ПОЛИПЕПТИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ ТКАНИ ИЛИ СЕКРЕТА ПИЯВОК HIRUDINARIA MANILLENSIS, СПЕЦИФИЧЕСКИ ИНГИБИРУЮЩИЙ ТРОМБИН Российский патент 1995 года по МПК A61K38/04 A61K38/08 

Изобретение относится к новым антитромбинам, в частности антитромбинам, выделенным из ткани и секретов пиявки.

Гирудин хорошо известный и хорошо описанный полипептид, известный тем, что он специфичен по отношению к тромбину, его получают как экстракт из пиявок вида Hirudo medicinalis. Полипептид имеет относительно низкую молекулярную массу (примерно 7000) и включает 65 аминокислот. Последовательность аминокислот в первичной структуре гирудина была установлена Dodt, Мuller, Seemuller и Chang "Полная последовательность аминокислот гирудина, специфического ингибитора тромбина", FEBS, 1984, 165, с. 180-184:

Были описаны еще две разновидности гирудина и определена аминокислотная последовательность. Первый вариант описан Dodt, Machleidt, Seemuller, Maschler и Fritz. Выделение и описание изоингибиторов гирудина и определение последовательности аминокислот гирудина РА. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1986, 367, р. 803-811. Этот вариант отличается от описанного ранее тем, что в нем имеются следующие перестановки:
1. ile в положении 1 вместо val
2. thr в положении 2 вместо val
3. lys в положении 24 вместо gln
4. asn в положении 33 вместо asp
5. lys в положении 35 вместо glu
6. gly в положении 36 вместо lys
7. asn в положении 47 вместо lys
8. glu в положении 49 вместо gln
9. asn в положении 35 вместо asp
Второй вариант описан в работе Harvey, Degryse, Stefani и др. Клонирование и выделение сДНК, кодирующей антикоагулянтный гирудин, из кровососущей пиявки Hirudo medicinalis. Proc, Nat, Acad. Sci. USA, 1986, с. 1084-1088. Этот вариант идентичен первому варианту в положениях 1-32, но имеются следующие отличия:
1. gln в положении 33 вместо asp
2. lys в положении 35 вместо glu
3. asp в положении 36 вместо lys
4. gln в положении 53 вместо asp
5. pro в положении 58 вместо glu
6. asp в положении 62 вместо glu
7. asp в положении 64 вместо leu
8. glu в положении 65 вместо gln
Гирудин был выделен из пиявок вида Hirudo medicinalis, Hirudinaria manillensis, как и Hirudo medicinalis способна питаться кровью амфибий и млекопитающих. Однако в отличие от Hirudo medicinalis Hirudinaria в эволюционном плане более развита. Нельзя с достаточной степенью определенности предсказать наличие или отсутствие активного вещества, присутствующего в секретах пиявки первого вида и в других видах, а если вещества, обладающие такой активностью обнаружены, то утверждать, что они обладают такой же последовательностью аминокислот или заметно отличающейся последовательностью тоже нельзя.

В настоящее время мы изолировали новый антитромбин из Hirudinaria manillensis, антитромбин, имеющий следующую последовательность аминокислот:

(в этой последовательности Х, Y и Z представляют любой аминокислотный остаток, D cys или pro, Е glu или asp или гистидин, F представляет asp, trp или lys, * обозначает положения в молекуле антитромбина, которые отличаются от первого варианта гирудина.

Сравнение с последовательностью аминокислот гирудина показывает, что примерно на 62% они гомологичны (что составляет разницу примерно 38%), это удивительно большое различие. В частности, имеются существенные различия в С-концевых аминокислотах и далее следуют эти четкие различия:
в положении 13 / tir вместо len
в положении 17 / val вместо glu
в положении 24 / glu вместо glu
в положении 26 / asp вместо asn
в положении 27 / asn вместо lys
в положении 29 / asn вместо ile
в положении 30 / pro или lys вместо len
в положении 31 / gln вместо gly
в положении 32 / leu вместо ser
в положении 33 / ser вместо asp
в положении 34 / ser вместо gly
в положении 35 / ser вместо gly
в положении 36 / glu вместо lys
в положении 41 / glu или asp или his вместо thr
в положении 47 / asp -, lys или trp вместо pro
в положении 51 / gln вместо his
в положении 52 / thr вместо asn
в положении 53 / glu вместо asp
в положении 61 / asp вместо glu
в положении 64 / ile вместо leu и
в положении 65 / lys вместо gln
Различия в положениях 61 (аспартат вместо глутамата), 64 (изолейцин вместо лейцина) и 65 (лизин вместо глутамина) считаются особо важными, поскольку полагают, что участок последовательности 55-64 является критической областью, ответственной за ингибирующее действие гирудина.

Наличие аспартата (- asp -), изолейцина (- ile -) и лизина (- lys -) в антитромбине согласно изобретению приводит к новой области, ингибирующей тромбин. Полагают, что отличная от других последовательность 54-65 должна быть новой по своему действию и обладать новыми антитромбиновыми свойствами. Следовательно, новый антитромбин включает небольшой белок (пептид), имеющий последовательность 54-65, которая определена выше.

Аминокислота в положении 63 (представлена в приведенной формуле) может представлять тирозин (tir), который, как правило, содержит сульфогруппу (рекомбинантный гирудин, как правило, не сульфирован в этом положении).

Выделенный из пиявки антитромбин согласно изобретению (и соответствующие ДНК последовательности, которые могут экстраполированы на этой основе) не является гомологом эглина, который известен как ингибитор эластазы и химотрипсина, известно, что он присутствует в медицинских пиявках Hirudo medicinalis.

Согласно изобретению, антитромбин выделяют либо из ткани пиявок вида Hirudinaria manillensis по методике, включающей экстрагирование растворителем с последующим фракционированием методом хроматографии или аналогичной методике, либо его можно выделить аналогично образом из секретов (таких как слюна) Hirudinaria manillensis.

Согласно изобретению, обеспечивается выделение антитромбина из ткани или секретов пиявок вида Hirudinaria manillensis. Антитромбин специфичен в отношении тромбина.

Кроме того, изобретение включает получение рекомбинантного или синтезированного белкового эквивалента полипептида, формула которого приведена выше.

Антитромбин может быть использован в фармацевтических композициях вместе с подходящим фармацевтически приемлемым носителем или средой. Такой состав обычно используется для внутривенного введения (в этих случаях в качестве носителя (среды) применяют стерильный физиологический раствор или воду приемлемой чистоты). Антитромбин согласно изобретению можно использовать для лечения тромбоэмболии, вызванной коагуляцией крови. В одном из вариантов антитромбин вводили вместе с плазминогенным активатором, таким как тканевый плазминогенный активатор; было найдено, что антитромбин совместим с последним.

П р и м е р 1. Стадия 1 экстракция ацетоном. 600 г пиявок вида Hirudinaria manillensis дегидратировали в течение примерно 24 ч в 2 л 96%-ного этилового спирта. Переднюю часть отделили от остальной части тела и затем еще дегидратировали в течение 24 ч в 200 мл 96%-ного этилового спирта.

Дегидратированные головы пиявок были тщательно разделены на маленькие кусочки и к ним была добавлена смесь 40 мл ацетона и 60 мл воды. Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, центрифугировали в течение 15 мин при 2,700 rpm и декантировали верхний слой.

Осадок вновь разбавили смесью, содержащей 40 мл ацетона и 60 мл воды, взболтали и перемешали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем полученную смесь центрифугировали в течение 15 мин при 2,700 rpm, верхний слой декантировали и соединили с первоначально слитым верхним слоем. К собранному сливу добавили 80 мл ацетона и 20 мл воды и довели значение рН до 4,4, добавляя уксусную кислоту.

Полученную смесь центрифугировали при 2,700 rpm в течение 15 мин и верхний всплывший слой декантировали. Добавляя 30%-ный раствор аммиака, довели рН этого раствора до 6,0. Объем смеси уменьшили примерно до 30 мл, испаряя растворитель на роторном испарителе при 35^оС. Для того, чтобы довести значение рН смеси до 1,8, к ней добавили кристаллическую трихлоруксусную кислоту, затем центрифугировали, чтобы удалить осадок. Неочищенный антитромбин осадили из раствора, используя 9-кратный по объему избыток ацетона.

Смесь центрифугировали при 2,700 rpm в течение 15 мин, после чего верхний слой отбросили. Остаток ресуспендировали в 50 мл ацетона и процентрифугировали при 2,7000 rpm в течение 10 мин; промывные воды были отброшены, а осадок сушили в течение 1 ч в вакуумном эксикаторе. Неочищенный антитромбин был восстановлен в 4 мл воды.

Концентрация протеина, определенная при длине волны 280 нм, составила 78 мг/мл. Активность, определяемая по предотвращению образования тромбин/фибриногеновых сгустков составила 2400 антитромбиновых (АТЕ) на 1 мл или примерно 10,000 АТЕ на 200 г отрубленных голов). Общая активность 9600 АТЕ а специфическая активность по расчетам составила 30,7 АТЕ на 1 мг белка.

Стадия 2 экстракция этиловым спиртом.

Неочищенный раствор антитромбина охладили до 3^оС. Шесть порций аликвот по 1,2 мл охлажденного льдом 96%-ного этилового спирта добавляли с 5-минутным интервалом. После этого смесь оставили еще на 10 мин при 3^оС, после этого смесь центрифугировали при 2,400 rpm в течение 10 мин; верхний слой декантировали и оставили.

Остаток ресуспендировали в 4 мл охлажденной льдом дистиллированной воды, затем смешали с 7,2 мл охлажденного льдом этилового спирта. Полученную смесь оставили стоять при 3^оС в течение 30 мин и затем центрифугировали при 2,400 rpm в течение 10 мин. Верхний слой декантировали и соединили с начальным верхним слоем.

Осадок ресуспендировали в смесь 4 мл охлажденного льдом 96%-ного этилового спирта и оставили стоять в течение 30 мин при 30^оС. Полученную смесь после этого центрифугировали при 2,400 rpm в течение 10 мин, верхний слой декантировали и объединили с предыдущими слитыми слоями.

Объединенные слитые слои охладили до 0^оС на льду, а затем при -10^оС, добавили 50,7 мл этилового спирта, содержащего 0,5% ацетата аммония. Эту смесь оставили на 30 мин, после чего ее отцентрифугировали при 2,400 rpm в течение 10 мин.

Верхний слой отделили, а осадок промыли 50 мл охлажденного льдом этилового спирта. После этого осадок сушили в течение часа в вакуумном эксикаторе.

Полученный осадок восстановили (ренатурировали) в воде для определения антитромбиновой активности, содержания белка, затем перелили в ампулу и выморозили растворитель; конечный объем составил 1,5 мл.

Определение белка провели, определяя поглощение на длине волны 280 нм, концентрация белка составляла 19 мг/мл.

Активность определяли в опытах по тромбин/фибриногенному свертыванию крови, и она составила 1000 АТЕ/мл. Специфическая активность по расчетам составила 52,6 АТЕ/мг белка.

П р и м е р 2. Стадия 1 примера была повторена, затем провели стадии 2 и 3 следующим образом.

Стадия 2 катионно-обменная хроматография.

Неочищенный антитромбин восстановили (ренатурировали), добавив 10 мМ буфера ацетат аммония уксусная кислота, рН 4,0, после чего отфильтровали нерастворившийся остаток.

Гель карбоксиметил целлюлозы торговой марки СМ Сефадекс С 50 оставили набухать в буферном растворе (10 мМ ацетат аммония уксусная кислота, рН 4,0), после этого упаковали (набили) колонку длиной 30 см и диаметром 2,6 см. Образец пропустили через колонку. Колонку промыли 100 мл буферного раствора и промывные воды отбросили. Затем буферный раствор заменили на 10 мМ раствор ацетата аммония, рН 4,2. После этого промывные фракции объемом 10 мл и в каждой определяли антитромбиновую активность и содержание белка. Расчитывали специфическую активность каждой фракции, и фракции, специфическая активность которых превышала пороговый уровень, собирали вместе, после чего их заморозили и подвергли сушке вымораживанием.

Стадия 3 анионно-обменная хроматография.

Лиофилизованный сухой экстракт, полученный либо путем экстрагирования этанолом, либо после экстракции на СМ Сефадексе, восстановили (ренатурировали), добавив к нему 10 мМ буферного раствора Трис/НСl, рН 7,5, после этого прохроматографировали на колонке ДЕАЕ-Сефадекс А-25 (0,9х7 см), колонку промывали тем же буферным раствором. Буферный раствор пропускали со скоростью 15 м/ч до тех пор, пока поглощение сточных вод при длине волны 234 нм оставалось ниже 0,15. После этого связанный материал промывали (элюировали) равновесным буферным раствором, линейный градиент хлорида натрия 0 1 М (в каждом резервуаре для промывки содержалось 60 мл). Сточные воды отбирали в 2 мл фракции, в каждой из которых определяли поглощение и измеряли ингибирующую активность. Профиль элюирования, полученный для материала, который был экстрагирован этанолом, представлен на фиг. 1, а для материала, который был получен путем экстрагирования на СМ Сефадексе на фиг. 2.

Фракции, обладающие антитромбиновой активностью были собраны вместе, сконцентрированы и подвергнуты обессоливанию на Сефадексе G-25, прежде чем были подвергнуты дальнейшей очистке. Частично очищенный образец фракционировали далее методом афинной хроматографии, используя тромбин Сефарозу. Колонку промывали равновесным буферным раствором (0,1 м Трис/НСl, рН 8,0), и связанный антитромбин элюировали 1 М бензамидином. Элюат лиофилизовали и обессолили, как и раньше. Полученный материал затем очистили, используя метод ВДЖХ/ВЭЖХ высокоэффективной жидкостной хроматографии); 50 мкл концентрированного образца ввели в микроотверстие Р-300 С-8 колонки (3х0,21 см), предварительно обработанной 0,1%-ным раствором тетрагидрофурана при комнатной температуре. Связанный материал проэлюировали в линейном градиенте 0 100% 60%ного ацетонитрила, содержащего 0,09% тетрагидрофурана. Процесс элюирования проводили в течение 35 мин со скоростью потока 0,25 мл/мин. Непрерывно проводили определение поглощения сточных вод при длине волны 215 нм. Все фракции, обладающие поглощением при этой длине волны (каждый пик) отбирали в виде отдельных фракций для изменения их ингибирующей активности.

Профиль элюирования представлен на фиг. 3. Пики (фракции), содержащие антитромбиновую активность (пики 5, 6, 7), отделены от других пиков.

Определение последовательности.

Основные фракции, содержащие антитромбиновую активность (эквивалентны пикам 5, 6 и 7 на фиг. 3) были высушены в вакууме и проанализированы на последовательность аминокислот с N-конца на автоматическом газофазном анализаторе Аррlied Biosystems (Модель 470 А), соединенном с линейным аминокислотным анализатором (Модель 120) для идентификации РТН-аминокислот.

Очищенный образец антитромбина помещают непосредственно на фильтр для определения последовательности связей аминокислотных остатков. Остатки цистеина в последовательности были определены после превращения в пиридилэтилцистеин при взаимодействии очищенного образца с дитиотрейтолом и 4-винилпиридином.

Триптиновые осколки восстановленного и пиридилэтилированного антитромбина были получены после обработки ТРСК-трипсином. Реакция проводилась в 0,05 М аммоний-бикарбонатном буфере при 37^оС в течение 4 ч, реакцию остановили путем сушки при температуре ниже 0^оС и ресуспендировали в 0,1% тетрагидрофуран. Фрагменты были разделены на обратимой фазе ВЭЖХ при условиях, подобных тем, что описаны в примере 3, стадия 5.

Для определения последовательности аминокислот с С-конца использовали сочетание методов, включающих гидролиз в присутствии карбоксипептидазы У и методы ДАВS-Сl.

П р и м е р 3. Были повторены стадии 1 и 2 примера 2, затем последовали стадии 3 и 4.

Стадия 3 анионно-обменная хроматография.

Раствор из стадии 2 довели до рН 7.0, добавляя 0,1 М NaOH, после чего ввели в колонку, заполненную анионно-обменной смолой торговой марки Q-Сефароза, уравновешенной в 20 мМ Tris (НСl буфере, рН 7,0). Буферный раствор прокачивали через эту колонку до полного удаления несвязанного белка (определился по поглощении в УФ при длине волны 280 нм), после чего проводили элюирование связанного антитромбина в линейном градиенте соли (NaCl в том же буферном растворе) или ступенчато. Типичный профиль хроматографический приведен на фиг. 4.

Фракции, содержащие антитромбиновую активность, были собраны вместе и сконцентрированы ультрафильтрацией до объема 25-50 мл. В этом состоянии специфическая активность антитромбиновой пробы составила 100-400 АТЕ/мг белка.

Стадия 4 гель-фильтрация.

Раствор из стадии 3 перенесли на колонку для гель-фильтрации с Супердексом 200, уравновесили и проэлюировали системой 50 мМ Tris (HCl, 0,1 М NaCl, рН 7,5). Типичный хроматографический профиль приведен на фиг. 5.

Фракции, содержащие антитромбиновую активность были отобраны, соединены и лиофилизированы. В этом состоянии специфическая активность антитромбиновой пробы варьировалась от 1000-4000 АТЕ/мг белка.

Стадия 5 окончательная очистка.

Материал на стадии 4 перенесли на колонку для афинной хроматографии, заполненную тромбин-Сефарозой, уравновесили 0,1 М Tris (НСl буфером, рН 8,0 и несвязанный материал проэлюировали тем же самым буферным раствором. Элюцию связанного антитромбина из колонки провели 1 М раствором бензамидина, полученный элюат лиофилизовали и обессолили, используя для этих целей колонку из Сефадекса 25.

После очистки методом афинной хроматографии материал далее очищали, используя ВЭЖХ с колонкой, заполненной обратимой фазой (RP 300 C-8). В характерном примере (см. фиг. 6) образец вводили в колонку, уравновешенную в 0,1% -ном растворе трифторуксусной кислоты (ТФК) при комнатной температуре, а связанный антитромбин элюировали в линейном градиенте 60% ацетонитрила, содержащего 0,9% тетрагидрофурана. Фракции (соответствующие пикам белка, определяемого по поглощению на 215 и 280 нм УФ) были отобраны и те из них, которые обладали антитромбиновой активностью, были высушены в вакууме.

Опыты по определению активности антитромбина.

Антитромбиновую активность определяли путем измерения ингибирования процесса образования сгустков фибрина, катализируемого тромбином, или определяя ингибирующее действие на процесс расщепления тромбином специфических пара-нитрофенолпроизводных хромогенных субстратов, таких как S-238 (коммерчески поставляемых Каfi).

Активность антитромбина согласно изобретению не была нейтрализована моноклональными антителами, специфичными для гирудина (это является дальнейшим иммунологическим подтверждением того, что антитромбин по изобретению и гирудин отличны друг от друга).

Однако антитромбин, как и гирудин в эквивалентных дозах обладает одинаковым временем образования тромбопластин. Это свидетельствует о том, что антитромбин и гирудин обладают похожим антикоагулирующим действием в отношении человеческой крови.

Использование: медицина. Сущность изобретения: полипептид, выделенный из пиявок вида Hirudinaria manillensis, имеет следующую последовательность аминокислот: X-Y-тирозин-треонин-аспарагин- цистеин-треонин- глутамин-серин-глицин-глутамин-аспарагин-тирозин- цистеин-лейцин-цистеин- валин-глицин-серин-аспарагин-валин- цистеин-глицин-глутаминовая кислота-глицин-аспарагиновая кислота- аспарагин-цистеин-аспарагин-D- глутамин-лейцин-серин-серин-серин- глицин-аспарагин-глутамин- цистеин-валин-E-глицин-глутамин--- глицин-треонин- пролин-F-пролин-глутамин-глутамин-изолейцин- пролин-аспарагиновая кислота-глутамин-Z-изолейцин-лизин; в этой последовательности X любой аминокислотный остаток; Y любой аминокислотный остаток; Z любой аминокислотный остаток; D цистеин или пролин; E глицин или аспарагиновая кислота или ее гистидин; F - аспарагиновая кислота, лизин или триптофан, а также фармацевтически приемлемую соль, производное или биологический предшественник на этой основе. Полипептид, а также его фрагменты, представляют собой специфические антитромбины. 4 з. п. ф-лы, 6 ил.

1. ПОЛИПЕПТИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ ТКАНИ ИЛИ СЕКРЕТА ПИЯВОК HIRUDINARIA MANILLENSIS, СПЕЦИФИЧЕСКИ ИНГИБИРУЮЩИЙ ТРОМБИН и имеющий следующую аминокислотную последовательность:
gly asp phe glu glu ile pro asp glu Z ile lys
где Z любой аминокислотный остаток,
или его фармацевтически приемлемая соль, производное или предшественник. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что имеет следующую последовательность аминокислот:
X Y tyr thr asp cys thr glu ser gly gln asn tyr - cys leu cys val gly ser asn val cys gly glu gly asp - asn cys asn D gln leu ser ser ger gly asn gln cys val E gly glu gly thr pro F pro gln ser gln thr gln gly asp phs glu ile pro asp glu Z ile lys,
в которомм X аминокислотный остаток;
Y и Z аминокислотный остаток;
D cys или pto;
E glu или asp или his;
F asp, lys или trp,
или его фармацевтически приемлемая соль, производное или биопредшественник. 3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что X является val. 4. Полипептид по п. 1 или 2, отличающийся тем, что Y является ser. 5. Полипептид по любому из пп.1 4, отличающийся тем, что Z представляет tyr или его сульфированное производное.