЛПС и высокой и высокой протективной активностью.

Цель достигается тем, что предлагается штамм (кол. N KMI, Музей живых культур РНИПЧИ "Микроб") S. minnesota R595 pFS1, полученный методом криотрансформации.

Из штамма E. coli НВ101 pFSI щелочным методом выделяли плазмиду рFS1, кодирующую синтез FI антигена, и криотрансформацией передали в клетки штамма S. minnesota R595. Полученные рекомбинанты выращивали 16-18 ч при 37^оС на агаре Хоттингера, содержащем ампициллин, в концентрации 5,0 мкг/мл. Клетки смывали с агара фосфатным буфером, осаждали центрифугированием, из супернатанта выделяли FI, доводя рН до изоэлектрической точки. Полученный осадок белка отделяли центрифугированием и ресуспендировали в том же буфере. Белок хранили в замороженном состоянии при -20^оС.

Штамм S. minnesota R595 pFS1 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При выращивании на агаре Хоттингера, питательном агаре "Дифко" колонии шероховатые, круглые, выпуклые, блестящие, серебристые, мутные, края ровные. При выращивании в жидких средах (мясопептонном бульоне, LB-бульоне) образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при температуре 4-45^оС, при нейтральных значениях рН. Синтез антигена и его секреция в культуральную жидкость осуществляется при выращивании культуры S. minnesota R595 pFS1 в забуференной среде с рН 6,8-7,2 при 37^оС. В качестве источника углерода клетки используют многие углеводы, спирты, органические кислоты: в частности d-глюкозу, d-фруктозу, галактозу.

Источником азота служат как минеральные соли аммонийной и нитратной формы, так и пептон и аминокислоты в органической форме.

Устойчивость к антибиотикам.

Проявляют устойчивость к ампициллину и тетрациклину, обусловленную используемой плазмидой pFS1, векторная часть которой представлена космидой рНС79.

П р и м е р 1. Плазмиду pFS1 выделяли щелочным методом. Рабочая концентрация плазмидной ДНК 200 мкг/мл. Криотрансформацию осуществляли в следующей модификации. Ночную агаровую культуру с одной чашки Петри суспендировали в 5 мл охлажденной до 4^оС дистиллированной воды и выдерживали на ледяной бане 10 мин. Затем к 4 мл суспензии добавляли 1 мл 5%-ной пептонной воды (рН 6,2) и разливали в тонкостенные стеклянные пробирки по 0,2 мл. К микробным клеткам добавляли по 1 мкг плазмидной ДНК в 0,1 мл дистиллированной воды. Пробы помещали на 5 мин в жидкий азот. Затем суспензии микробных культур инкубировали 10 мин при температуре 42^оС; После этого в каждую пробирку добавляли по 0,7 мл охлажденного до 4^оС питательного бульона, выдерживали при температуре 37^оС в течение 1 ч и высевали на чашки, содержащие 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты вырастали на следующие сутки.

Иммунохимические свойства вакцинного штамма Y. pestis ЕВ, исходного и рекомбинантного штаммов. S. minnesota приведены в табл. 1.

Рекомбинантные клоны S. minnesota, содержащие плазмиду pFS1, морфологически не отличались от клеток исходного штамма. Полученные рекомбинанты выращивали 16-18 ч при 37^оС на агаре Хоттингера, содержащем ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. По окончании культивирования клетки смывали 0,02 М фосфатным буфером рН 7,2 и использовали для выделения FI. Иммунохимическое тестирование проводили в суспензии клеток с концентрацией 10⁹ кл/мл. Концентрацию клеток определяли турбидометрически. Для сравнения использовали клеточные культуры Y. pestis УВ НИИЭГ, выращенные в аналогичных условиях в течение 2 сут. В табл. 1 представлены данные по синтезу FI культурами S. minnesota R595 pFS1 и Y. pestis ЕВ в разных температурных режимах. Из данных, представленных в табл. 1, видно что продукция FI в S. minnesоta R595 pFS1 сохраняет температурную зависимость как и в штамме Y. pestis ЕВ. Активность в РПГА FI из S. minnesota R595 pFS1 в пересчете на 10⁹ кл/мл была выше в 30-40 раз, чем в Y. pestis.

П р и м е р 2. Выделение FI из S. minnesota R595 pFS1. Клетки культивировали в матрацах на агаре Хоттингера при температуре 37^оС в течение 16-18 ч. Микробную массу смывали 0,02 М натрий-фосфатным буфером рН 7,2 со стеклянными бусами. Полученную суспензию клеток осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант закисляли добавлением 0,5 N раствора НСl до конечного рН 4,1. Белковый осадок осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин. Осадок белка перерастворяли в том же буфере и хранили при -20^оС. Количество белка определяли по Bradford. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле проводили по Laemmli. Изоэлектрическое фокусирование проводили согласно инструкциям фирмы LKB, прилагаемым к пластинам. Данные по свойствам FI представлены в табл. 2. Выход FI из штамма S. minnesota R595 pFS1 с 1 л среды составил 9,3 мг. Выход FI из Y. pestis, выращенного в течение 2 сут в аналогичных условиях, равнялся 0,25 мл, что почти в 40 раз меньше. Иммунохимические свойства белков не отличались, более того, FI из рекомбинантного штамма был более активен в РПГА и РТПГА, чем исходный FI из штамма Y. pestis EВ. В работе использовали коммерческие препараты иммунодиагностикумов. Содержание углеводов, определенное по Dubous. составило 2% в белке FI из S. minnesota R595 pFS1 и 21,1% в белке из штамма Y. pestis ЕВ. Содержание ЛПС, определенного по Karamian, составляло в относительных величинах 1,2 ед. в FI из рекомбинантного штамма, что в 10 раз ниже, чем в препарате из Y. pestis ЕВ.

Протективность препаратов капсульного антигена определяли по индексу иммунитета, являющегося отношением LD₅₀ для иммунных животных к значению LD₅₀ для интактных животных. Белых мышей иммунизировали препаратами капсульных антигенов в дозе 20 мкг на одно животное. Через 21 дн животных заражали эталонным штаммом Y. pestis 231. Результаты учитывали в течение 3 нед. Индекс иммунитета для FI из штамма S. minnesota R595 pFS1 примерно в 150 раз выше, чем у препарата из штамма Y= pestis ЕВ.

Весь комплекс полученных характеристик свидетельствует о том, что капсульный антиген, выделенный из штамма S. minnesota R595 рFS1 по физико-химическим характеристикам идентичен исходному препарату, а по чистоте во много раз его превосходит. Использование рекомбинантного штамма S. minnesota R595 pFS1 позволяет получить высокоочищенный препарат антигена FI в одну стадию выделения с высоким выходом и выраженной протективностью.

Использование рекомбинантного штамма S. minnesota R595 pFS1 для получения антигена FI позволяет преодолеть ряд существенных недостатков, присущих известным методам. Во-первых, сконструированный штамм обеспечивает 40-кратное увеличение выхода продукта (от 0,25 до 9,3 мг/л), отсутствие сопутствующего трудноотделимого компонента (полисахаридных цепей ЛПС чумного микроба). Вследствие этого появляется возможность одношаговой очистки продукта без использования хроматографического оборудования. Во-вторых, использование в качестве продуцента бактерий S. minnesota R595 pFS1 вместо Y. pestis позволяет использовать при культивировании более дешевые среды (без добавления гемолизированной крови), сократить время культивирования в 2-3 раза (с 2-3 сут до 16-18 ч). Все вышеперечисленные преимущества позволяют ускорить, упростить и удешевить способ получения FI антигена чумного микроба.

Использование: в биотехнологии, а именно в способах использования штаммов-продуцентов для выделения биологически активных препаратов. Сущность применения: на основе Salmonella minnesota R595 с Rl-формой липополисахарида сконструирован штамм, несущий плазмиду pFS I, кодирующую синтез F I антигена чумного микроба. Использование рекомбинантного штамма S. minnesota R 595 pFS I позволяет получить высокоочищенный препарат антигена F I с выраженной протективностью в одну стадию выделения с высоким выходом. 2 табл.

Рекомбинантный штамм Salmonella minnesota R 595 p FSIN КМ I продуцент капсульного антигена чумного микроба.