ШТАММ SWINE FEVER VIRUS ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N7/00 A61K39/187 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к получению штамма вируса классической чумы свиней "ЛК-К", и может быть применено в научно-исследовательских учреждениях и различных отраслях биологической промышленности для производства вирусвакцины против заболевания классической чумы свиней (КЧС).

Известен "Китайский" лапинизированный штамм (СLS), который носит название "С" или "К" или LPS, нашедший широкое применение в мировой практике вакцинации свиней против заболевания КЧС. Однако данный штамм вируса хорошо размножается (до 3,0-3,5 lg БОЕ₅₀/мл.) только в тканях кролика, при введении вируса животному, или в тканевых культурах клеток почки эмбриона кролика. Впоследствии он был адаптирован к первичным культурам почки ягненка. Существенным его недостатком является низкий уровень накопления в перевиваемых культурах и несоответствие иммуногенной активности, определяемой на животных, инфекционной активности, определяемой титрованием в культуре клеток.

Штамм "ЛК-ВНИИВВиМ" (Вирусвакцина ЛК-ВНИИВВиМ против КЧС сухая культуральная. ТУ 10-09-46-90) получен из исходного штамма "К". Используется для изготовления вакцины "ЛК-ВНИИВВиМ", обладает хорошей иммуногенностью, слабореактогенен, размножается в первичных культурах клеток тестикул ягнят. В перевиваемых линиях клеток почек поросенка (ПКПС, ППК, РК-15, ПСМ), сибирского горного козерога (ПСГК), эмбриона африканской козы (ПЭАК), зайца (ПЗ), овцы (Ури), сирийского хомячка (ВНК-21/13), сайги (ПС), зеленой мартышки (СV-1), эмбриона кролика (ПЭКр), тестикул поросенка (ПГП) накопление вируса было незначительным (1,75-3,50 lg БОЕ₅₀/мл.), достигая максимального значения в культурах РК-15 и ПСМ-4,5 lg БОЕ₅₀/мл. Для производства вакцины против КЧС из штамма "ЛК-ВНИИВВиМ" требуются первичные культуры клеток тестикулы ягнят.

Недостатками этого метода являются: нерентабельность использования некондиционных (молодых) с/х животных, непредвиденные последствия контаминации вирусного сырья другими патогенными или условно патогенными агентами от доноров ткани и сезонность поступления донорской ткани (тестикулы ягнят, весенне-летний период).

Штамм "ЛК-К" вируса КЧС получен из штамма "ЛК-ВНИИВВиМ" клонированием и селективным отбором полученных клонов по признаку высокого накопления в перевиваемой культуре клеток. Методом предельных разведений в течение 5 пассажей и селекции отобран и изолирован клон, накапливающийся в перевиваемой культуре клеток РК-15 в титрах 5,5-7,0 lg БОЕ₅₀/мл. Штамм "ЛК-К" депонирован под N 1842 в коллекции ВНИИВВиМ.

Стабильность данного признака сохранялась на протяжении 50 пассажей (срок наблюдения). Полученный клон вируса КЧС условно обозначен "ЛК-К". Он сохраняет высокое накопление и в других перевиваемых культурах: ПКПС (5,0-6,0 lg БОЕ₅₀/мл.), ПМС (5,0-6,5 lg БОЕ₅₀/мл.), ПСГК (5,5-6,5 lg БОЕ₅₀/мл). Данное свойство сохраняется на уровне 50 пассажей (срок наблюдения). Матровый вирус хранится в лиофилизированном состоянии на уровне II пассажа при -70^оС.

В отличие от штамма "ЛК-ВНИИВВиМ", полученный штамм "ЛК-К" имеет свои специфические генетические маркеры. Константа инактивации (К) при 56^оС для штамма "ЛК-ВНИИВВиМ" cоставляет 42,5 ч^-1, для "ЛК-К" 40,3 ч^-1, т.е. более термоустойчив. Штамм "ЛК-ВНИИВВиМ" в перевиваемой культуре ПЭКр не размножается, "ЛК-К" накапливается в пределах 1,5-2,0 lg БОЕ₅₀/мл.). Иммуногенная (определяется на подсвинках) и инфекционная (в культуре клеток РК-15) активности вируса КЧС штамма "ЛК-К" совпадают, что позволяет при оценке вирусвакцины не использовать дорогостоящих животных, в то время как у штамма "ЛК-ВНИИВВиМ" разница существенна (0,5-1,5 lg). Кроме того, штамм защищает 80-100% подсвинков, вакцинированных нативной вакциной в дозе 2 мл. через 48 ч от контрольного заражения, в то время как штамм "ЛК-ВНИИВВиМ" в аналогичных условиях обеспечивает частичную защиту только через 3 сут после прививки (табл.).

Полученный штамм вируса на уровне 12-50 пассажей служит живой культуральной вакциной для иммунизации свиней. Свиней прививают с двух-трех месячного возраста в дозе 100-10000 БОЕ₅₀ в объеме 2 мл. однократно. Иммунитет наступает на 10-20-е сутки после вакцинации. Проверка 3 экспериментальных серий вакцины из штамма "ЛК-К" показала (акт комиссионных испытаний от 27 ноября 1992 года), что она ареактогенна, безвредна и высокоиммуногенна. Вакцинация подсвинков обеспечивает 100% защиту животных от контрольного заражения.

Использование. Сущность изобретения: получение нового штамма вируса классической чумы свиней, размножающегося с высокой инфекционной активностью 5,0 - 6,5 lg. БОЕ_5 0/мл в перевиваемых культурах клеток, с большей терморезистентностью по сравнению со штаммом ЛК-ВНИИВВиМ и сохраняющего иммуногенность. Штамм "ЛК-К" вируса классической чумы свиней депонирован в коллекции ВНИИВВиМ под N 1842, получен клонированием методом предельных разведений и селективным отбором полученных клонов по признаку - размножение в высоком титре в перевиваемых культурах клеток. Клонирование проводят методом предельных разведений в течение 5 пассажей. В результате из штамма изолирован клон, накапливающийся в перевиваемых культурах клеток в титрах 5,5 - 7,0 lg БОЕ_5 0/мл. Стабильность данного признака сохраняется на протяжении 50 пассажей /срок наблюдения/. Полученный клон вируса КЧС условно обозначен "ЛК-К" 1 табл.

Штамм Swine fevep virus ЛК-К ВНИИВВиМ N 1842 для изготовления вакцины против классической чумы свиней.