ДНК-ЗОНД ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА (BX-ЗОНД) Российский патент 2000 года по МПК C12N15/31 C12N15/63 C12Q1/68 C07K14/24 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности генетической инженерии, и может быть использовано для типирования штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности методом ДНК-ДНК гибридизации с использованием специфического ДНК-зонда.

Известен принцип генетического зондирования, который широко используется для изучения различных микроорганизмов, например применение зондов нуклеиновых кислот, позволяющих идентифицировать легко передающиеся линии Pseudomonas cepacia (PCT/US96/11132, C 12 Q 1/68), ряд генетических зондов для идентификации чумного микроба (см. текст ниже) и др.

Известны ДНК-зонды, используемые для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности - pEK7-ДНК-зонд (авт. свид. СССР, N 1615181, МПК: C 12 Q 1/68, C 12 N 15/31) и штаммов чумного микроба с генами капсульного антигена - pYH1-ДНК-зонд (патент России, N 2055893, МПК: C 12 N 15/31, 1/21//(C 12 N 1/21, C 12 R 1: 19)). Первый ДНК-зонд представляет собой HindIII-BamHI-фрагмент (99 н.п.) плазмиды пестициногенности (pPst) с частью структурного гена фибринолизина и коагулазы. Второй ДНК-зонд (патент России, N 2055893) представляет собой HindIII-фрагмент (800 п.н.) ДНК плазмиды (pFra), ответственной за синтез капсульного антигена (F1) чумного микроба.

Известен также ДНК-зонд, сконструированный на основе хромосомных генов Y. pestis-МК-зонд (Норкина О.В., Куличенко А.Н., Шовадаева Г.А., Бошнаков Р. Х. , Аксенов М.Ю., Попов Ю.А. и др., /Коструирование видоспецифического для Yersinia pestis хромосомного ДНК-зонда //Генетика., 1993, и. 29, N 3, с. 417-422), который тоже используется для идентификации чумного микроба.

Однако все вышеперечисленные зонды не предназначены для типирования штаммов возбудителя чумы различного происхождения.

Известны три ДНК-зонда, способные типировать штаммы чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности: ДНК-зонды, созданные на основе мигрирующих генетических элементов IS100 и IS285 (Бобров А.Г., Филиппов А.А/ Распространенность IS100 и IS285 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1997, N 2, с. 36-40) и ДНК-зонд HRSIII размером 600 н.п., полученный на основе высокоповторяющихся элементов генома чумного микроба - HRS-элементов (Дроздов А. В., Можаров О.Т., Анисимов П.И. /Выявление повторяющихся последовательностей ДНК в геноме чумного микроба //Молекулярная биология и микробиология природно-очаговых инфекций, 1986, с. 71-78; Можаров О.Т., Савостина Е.П., Шведун Г.Р., Анисимов П.И. /О двух особенностях структурной организации генома иерсиний //Иерсиниозы, Владивосток, 1989, с. 39-40; Можаров О.Т., Савостина Е. П., Анисимов П.И., Солодовников Н.С., Балахонов С.В., Айкимбаев А.М. / Высокоповторяющиеся элементы генома возбудителя чумы //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1997, N 1, c. 26-30).

Наиболее близким к заявляемому зонду является ДНК-зонд, созданный на основе HRS-элементов, а именно ДНК-зонд HRSIII/37, описание которого дано в паспорте депонированного в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" штамма E. coli HB101pHRSIII/37 - продуцента последнего. Способ получения данного зонда заключается в том, что фрагмент хромосомной ДНК чумного микроба размером около 230 н.п. был лигирован в векторную плазмиду pUC19, которую предварительно обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой BamHI с последующим воздействием S1-нуклеазы для формирования тупых концов. Полученную рекомбинантную плазмиду pHRSIII/37 трансформировали в штамм E.coli HB101, необходимые клоны которой отбирали по способности последних расти на среде с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм E. coli HB101pHRSIII/37 является источником ДНК-зонда HRSIII/37.

Задача заявляемого изобретения состоит в расширении группы ДНК-зондов, способных типировать штаммы чумного микроба, выделенные из различных природных очагов, а также получении штамма-продуцента заявляемого ДНК-зонда.

Заявляемый ДНК-зонд BX для типирования штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, является частью рекомбинантной плазмидной ДНК pBX (2780 н.п.), которая содержит векторную часть-ДНК pUC19 размером 260 н. п. , BglII-XbaI-фрагмент ДНК HRSIII/37-зонда размером 180 н.п., уникальные сайты рестрикции: AluI и HaeIII и генетический маркер: Lac-оперон, Ap-устойчивость.

Предложенный ДНК-зонд BX был получен следующим образом. Сначала была сконструирована рекомбинантная плазмида pBX и получен штамм E. coli HB101pBX-донор заявляемого ДНК-зонда.

Для этого на первом этапе проводят выделение ДНК плазмиды pHRSIII/37 из штамма кишечной палочки E. coli HB101pHRSIII/37 и векторной плазмиды pUC19 из штамма E. coli TG1. Клетки штаммов кишечной палочки выращивают на агаре Хоттингера (pH 7,2) с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) при температуре 37^oC в течение суток. Плазмидную ДНК из указанных штаммов выделяют, например, методом О. Т. Можарова (Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций, 1982, ч. 1, с. 48-49). Полученные препараты плазмидных ДНК pHRSIII/37 и pUC19 используют до конструирования рекомбинантной плазмиды pBX.

На второй этапе клонируют фрагмент ДНК из плазмиды pHRSIII/37 в векторную плазмиду pUC19. Плазмидную ДНК pHRSIII/37 инкубируют с рестриктазами BglII и XbaI при температуре 37^oC в течение 3 часов. Продукты гидролиза разделяют под действием электрического тока в 1% агарозном геле. В длинноволновом ультрафиолетовом свете (200 - 350 нм) отмечают положение низкомолекулярного BglII-XbaI-ДНК фрагмента (180 н.п.) с дальнейшим его выделением, например, методом электроэлюции в лунку (Миниатис Т. с соавт., Молекулярное клонирование, М., 1984). Полученный BglII-XbaI-фрагмент лигируют с векторной плазмидой pUC19, предварительно рестрицированной эндонуклеазами BamHI и XbaI, с образованием рекомбинантной плазмиды, обозначенной pBX.

На третьем этапе получают штамм-продуцент рекомбинантной плазмиды pBX-источника BX-зонда для типирования штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности. Для этого полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма E. coli HB101, например, по методу (Chung C.T., Riger H.M. /Arapid and convenient methot for the preparation and storage of competent bacterial cells //Nucl Acid. Res., 1988, N 16, N 8, p. 3580). При высеве на плотные питательные среды с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (Ap) и 10 мг/мл лактозы (Lac) отбирают Ap-устойчивые и Las-колонии с последующим анализом на наличие рекомбинантной ДНК. Вставку фрагмента ДНК подтверждают совместным гидролизом ДНК рекомбинантной плазмиды pBX эндонуклеазами EcoRI и PstI. Рекомбинантная ДНК, состоящая из векторной плазмиды pUC19 и фрагмента хромосомной ДНК чумного микроба размером 180 н.п., обозначена pBX, а клон E. coli HB101, несущий гибридную плазмиду pBX, отобран как донор данной плазмиды. Синтез предлагаемого ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плазмиды pBX. Заявляемый зонд получают в результате совместного гидролиза ДНК рекомбинантной плазмиды pBX эндонуклеазами EcoRI и PstI с последующим выделением заданного ДНК-зонда.

Полученный штамм E. coli HB101, содержащий рекомбинантную плазмиду pBX, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, не образуют спор.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) и лактозы (10 мкг/мл). На плотной среде образуют серые, гладкие, блестящие, круглые колонии с ровным краем. При выращивании на бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки: оптимальная температура роста 37^oC, оптимум pH 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота - минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме), органические соединения (пептон, триптон, аминокислоты).

Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл.

Использование полученного ДНК-зонда BX демонстрируется следующим примером.

На первом этапе получают нерадиоактивномеченный ДНК-зонд BX для типирования штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности. Для этого 10 мкг ДНК плазмиды pBX совместно гидролизуют рестриктазами EcoRI и PstI. После электрофоретического разделения продуктов гидролиза низкомолекулярный фрагмент ДНК (180 н.п.) элюируют согласно (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. /Молекулярное клонирование // М., 1984, с. 171). Полученный раствор ДНК BX-зонда метят с помощью DIG-dUTP методом ник-трансляции согласно рекомендациям фирмы "Boehringer-Mannheim" (Германия).

На втором этапе проводим ДНК-ДНК-гибридизацию нерадиоактивномеченного ДНК-зонда BX с хромосомной ДНК возбудителя чумы согласно рекомендациям фирмы "Boehringer-Mannheim" (Германия). Ферментативный гидролиз хромосомной ДНК штаммов чумного микроба с использованием рестрикционной эндонуклеазы EcoRI производства "Fermentas" (Литва) проводят в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляют в 0,9% агарозном гелях в трис-ацетатной буферной системе (pH 8,0-8,2) на камере "Maxiphor" ("Hoefer", США) в течение 16 часов. Блотинг ДНК из геля на нейлоновые фильтры "Hуbond N" ("Amersham", Англия) проводили с помощью прибора "Transvac" ("Haefer", США). Отжиг блота проводят УФ в течение 1,5-2,0 минут.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для типирования штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности. Предложенный ДНК-зонд BX для типирования штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, является частью рекомбинантной плазмидной ДНК pBX (280 н.п.), которая содержит векторную часть - ДНК pUC19 размером 2600 н.п.; BglII-XbaI - фрагмент ДНК HRSIII/37-зонда, размером 180 н.п.; уникальные сайты рестрикции: AluI и HaeIII и генетический маркер: Lac-оперон, Ap-устойчивость. Предложенный ДНК-зонд позволяет типировать штаммы чумного микроба, выделенные из различных природных очагов.

ДНК-зонд ВХ для типирования штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, является частью рекомбинантной плазмидной ДНК рВХ (2780 н.п.), которая содержит: векторную часть - ДНК pUC19 размером 2600 н. п.; BglII-XbaI - фрагмент ДНК HRSIII/37-зонда, размером 180 н.п., являющийся частью генома чумного микроба; уникальные сайты рестрикции : AluI и НаеIII; генетический маркер : Lac-оперон, Ар-устойчивость; имеющая нуклеотидную последовательность
т