ИММУНОСТИМУЛЯТОР Российский патент 1997 года по МПК A61K39/39 A61K31/12 

Изобретение относится к области медицины, в частности иммунофармакологии.

Для коррекции иммунодефицитного состояния, например при заболеваниях различной этиологии, связанных со снижением функциональной активности и количества В-лимфоцитов, возникает необходимость стимуляции гуморального звена иммунного ответа.

Известно применение в качестве иммуностимуляторов препаратов вилочковой железы, из костного мозга, интерлейкинов, интерферона, фактора некроза опухоли, полисахариды и др. Наибольшей активностью на антителогенез, в частности, на IgM продукцию, обладают препараты миелоидной природы (костномозгового происхождения). Однако биологические препараты получают сложными способами, имеют ограниченный срок хранения, требуют особых условий хранения и при промышленном производству затруднено получение партий с идентичными активностями от партии к партии.

Известно также использование в качестве иммуностимуляторов химических соединений, среди которых наиболее доступны левамизол, тималин, продигиозан, нуклеинат натрия, пирогенал.

Широко используемым в медицине иммуностимулятором является левамизол. Однако левамизол стимулирует преимущественно клеточный иммунитет, стимулирующий эффект проявляется при длительном введении, кроме того, он является достаточно токсичным соединением.

Наиболее близким к предлагаемому соединению по структуре и назначению является иммуностимулирующий препарат кемантан (5-оксиадамантан-2-он). В дозе 50 мг/кг кемантан увеличивает количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и ускоряет отторжение аллотрансплантата у мышей, отличающихся по сильному локусу гистосовместимости. При лечении больных кемантаном увеличиваются показатели клеточного иммунитета (Е-РОК-клетки, образующие розетки с эритроцитами барана (ЭБ), ЕАК-РОК клетки, образующие розетки с эритроцитами барана, нагруженные комплементом, РБТ реакция бласттрансформации лимфоцитов с фитогемагглютинином). Он дает положительный эффект при лечении иммунодефицитных заболеваний, не поддающихся воздействию известных иммуностимулирующих средств, и не дает побочных явлений в отличие от известных стимуляторов.

Кемантан, как нами было установлено, стимулирует образование и функциональную активность IgM продуцирующих клеток, только до введения антигена, т. е. не влияет на антигензависимую фазу гуморального иммунитета.

В литературе нет сведений о химических препаратах, направленно действующих на гуморальный иммунитет, в том числе на его антигензависимую фазу.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала иммуностимуляторов, используемых в медицине.

Технический результат, который может быть получен от использования предлагаемого иммуностимулирующего средства, повышение стимулирующего влияния на гуморальный иммунитет за счет проявления стимулирующего действия 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она как в индуктивную, так и в продуктивную фазы иммунного ответа, т. е. обеспечение стимулирующего влияния и на антигензависимую фазу гуморального ответа.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в применении 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она впервые в качестве иммуностимулирующего средства.

Брутто формула: C₁₀H₁₄O₃. Вычислено, 65,91 С; 26,34 H. Найдено, 65,82 C; 26,30 H.

Химический синтез 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она осуществляют в 2 стадии: получение 5-оксиадамантан-2-она путем гидроксилирования 2-адамантанона трехокисью хрома в уксусной кислоте и его последующая лактонизация (реакцией Байер-Виллигер) с помощью 30%-ной перекиси водорода в щавелевой или трифторуксусной кислоте. Выделение промежуточного и конечного продуктов осуществляют, используя экстракцию органическими растворителями с последующей кристаллизацией продукта.

4-Oксагомоадамантан-1-ол-5-он может быть получен микробиологической трансформацией 2-адамантанона с помощью бактерий рода Pseudomonas, содержащих камфоpную плазмиду и выращенных на питательной среде с камфорой. Микробиологический способ позволяет увеличить выход продукта по сравнению с химическим и упростить его за счет осуществления гидроксилирования и лактонизации в одну технологическую стадию.

Свойства:
4-Oксагомоадамантан-1-ол-5-он представляет собой белое кристаллическое вещество, хорошо растворимое в воде, температура плавления 336-337^oC, УФ - спектр (λ_max):: 213,7 нм (в 95%-ном этаноле).

Масс-спектр: 182 (3, м⁺), 138(5), 95(100), 82(27), 79(12).

¹H-ЯМР-спектр (м. д.): 4,59 (1Н), 3,12(1Н); 2,39(1Н); 2,09-1,72 (1-ОН). ¹³С-ЯМР-спектр (м.д.): 177,83 (С=0); 74,37; 66,51; 41,44; 30,26 (СН), 43,59; 42,04; 38,72; 34,59; 29,77; 29,56 (СН₂).

Стоек при хранении в обычных условиях не менее 3 лет.

Структурная формула и химический способ получения предлагаемого в качестве иммуностимулятора вещества ранее были описаны. На микробиологический способ получения подана заявка N 4912925/13 (015381). "Способ получения 4-оксагмооадамантан-1-ол-5-она", решение о выдаче патента от 12.05.92 г. Однако о практическом применении 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она сведений не имеется.

В литературе не описаны аналогичные по структуре соединения, влияющие на антигензависимую фазу гуморального иммунитета.

Иммунотропную активность 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она изучали на моделях гуморального иммунитета и сравнивали с активностью нового отечественного препарата кемантана, наиболее близкого из известных химических иммуностимуляторов по строению, а также с активностью иммуностимулятора химической природы левамизола (Венгрия), широко применяемого в клинике и эксперименте и рекомендованного Фармкомитетом для сравнения при испытании новых химических иммуностимуляторов.

Иммуностимулирующий эффект 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она оценивали через его влияние на количество антител в периферической крови и функциональную активность В-лимфоцитов, продуцирующих антитела у мышей с нормальным иммунным статусом и вторичным иммунодефицитным состоянием, методом прямого локального гемолиза по изменению количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки.

Показано, что 4-окксагомоадамантан-1-ол-5-он имеет более высокий стимулирующий эффект на гуморальный иммунитет по сравнению с кемантаном за счет проявления стимулирующего влияния как в индуктивную, так и в продуктивную фазы иммунного ответа, т. е. влияет на антигензависимую фазу гуморального ответа.

Пример 1. Определение иммунотропной активности 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она.

Мышей иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ), в количестве 2х10⁸. Испытуемый 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-он вводили три раза по двум схемам: до иммунизации (-2, -1, 0) и после иммунизации (0, +1, +2). Контрольных мышей иммунизировали и обрабатывали физиологическим раствором. Испытаны 3 дозы заявляемого соединения 50, 100 и 200 мг/кг. На 5 сутки после иммунизации мышей забивали и подсчитывали количество АОК на 10 клеток селезенки по числу зон гемолиза антигена, помещенного вместе с клетками селезенки в агарозный гель. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемое соединение обладает иммунотропной активностью, стимулируя В-лимфоциты нормальных мышей. Эффективными являются дозы 50, 100, 200 мг/кг веса при введении 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она как до, так и после антигенного стимула.

Пример 2. Определение иммунотропной активности эталонных препаратов.

В качестве препаратов-эталонов использовали иммуностимуляторы кемантан и левамизол. Дозы препаратов (кемантан 50 и 100 мг/кг и левамизол 2,5 мг/кг) применены с учетом их активности.

При испытании эталонных препаратов мышей иммунизировали, обрабатывали этими препаратами, осуществляли постановку иммунологических тестов также, как и при испытании 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она. Все условия полностью идентичны изложенным в примере 1. Результаты представлены в таблице 2.

Приведенные в таблице 2 данные подтверждают литературные cведения о том, что левамизол не является стимулятором гуморального иммунного ответа, не влияет на число АОК в селезенках иммунизированных ЭБ мышей. Действие кемантана на количество АОК зависит от времени его введения по отношению к антигенной стимуляции. Кемантан, введенный мышам до иммунизации, статистически достоверно повышает количество IgM секретирующих клеток селезенки. Кемантан, введенный после иммунизации, не приводит к достоверному изменению количества АОК (Р>0,05).

Пример 3. Определение влияния 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она на иммунный статус мышей с вторичным В-дефицитом.

Индукцию вторичного иммунодефицитного состояния проводили путем внутрибрюшинного введения мышам 150 мг/кг циклофосфана (ЦФ) ("Биохим", Москва) однократно за сутки до иммунизации животных. Контрольным животным вводили только антиген ЭБ. По степени снижения IgM продуцирующих клеток в селезенке подопытных мышей по сравнению с контролем судили о выраженности вторичного иммунодефицита. Одной группе животных, обработанных УФ, трехкратно после иммунизации вводили 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она в дозе 100 мг/кг. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

На 5 сутки после иммунизации в селезенках мышей, обработанных только ЦФ, наблюдалось снижение АОК. 4-оксогомоадамантан-1-ол-5-он в дозе 100 мг/кг, введенный иммунодефицитным животным после антигенного стимула, обеспечивает статистически достоверное увеличение антителообразующей функции В-лимфоцитов.

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что заявляемое соединение проявляет иммуностимулирующую активность на модели вторичного иммунодефицита, способствуя восстановлению функциональной активности B-лимфоцитов после иммунодепрессивного действия циклофосфана.

Пример 4. Определение влияния эталонных препаратов на иммунный статус мышей с вторичным В-дефицитом.

Испытания осуществляли как описано в примере 3, но группе животных, обработанных ЦФ, трехкратно после иммунизации ЭБ вместо 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она вводили эталонные препараты левамизол или кемантан (см. табл. 4).

Результаты опыта, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что кемантан, введенный иммунодефицитным животным, стимулирует антителообразующую функцию В-лимфоцитов. Левамизол на модели вторичного иммунодефицита стимулирующего действия не проявил.

Пример 5. Влияние 4-оксагомоадамантан-5-она на титры антител в периферической крови мышей.

Титр антител в сыворотке крови оценивали в тесте гемагглютинации. Мышей иммунизировали ЭБ. Животных опытной группы обрабатывали 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-оном в дозе 100 мг/кг трижды, начиная со дня иммунизации. Забор крови у животных проводили на 7 сутки после иммунизации. В полученной сыворотке с помощью микротитратора "Такачи" (Венгрия) определяли титры гемагглютининов. Результаты титрования выражали в log₂ в обратных величин титров антител и подсчитывали индекс действия 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она как отношение средних величин титров антител в опыте к контролю. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 следует, что заявляемое соединение достоверно повышает количество антител в крови при введении его в дозе 100 мг/кг после антигенного стимула.

При обработке мышей кемантаном и левамизолом в сыворотке крови титровалось такое же количество гемагглютининов, как и у контрольных животных (таблица 6).

Основываясь на приведенных в таблице 6 данных, можно заключить, что кемантан и левамизол не влияют на антигензависимую фазу гуморального ответа.

Таким образом, применение 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она в качестве иммуностимулирующего средства, в частности как стимулятора гуморального иммунного ответа для коррекции иммунодефицитного состояния, расширяет арсенал иммуностимуляторов, используемых в медицине для лечения заболевания различной этиологии, связанных со снижением функциональной активности и количества В-лимфоцитов.

По сравнению с наиболее эффективным из известных химических средств кемантаном 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-он обладает повышенным стимулирующим влиянием на гуморальный иммунитет за счет проявления стимулирующего действия как в индуктивную, так и в продуктивную фазы иммунного ответа, т.е. влияния и на антигензависимую фазу гуморального ответа, что дает основание предполагать возможность его использования в качестве иммунокорректора в случае неэффективности других иммуностимуляторов.

(57) Использование: медицина, для коррекции иммунодефицитного состояния при лечении заболеваний разной этиологии, связанных со снижением функциональной активности и количества β-лимфоцитов. Сущность изобретения: применяют 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-она в качестве стимулятора гумарольного иммунитета, воздействующего на антигензависимую фазу гумарального ответа. 6 табл.

1 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-он, обладающий иммуностимулирующей активностью.