СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОГЕННОСТИ КОКЛЮШНЫХ ВАКЦИН Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области здравоохранения, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано для оценки иммуногенных свойств коклюшных вакцин на стадии их производства для исключения возможности использования в практике вакцинопрофилактики коклюшных вакцин со слабой иммуногенной активностью, не способных сформировать полноценную защиту против коклюша в детском организме.

Коклюш является тяжелым острым респираторным заболеванием, поражающим ежегодно во всем мире более 60 млн. человек, из которых около 0,6 млн. погибают от этой инфекции. Внедрение широкомасштабной вакцинации против коклюша значительно уменьшило заболеваемость этой инфекцией. Однако в последние годы наблюдается существенный рост заболеваемости коклюшем как в нашей стране (Сигаева Л.А. с соавт. “Причины роста заболеваемости коклюшем и программа на ближайшие годы”, ж-л. “Здравоохранение РФ” 1993, №1, с.19-21; Селезнева Т.С. с соавт. “Клинико-эпидемиологические аспекты коклюшной инфекции в современных условиях”, ж.-л. “Эпидемиология инфекционных болезней”, 1999, №2, с.63-64), так и за рубежом (“Коклюш” ААР 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases, 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p.436) причем формирование заболеваний коклюшем отмечается не только у непривитых, но и у полноценно привитых детей (Williams Y.V. “Смертельные случаи коклюша у привитых детей в Южном Уэльсе в 1996-1997 гг.” Med.Y. Apr. 22:139, Apr 16). Этот факт может быть обусловлен как уменьшением иммунной прослойки населения за счет противопоказаний к вакцинации против коклюша, так и применением коклюшных вакцин со слабыми защитными свойствами. Использование таких вакцин в практике вакцинопрофилактики обусловлено несовершенством методов контроля их иммуногенной активности.

В научной и патентной литературе известны способы оценки токсичности коклюшных вакцин, описанные в патентах Е.П.Москаленко с соавт. “Способ оценки токсичности коклюшных вакцин” №1459001 от 30.12.92 г.; №1321227 от 30.12.92; №2174229 от 27.09.01 г. и статьях - А.Р.Нуридинова с соавт. “К формированию системы тестов оценки безопасности коклюшных препаратов различного типа: цитотоксическое действие на тимоциты мышей in vitro” ЖМЭИ, 1990. - С.50-54 и др. Тогда как простые и надежные способы оценки иммуногенных свойств, адекватно отражающие защитную активность коклюшных вакцин, выпускаемых в массовую вакцинопрофилактику, не выявлено.

Поэтому разработка новых методов контроля и оценки защитных свойств коммерческих коклюшных вакцин, выпускаемых в серийное производство, является актуальной задачей современной вакцинопрофилактики.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлены различные способы оценки эффективности коклюшных вакцин. Так, van der Ark A. et al. ("Коклюшный серологический тест, как альтернатива внутримозговому тесту для оценки иммуногенной активности коклюшных вакцин". Develop. in Biol. Stand. - 1996. -Vol.86. - P.271-281) предлагают оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню антител к основным протективным антигенам (КТ и ФГА) В. Pertussis на 4-5 неделе после введения их экспериментальным животным. В журнале Inf. and Immun. - 1998. - Vol. 66, №2. - Р.594-602 (Mills КН., et al. "Мышиная модель, в которой иммуногенные свойства коклюшных вакцин, коррелирует с их эффективностью у детей") изложен способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин на респираторной мышиной модели по степени очищения верхних дыхательных путей от вирулентных коклюшных бактерий на 7-10 день после заражения. Авторами Syukuda Y. et al. ("Тест аэрозольного инфицирования для оценки иммуногенности коклюшных вакцин". Tokai J. Ехр. Clin. Med. - 1988. - Vol.l3, Suppl. 2. - P.71-72) предложен способ оценки защитных свойств коклюшных вакцин по проценту выживаемости мышей, иммунизированных коклюшными вакцинами и, аэрозольно зараженных вирулентным штаммом В.pertussis.

Однако описанные способы оценки иммуногенности коклюшных вакцин сложны, требуют использования большого количества лабораторных животных, расхода коклюшных вакцин, длительных сроков исследования, а также отличаются высокой вариабельностью.

Прототипом данного изобретения является метод оценки защитных свойств коклюшных вакцин, полученных из производственных штаммов коклюшных бактерий, описанный в “Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий”, М., 1987, с.18-28. Способ заключается в следующем: белых беспородных мышей массой 10-12 г (20 шт.) внутрибрюшинно иммунизируют испытуемой коклюшной вакциной в дозе, составляющей прививочную дозу для человека (10 млрд.м.т.). Через 2 нед. проводят внутримозговое заражение экспериментальных животных нейротропным штаммом бактерий 18323, в 100% случаях вызывающей гибель интактных животных. Доза вирулентного штамма должна составлять не менее 100 ЛД₅₀ (летальная доза, при которой погибают 50% животных, взятых в опыт). Для вычисления ЛД₅₀ параллельно с основным опытом заражают 40 интактных мышей используемой вирулентной культурой четырьмя дозами с пятикратным шагом. После заражения наблюдение за экспериментальными животными проводят в течение 14-17 суток, ежедневно учитывая гибель и паралич мышей. По окончании опыта высчитывают процент выживших животных. Эффективными считаются вакцины, защищающие не менее 70% животных, взятых в опыт. Этому способу свойственны следующие недостатки: длительность срока исследования, значительное количество экспериментальных животных, большой расход испытуемых коклюшных вакцин, а также низкая точность и воспроизводимость, вызванные вариабельностью индивидуальных показателей у беспородных белых мышей.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа, сокращение сроков исследования, расхода испытуемых вакцин и использования лабораторных животных.

Эта цель достигается путем постановки реакции нейтрализации антигена с испытуемыми коклюшными вакцинами, обработанными низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц) в течение 5 минут, с эритроцитами, сенсибилизированными коклюшным токсином (КТ) и гипериммунной сывороткой против КТ для количественного определения КТ в испытуемых коклюшных вакцинах. По количеству содержания КТ в испытуемых коклюшных вакцинах оценивают их иммуногенную активность.

Использование в качестве индикатора иммуногенных свойств коклюшных вакцин количество коклюшного токсина (КТ), содержащееся в них, обусловлено тем, что КТ является основной биологически активной субстанцией коклюшного микроба, обеспечивающей активную защиту организма против коклюшной инфекции (“Коклюш” ААР 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases, 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p.439; Wendy A. Keitell M.D. “Новые вакцины и новые вакцинные технологии” Infect. Dis. Clin of Noth America, V 13, №1, 1999, р.83-84).

Предлагаемый способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин осуществляется следующим образом

Испытуемую коклюшную вакцину, приготовленную по МРТУ 42-263-68 (Межреспубликанские технические условия, утвержденные Минздравом СССР, 1968), содержащую 500 млрд.м.т. в 1 мл обрабатывают низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц) с амплитудой колебания волновода-дезинтегратора 10-30 мкм при экспозиции воздействия 5 минут и помещают в шуттель-аппарат на 1 час при комнатной температуре для равномерного перемешивания и более полного выхода биологически активных субстанций из коклюшного микроба. Обработанную таким образом вакцину разводят до концентрации 20 млрд.м.т. в 1 мл изотоническим раствором хлорида натрия (стандартное разведение коклюшных вакцин, применяемое в практике вакцинопрофилактики) и ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг) с эритроцитами, сенсибилизированными коклюшным токсином (КТ) и гипериммунной сывороткой против КТ. Обнаружение КТ в количестве от 15 мкг/мл по титру, выявляемому в РНАг, пересчитывают количество Кт в мкг на 1 мл испытуемой вакцины

Обработку коклюшных вакцин низкочастотным ультразвуком применяют для обеспечения наиболее полного выхода КТ из бактериальной клетки, с целью полноценной оценки иммуногенных свойств испытуемых препаратов. Для этого используют низкочастотный ультразвук (42-50 кГц) с амплитудой колебания волновода-дезинтегратора 10-30 мкм, при экспозиции воздействия 5 минут. Выбор такого режима обусловлен тем, что низкочастотный ультразвук имеет значительные преимущества по сравнению с высокочастотным ультразвуком, так как позволяет уменьшить акустическую мощность воздействия, увеличивая экономичность воздействия. Кроме того, низкая трансформация энергии из акустической в тепловую позволяет предотвратить инактивацию коклюшного токсина, в состав которого входят белковые субстанции, в процессе ультразвукового воздействия (Ф.И.Брагинская “Количественные закономерности действия ультразвука на биомолекулы и клетки, и ультразвуковая спектроскопия биологических структур”. Автор. докт. диссерт. - М., 1981 г.).

Особенности постановки реакции нейтрализации антигена для определения количества коклюшного токсина в коклюшных вакцинных препаратах.

Все серологические реакции ставят в микротитраторе “Такачи”, в объеме 0,025 мл.

Перед постановкой РНАг ставят реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с эритроцитами, сенсибилизированными КТ коклюшных микробов и гипериммунной сывороткой против КТ для определения двух гемагглютинирующих единиц гипериммунной сыворотки. Так, если титр гипериммунной сыворотки в РПГА составляет 1:640, то две гемагглютинирующие единицы (2 ГЕ) соответствуют ее разведению 1:320. Затем титруют исследуемую коклюшную вакцину и к ней в каждое разведение добавляют 2 ГЕ гипериммунной сыворотки, смесь выдерживают в термостате в течение 30 минут, после чего добавляют эритроциты, сенсибилизированные коклюшным токсином, по капле в каждую лунку. Учет реакции производят через 1,5-2 часа. Параллельно с этой реакцией титруют стандартный препарат коклюшного токсина (ОСО-42-28-186-90 - отраслевой стандартный образец коклюшного токсина, производства Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова), содержащий 100 мкг КТ в 1 мл, и также к каждому его разведению добавляют 2 ГЕ гипериммунной сыворотки против КТ. После 30-минутного выдерживания в термостате в каждую лунку по капле вносят эритроциты, сенсибилизированные КТ. Пересчет обнаруженного КТ в коклюшной вакцине на микрограммы производят следующим образом: т.к. в 1 мл КТ-ОСО содержится 100 мкг препарата, то в 0,025 мл (объем реакции) содержится 2,5 мкг КТ - 1-я лунка, во 2-й - 1,25 мкг, в 3-й - 0,625, в 4-й - 0,31, в 5-й - 0,15, в 6-й - 0,07, в 7-й - 0,035, в 8-й - 0,017, в 9-й - 0,008, в 10-й - 0,004 мкг и т.д. Если конец реакции приходится на 9-ю лунку, то это означает, что 2 ГЕ гипериммунной сыворотки против КТ связывают 0,008 мкг коклюшного токсина. В исследуемой коклюшной вакцине конец реакции определяют в 7-й лунке - значит в этой лунке содержится 0,008 КТ, в 6-й - 0,016, в 5-й - 0,031, в 4-й - 0,062, в 3-й - 0,124, во 2-й - 0,25, в 1-й - 0,5 мкг КТ. Поскольку коклюшную вакцину титровали в объеме 0,025 мл, что в 40 раз меньше 1 мл, то выявленное количество КТ в РНАг умножают на 40 (0,5×40=20 мкг) и получают количество КТ, содержащееся в 1 мл испытуемой коклюшной вакцины.

С целью отработки параметров предлагаемого способа были проведены соответствующие исследования. В этих опытах использовали коклюшные вакцины, приготовленные в соответствии с МРТУ 42-263-68, из производственных штаммов коклюшных бактерий, полученных из коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (г. Москва). Высокоиммуногенные коклюшные вакцины были приготовлены из штаммов 267 и 305, со средней защитной активностью - из шт. 475 и 703, и слабоиммуногенная - из шт. 298. Иммуногенные свойства коклюшных вакцин изучали методом, описанным в прототипе (Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий, М. 1987, с.18-28) и предлагаемым способом.

Результаты исследования представлены в таблице 1. Как видно из полученных данных, высокоиммуногенные вакцины, полученные из штаммов 267 и 305, защищали от 90% до 95% животных, взятых в опыт, и содержали от 18±1,45 до 22±1,13 мкг/мл коклюшного токсина. Коклюшные вакцины со средней защитной активностью защищали от 75% до 80% животных и содержали от 15±1,2 до 17±1,37 мкг/мл КТ. Низкоиммуногенная коклюшная вакцина из шт. 298 защищала лишь 65% экспериментальных мышей и содержала всего 4,5±0,98 мкг/мл коклюшного токсина.

С целью доказательства возможности использования способа по предложенному назначению были проведены соответствующие исследования.

В опытах использовали 19 серий АКДС-вакцины (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина) производства Ташкентского НИИВ (№№ 63, 65, 68, 83, 89, 96, 98, 102) и одна серия АКДС-вакцины НИИВС им. И.Н.Мечникова АМН СССР (№563), которые применяются в практике вакцинопрофилактики. С вышеуказанными вакцинами поставили реакцию нейтрализации антигена с эритроцитарным диагностикумом, содержащим КТ, и гипериммунной сывороткой против КТ, и произвели подсчет количества КТ, содержащегося в них. Как видно из таблицы 2, производственные серии АКДС-вакцины содержали разное количество КТ, которое колебалось от 8,4±0,81 до 24±1,22. Затем у этих серий АКДС-вакцин проверили иммуногенные свойства по методу, описанному в Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий (М., 1987, с.18-28).

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что коклюшные вакцины серий 63 и 67, содержащие низкое количество КТ (8,4±0,81 и 10,2±0,45 мкг/мл соответственно) защищали всего 20-40% животных, взятых в опыт, а коклюшные вакцины серий 83, 89, 102, 563, содержащие от 22±0,33 до 24±1,22, защищали от 90% до 95% экспериментальных животных.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно утверждать, что предлагаемый способ адекватно позволяет оценивать защитную активность коммерческих коклюшных вакцин по количественному содержанию в них коклюшного токсина.

На основании полученных данных выявлен ряд отличительных признаков предлагаемого способа по сравнению с прототипом, которые представлены в таблице 3.

Таким образом, как видно из таблицы 3, предлагаемый способ по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами: на 27 суток сокращается срок исследования, в 1000 раз - стоимость эксперимента за счет исключения использования лабораторных животных, в 4000 - расход испытуемых коклюшных вакцин, а также существенно упрощается трудоемкость процесса.

Изобретение относится к области здравоохранения, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано для оценки иммуногенных свойств коклюшных вакцин, выпускаемых в серийное производство. Способ обеспечивает сокращение сроков исследования, расхода испытуемых вакцин и исключение использования лабораторных животных. Испытуемую коклюшную вакцину обрабатывают низкочастотным ультразвуком 42-50 кГц в течение 5 минут, ставят реакцию нейтрализации антигена с эритроцитами, сенсибилизированными коклюшным токсином и гипериммунной сывороткой против коклюшного токсина, и определяют количество коклюшного токсина и при его значении от 18±1,45 мкг/мл и выше оценивают испытуемую вакцину как высокоиммуногенную. 3 табл.

Способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин, отличающийся тем, что испытуемую коклюшную вакцину обрабатывают низкочастотным ультразвуком 42-50 кГц в течение 5 мин, ставят реакцию нейтрализации антигена с эритроцитами, сенсибилизированными коклюшным токсином и гипериммунной сывороткой против коклюшного токсина и определяют количество коклюшного токсина и при его значении от (18±1,45) мкг/мл и выше оценивают испытуемую вакцину как высокоиммуногенную.