Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент капсульного антигена фракция 1 чумного микроба Советский патент 1991 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению капсульного антигена фракция I чумного микроба.

В настоящее время в качестве продуцента капсульного антигена фракция I используют штамм Yerslnla pestls EV линии НИИЭГ, Однако известный штамм, продуцирующий капсульный антиген фракция I (Ф1), требует специальных условий работы в соответствии с требованиями противоэпидемического режима и обладает невысокой скоростью роста.

Цель изобретения - получение штамма Escherichla coll, продуцирующего капсульный антиген фракция I чумного микроба.

Штамм Escherichia coli KM13 pAF10-23 создан путем введения в клетки исходного штамма Escherichla coll K802 рекомбинантной плазмиды pAF10-23, сконструированной

генно-инженерными методами и состоящей из векторной плазмиды рАТ153 и фрагмента ДНК плазмиды чумного микроба pFra (99 т.п.н.), кодирующей синтез антигена Ф1 и мышиного токсина. Клонированный фрагмент размером 5,4 т.п.н.имеет в своем составе ген, детерминирующий продукцию капсульного антигена Ф1.

Штамм депонирован в музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института Микроб (Саратов) под номером КМ 13.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культу рал ьно-морфологичес кие признаки. Прямые или слегка изогнутые палочки длиной 2,0-6,0 мкм, шириной 1,1-1,5 мкм. При электронно-микроскопическом исследовании на отдельных клетках регистрируО

00

о

V4 С 00

ется сохранившаяся рыхлая капсула толщиной 1,0-1,4 мкм. На твердых питательных средах формирует типичные для кишечной палочки гладкие, круглые, белые, непрозрачные колонии, При посеве в питательный бульон вызывает равномерное помутнение этой среды. Растет на простых питательных средах с добавлением ампициллина 50 мкг/мл (селективный маркер).

Физико-биохимические свойства. Факультативный анаэроб. Температура оптимального роста 37°С. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, мальтозу, маннозу. Не ферментирует сахарозу, лактозу, маннит.

Продуцирует капсульный антиген чумного микроба фракция I, секретируя его в среду культивирования.

Пример 1. Готовят одномиллиардную взвесь в физиологическом растворе суточных агаровых культур Escherlchia coll МК13 pAF10-23, Escherlchia coll K802, Yerslnla pestis EV. По 0,1 мл культуральных взвесей каждого штамма засевают в 5 мл бульона Хоттингера (для опытного штамма с добавлением 50 мкг/мл ампициллина), выращивают при 37°С в течение 18 ч с аэрацией. При этом титр клеток в бульонной культуре штамма Y. pestis EV составляет 2,5x10 м.к./мл, .и для штамма Е. coll KMT13 pAF-23 9x10 м.к./мл. После осаждения клеток центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин супернатанты исследуют в реакции пассивной гемагглютинации с чумным эритроцитарным моноклональ- ным к фракции I иммуноглобулиновым диагностикумом (производство Среднеазиатского ПЧИ).

Для количественного определения кал- сульного антигена фракция I в культураль- ной среде и определения чувствительности метода используют препарат антигена Ф1 из набора Тест-система иммунофермент- ная моноклональная для идентификации антигена Ф1 возбудителя чумы (производство Среднеазиатского ПЧИ).

Исследуемые супернатанты и раствор антигена Ф1 титруют по 0,2 мл в 0,2 мл раствора Твин-20 (разведение 1:50000) в полистироловых плашках для постановки серологических реакций. Результаты реакции учитывают через 3 ч. Супернатант опытного штамма Е. со II КМ13 pAF-23 реагирует до титра 1:64-1 128; супернатант штамма Y. pestis EV - до титра 1:2-1:4; супернатант штамма Е. coll K802 (рАТ153 (исходный штамм-реципиент с векторной плазмидой) не вызывает склеивания эритроцитов ни в одном из разведений.

Чувствительность метода в данной серии опытов составляет 0.00305 мкг антигена Ф1 на 1 мл. Штамма Escherlchia coll KM13 pAF10-23 продуцирует 0,097-0,195 мкг антигена Ф1 на 1 мл культуральной среды, штамм Yerslnla pestis EV - 0,0061- 0,0122 мкг/мл, штамм Escherichla coll K802 рАТ153 не продуцирует антиген Ф1.

Результаты опыта показывают, что в

0 указанных условиях роста (полноценная питательная среда, аэрация, оптимальная для биосинтеза антигена Ф1 температура 37°С) штамм E.coll KM13 pAF-23 обладает значительной скоростью роста, в процесс кото5 рого в его клетках синтезируется антиген Ф1 чумного микроба. Штамм Yersinla pestis EV линии НИИЭГ не дает прироста биомассы за 18ч инкубации в тех же условиях и вследствие этого проявляет низкий уровень

0 продукции антигена Ф1, в 8-16 раз меньший, чем у штамма Escherichia coll KM13 pAF10-23.

Пример 2, В 250 мл бульона LB (10 г бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экс5 тракта, 10 г NaCI на 1 л, рН 7,2) вносят по 0,1 мл приготовленных по прежней схеме одно- миллиардных взвесей клеток штаммов Escherlchia coll KM13pAF-23, Escherlchia coll K802 pAT153, Yerslnla pestis EV.

0 Для опытного штамма в среду роста добавляют 50 мкг/мл ампициллина. Все штаммы выращивают при 37°С с аэрацией в течение 42 ч. Титр клеток штамма чумного микроба возрастает с 4,0x10 до

5 3,6x10 м.к./мл, титр клеток штаммов кишечной палочки-с 4,0x105 до2,8x108 м.к./мл. Результаты РПГА, поставленной в условиях, аналогичных примеру 1, следующие: супернатант опытного штамма Е. coll

0 KM13pAF-23 реагирует до титра 1:132272; супернатант штамма Y. pestis EV - до титра 1:2048; супернатант штамма Е. coll К802 рАТ153 не дает реакции.

Следовательно, клетки штамма E.coli KM 13

5 pAF10-23 продуцируют в указанных условиях роста в течение 42 ч внеклеточно 399,77 мкг/мл антигена Ф1 чумного микроба, т.е. в 64 раза больше, чем клетки штамма Y. pestis EV (6,25 мкг/мл). При этом титр клеток

0 штамма Е. coll KM13 pAF-23 возрастаете 7x10 раз, титр клеток штамма Y. pestis EV - в 102 раз.

Таким образом, получен штамм Escherichia coll KM13pAF-23, безопас5 ный в противоэпидемическом отношении, продуцент капсульного антигена фракция I чумного микроба, секретируемого в культуральную среду. Кроме того, штамм является базовым для конструирования штамма-суперпродуцента капсульного ан

тигена Ф1, а также рекомендуется в каче-Формула изобретения стве модельного при решении различных

теоретических вопросов, связанных с ре-Штамм бактерий Escherlchla coll

гуляцией экспрессии антигена фракция IКМ 13 - продуцент капсульного антигена

чумного микроба.5 фракция I чумного микроба.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению капсульного антигена фракция I чумного микроба. Цель изобретения - получение штамма Escherichja coll, продуцирующего капсульный антиген фракция I чумного микроба. Для этого штамм Е. coll K802 трансформирован сконструированной генно-инженерными методами рекомбинантной плазмидой р AF-10-23, содержащей репликон векторной молекулы рАТ153 и фрагмент ДНК (размером 99 т.п.н.) плазмиды чумного микроба pFra. В результате получен штамм, способный продуцировать капсульный антиген фракция I, секретируя его в среду культивирования. Продукция антигена фракция I определяется в реакции пассивной гемагглютинации с чумным эритро- цитарным моноклона л ьн ы м к этому антигену иммуноглобулиновым диагно- стикумом.