СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к иммунологии и медицине и может быть использовано как средство для поиска адекватных корректоров дисфункций фагоцитирующих клеток, в частности, нейтрофильных гранулоцитов (НГ).

Нейтрофильные гранулоциты обладают уникальными возможностями, которые проявляются в большом функциональном потенциале и широком адаптационном диапазоне. Вместе с тем, их приобретенная или врожденная функциональная недостаточность в сочетании с количественными изменениями (нейтропения, нейтрофилез) рассматривается как фактор риска для развития многих патологий.

Исходя из изложенного, в настоящее время достаточно актуален вопрос регуляции функциональной активности НГ, в частности, интерес представляет поиск средств для коррекции уровня их реагирования.

В настоящее время известны некоторые модели дисфункций иммунной системы, касающиеся и клеток гранулоцитарного ряда: тимэктомированные мыши (Р.В. Петров, Р. М. Хаитов и др. "Влияние тимэктомии на гранулоцитопоэз", Радиобиология, 1976. - N 4, с. 560), модели с использованием иммунизации патогенными стафилококковыми и стрептококковыми бактериями (И.В. Нестерова, В.А. Тараканов, А. Н. Луняка "Коррекция миелопидом нарушений маркерной характеристики поверхностной мембраны и цитоплазмы нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-септических заболеваниях у детей" //Гематол. И трансфузиол., 1991. - N 5. - с. 31 - 34; Redd H., Chriscusen R., c.a. Circulatino and storage neutrophils in septis neonatal rats.//I.Inf. Diseases, 1988, 157, N 4, 705 - 712).

Первый способ заключается в том, что мышам проводят экспериментальную тимэктомию, в результате чего резко сокращается количество циркулирующих НГ. Сущность вторых двух способов-аналогов заключается в индукции дисфункций клеток гранулоцитарного ряда, развивающихся на фоне введения стафилококка и стрептококка. Приведенные способы отличаются некоторыми недостатками. В частности способ с использованием тимэктомии достаточно сложен, требует определенных навыков и дает преимущественную количественную депрессию НГ в сравнении со снижением функциональной активности.

"Стафилококковая" модель, избранная за прототип, так же, как и "стрептококковая", характеризуется сложностью, небезопасностью, в связи с работой с патогенным материалом и зараженными животными.

Целью изобретения явилось создание экспериментальной модели МИС по системе НГ путем иммунизации линейных лабораторных мышей поливалентным антигеном - эритроцитами барана (ЭБ), в обычных дозах, используемых для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа. Выбор такого способа создания модели иммунодефицитного состояния по системе НГ был обоснован данными научной литературы о том, что антиген, попадая в организм, значительно изменяет функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и вызывает сложный комплекс нейроэндокринных сдвигов (Шхинек Э.К., Достоевская Л.П. и др., 1982). Кроме того, известно, что в условиях иммунизации наблюдается усиленное перераспределение фагоцитарных клеток в организме, коррелирующее с изменением их фагоцитарной активности. Наконец, исходя из сведений литературы о том, что НГ являются первой "аварийной" линией защиты организма (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989), можно предполагать возможное иммунодефицитное состояние НГ в самые ранние сроки после введения в организм достаточно сильного, и в то же время непатогенного антигена - эритроцитов барана.

Для осуществления указанной цели были поставлены следующие задачи.

1. Изучить влияние иммунизации эритроцитами барана на количество и функциональную активность НГ лабораторных мышей в динамике.

2. Определить временной интервал, в течение которого отмечается максимальная депрессия количества циркулирующих НГ и их основных функций.

Сущностью предлагаемого изобретения является внутрибрюшинное введение 20%-ной суспензии эритроцитов барана в объеме 0,2 мл/мышь, в результате чего через 1 час у животных развивается выраженная достоверная депрессия количества циркулирующих НГ, а также их рецепторного аппарата и активности микробицидных систем, а на 5-е сутки после иммунизации отмечается стойкая депрессия функции захвата и переваривания антигенного материала.

Для технического решения поставленных задач были использованы белые беспородные лабораторные мыши, 20-ная суспензия эритроцитов барана, шприцы и иглы инъекционные, а также все необходимое оборудование для тестирования состояния системы НГ по методам, описанным И.В. Нестеровой и соавт. (1992).

Новизна способа заключается в использовании поливалентного антигена (эритроцитов барана) путем иммунизации животных с целью моделирования количественной и функциональной депрессии системы НГ.

Изобретательский уровень предложения обосновывается его неочевидностью. Авторам изобретения не известно использование предлагаемого способа для создания экспериментального ИДС по системе НГ.

Воспроизводимость способа не вызывает сомнения и не требует дополнительных доказательств.

Создание экспериментальной модели ИДС по системе НГ осуществляли следующим способом: 20%-ную суспензию ЭБ вводили однократно внутрибрюшинно в утренние часы в объеме 0,2 мл на мышь. Мыши были разделены на 4 группы:
1 группа - фоновый контроль
2 группа - оценка системы НГ спустя 1 час после иммунизации
3 группа - оценка системы НГ через 24 часа после иммунизации
4 группа - оценка системы НГ на 5-е сутки после иммунизации
НГ выделяли из периферической крови мышей, забитых декапитацией, на градиенте плотности фиколл-верографина. При этом оценивали количество циркулирующих в периферической крови НГ (абсолютное), рецепторный аппарат НГ оценивали по количеству клеток, несущих рецепторы к эритроцитам барана в реакциях раннего и позднего розеткообразования, а также по количеству комплементарных EAC-POH. О состоянии микробицидных систем НГ судили по показателям NBT-теста спонтанного и стимулированного - в нагрузочных тестах in vitro и по уровню активности миелопероксидазы. Фагоцитарную активность и переваривающую способность НГ определяли по отношению к культуре Staph. aureeu (музейный штамм N 209) (Нестерова И.В. и соавт., 1992).

Согласно результатам проведенного исследования, через 1 час после иммунизации мышей ЭБ отмечается выраженная депрессия абсолютного количества НГ (табл. 1). Кроме того, показано, что в эти сроки наблюдается снижение количества ранних и поздних E-POH в 7 раз и в 2 раза соответственно, а количества EAC-POH - в 5 раз (табл. 1). Результаты оценки состояния микробицидных систем НГ свидетельствовали о том, что через 1 час после введения антигена показатели NBT-теста (% ФПК, СЦИ) были в 2 - 3 раза ниже исходных фоновых значений. При этом значительно был угнетен ответ на антигенную нагрузку в тестах in vitro: было снижено количество формазан-позитивных клеток (в 3,5 раза) и среднего цитохимического индекса (в 2,5 - 3 раза) (табл. 1).

Изучение показателей фагоцитарной активности и переваривающей способности НГ не позволило выявить сходные изменения в ранние сроки оценки (через 1 час), однако на 5-е сутки от иммунизации (что соответствует пику IOM-антителогенеза на антиген) была зафиксирована достоверная депрессия активно-фагоцитирующих клеток, их способность к захвату, поглощению и перевариванию объекта фагоцитоза (табл. 2).

Таким образом полученные результаты позволяют заключить, что для получения достоверной экспериментальной модели количественного и функционального ИДС по системе НГ достаточно иммунизировать лабораторных мышей 20%-ной суспензии ЭБ в объеме 0,2 мл/мышь и спустя 1 час использовать таких мышей, как экспериментальную модель депрессии количества циркулирующих НГ, угнетения рецепторного аппарата и микробицидных систем НГ. Для получения же экспериментальной депрессии фагоцитарной активности НГ иммунизированных мышей используют на 5-е сутки после введения ЭБ. В указанные сроки - через 1 час и на 5-е сутки после иммунизации на экспериментальных мышах можно проводить оценку иммунокорригирующих свойств препаратов.

Пример. Мыши-самцы весом 25 г, которым введена внутрибрюшинно однократно в утренние часы 20%-ная суспензия ЭБ в объеме 0,2 мл/мышь. Через 1 час и на 5-е сутки после иммунизации на фоне выраженной депрессии количества циркулирующих НГ и их основных функций введен препарат - иммуномодулятор миелопид, после чего была проведена оценка функций и количества НГ. Результаты исследования показали восстановление угнетенных показателей до уровня нормы (табл. 3, 4).

Предлагаемый способ апробирован на 85 лабораторных мышах. Медико-социальная эффективность предлагаемого способа очевидна, поскольку позволяет сократить время на подбор иммунокорригирующих препаратов для оценки влияния их на отдельные функции НГ, что особенно актуально при коррекции изолированных и комбинированных внутрисистемных повреждений НГ. Проведение же экспериментальных испытаний известных и совершенно новых иммунокорректоров с использованием предлагаемой модели может найти широкое применение в лечебной практике, а также расширить фундаментальные знания о состоянии системы НГ в условиях иммунизации поливалентным антигеном - ЭБ.

Способ может быть использован в медицине и иммунологии. Экспериментальным лабораторным мышам внутрибрюшинно вводят 20%-ную суспензию эритроцитов барана в объеме 0,2 мл/мышь, в результате чего спустя 1 час развивается депрессия количества циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов, а также показателей их основных функций (рецепторной, микробицидных систем). На 5-е сутки отмечается выраженная и стойкая депрессия фагоцитарной активности и переваривающей способности нейтрофильных гранулоцитов (НГ) у иммунизированных животных. Способ позволяет создать экспериментальную модель иммунодефицитных состояний по системе НГ для проверки корригирующего влияния препаратов-иммуномодуляторов по отношению к дефектным НГ. 2 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ моделирования иммунодефицитного состояния, включающий создание количественной депрессии нейтрофильных гранулоцитов и их основных функций в системе in vivo, отличающийся тем, что иммунодефицитное состояние нейтрофильных гранулоцитов создают путем однократного внутрибрюшинного введения в организм животного 20%-ной суспензии эритроцитов барана в объеме 0,2 мл/мышь. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммунодефицитное состояние по количеству циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов и состоянию рецепторного их аппарата и микробицидных систем животного получают через 1 час после внутрибрюшинного введения 20%-ной суспензии эритроцитов барана в объеме 0,2 мл/мышь. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммунодефицитное состояние по фагоцитарной активности и переваривающей способности нейтрофильных гранулоцитов получают на 5-е сутки после внутрибрюшинного введения 20%-ной суспензии эритроцитов барана в объеме 0,2 мл/мышь.