ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к лечению кожных заболеваний клостридиальными нейротоксинами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кожа является самым большим органом в организме млекопитающих, обеспечивающим барьер, который защищает организм от внешнего раздражения и инфекций, а также предотвращает потерю воды. Кожа состоит из эпидермиса (внешнего слоя кожи), дермы и подкожной клетчатки. Наружный слой эпидермиса, роговой слой (РС), состоит из крупных, уплощенных, энуклеированных корнеоцитов и обогащенного липидами внеклеточного матрикса. Основные классы липидов, присутствующих в РС, включают жирные кислоты, холестерин, сквален и восковые сложные эфиры. Липиды продуцируются (например, выделяются) сальными железами, расположенными в коже, которые выделяют смесь таких липидов в виде кожного сала. Поэтому такие липиды называют сальными липидами.

Присутствие этих липидов необходимо для поддержания влажного, гибкого и здорового кожного барьера. Фактически, здоровая кожа зависит от оптимального профиля липидов для формирования барьера, который обеспечивает защиту и предотвращает чрезмерную потерю воды, способствует межклеточному взаимодействию и регулирует кожный гомеостаз и воспаление. Потеря липидов в профиле липидов кожи может приводить к серьезным последствиям для здоровья кожи и связана с воспалительными заболеваниями кожи. Изменение состава липидов в РС приводит к нарушению барьерных функций кожи и к увеличению трансэпидермальной потери воды (ТЭПВ). Повышение ТЭПВ наблюдали при многих кожных заболеваниях, таких как атопический дерматит (АД) и псориаз. Таким образом, потеря этих липидов (снижение качества липидного профиля кожного сала) может вызывать или служить предрасполагающим фактором развития кожного заболевания.

При избыточной продукции эти липиды (в виде кожного сала) могут привести к жирной коже и акне. Таким образом, доступные в настоящее время средства для обработки кожи (такие как средства на основе ретиноидов) направлены на снижение уровня кожного сала за счет поддержания достаточного уровня защитных кожных липидов, а также сопутствующих побочных эффектов, таких как ускоренное старение кожи, раздражение кожи (например, покраснение), обезвоживание и инфекция. Существует относительная нехватка способов лечения для повышения/поддержания уровней основных сальных липидов (например, для поддержания сбалансированного уровня, который обеспечивает защиту и увлажнение кожи, не приводя к возникновению акне или жирной кожи). Существующие способы лечения (такие как гормональная терапия с применением гормонов, влияющих на экскрецию кожного сала сальными железами) обычно имеют системное действие (не специфичное в отношении кожи) и, таким образом, могут вызывать нежелательные побочные эффекты.

Таким образом, существует растущая потребность в альтернативных/улучшенных способах лечения кожных заболеваний, в частности кожных заболеваний, возникающих в результате недостаточного уровня сальных липидов (например, недостаточного качества кожного сала).

Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы путем предоставления альтернативных и/или улучшенных способов индукции секреции/экскреции сальных липидов в эпидермисе.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что внутрикожное введение клостридиального нейротоксина (такого как ботулинический нейротоксин) приводит к повышению уровней важных защитных кожных сальных липидов в кожном сале эпидермиса. Клостридиальный нейротоксин не приводит обязательно к существенному изменению общего уровня кожного сала, что является преимуществом, поскольку повышенная секреция кожного сала считается главным фактором в патофизиологии акне. Таким образом, изобретение приводит к улучшению качества кожного сала, в результате чего кожное сало содержит более высокий относительный процент требуемых липидов, имеющих как терапевтическое, так и косметическое применение.

Это неожиданно, поскольку считается, что клостридиальные нейротоксины действуют путем ингибирования секреции молекул (например, путем расщепления полипептидов, участвующих в слиянии секреторных везикул с клеточной мембраной), не индуцируя или усиливая секрецию/экскрецию. Например, сообщали, что способы из предшествующего уровня техники, включающие подкожное введение ботулинического токсина, приводят к снижению уровня кожного сала в коже (что отличается от наблюдаемого в настоящем случае эффекта, обеспечиваемого внутрикожным введением, которое повышает уровни некоторых сальных липидов в коже, например, без существенного изменения общего уровня кожного сала). Участок внутрикожного введения (между эпидермисом и дермой) в большей степени периферический, чем участок подкожного введения (т.е. подкожный слой, расположенный под дермой). Состав (например, химический состав) этих слоев различается, и при этом предполагается (хотя и без ограничения теорией), что клостридиальный нейротоксин может воздействовать на сальные железы различными механизмами в зависимости от слоя кожи, в который его вводят, что приводит к разным эффектам. Авторы настоящего изобретения обнаружили ранее неизвестный эффект, возникающий в результате внутрикожного введения клостридиального нейротоксина (например, BoNT/A), а именно индукцию (например, увеличение) секреции/экскреции некоторых сальных липидов, как указано выше. Без ограничения теорией считается, что клостридиальный нейротоксин может взаимодействовать (положительно) с ферментами, которые катализируют продукцию этих липидов (например, при внутрикожном введении).

Ссылка на термины "важные кожные защитные сальные липиды", "требуемые липиды" и "некоторые сальные липиды", сделанная выше, означает один или больше из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, как более подробно описано ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Широкие аспекты изобретения включают любое из следующего:

- способ лечения кожного заболевания, включающий введение пациенту клостридиального нейротоксина, предпочтительно включающий внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина;

- клостридиальный нейротоксин для применения в способе лечения кожного заболевания, где указанный способ включает введение пациенту клостридиального нейротоксина, предпочтительно включает внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина;

- применение клостридиального нейротоксина в производстве лекарственного препарата для лечения кожного заболевания у пациента, предпочтительно для внутрикожного введения пациенту.

Широкие аспекты изобретения также включают любое из следующего:

- нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для косметической обработки кожей, предпочтительно включающее внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина;

- нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для стимуляции омоложения кожи, предпочтительно включающее внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина;

- косметический способ (косметической) обработки кожи, включающий введение пациенту клостридиального нейротоксина (предпочтительно включающий внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина).

После введения клостридиальный нейротоксин может индуцировать секрецию одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое кожи. Другими словами, клостридиальный нейротоксин может лечить такое состояние, индуцируя секрецию одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое кожи.

Примеры таких сальных липидов включают сквален, жирную кислоту, холестерин и сложный восковой эфир. Кожное заболевание предпочтительно представляет собой состояние, связанное со сниженным уровнем сальных липидов (например, одного или более из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое кожи пациента, например, где указанный уровень сальных липидов снижен по сравнению с уровнем сальных липидов у субъекта, у которого отсутствует кожное заболевание. Сальные липиды, вовлеченные в патогенез заболеваний кожи, а также примеры таких заболеваний описаны в публикации Sahle et al. (Skin Pharmacol Physiol 2015; 28:42-55), которая включена в настоящий документ посредством отсылки.

Что касается нетерапевтического применения и/или косметического способа, описанного в настоящем документе, косметический эффект предпочтительно достигается за счет повышения уровня сальных липидов (например, одного или более из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое кожи пациента, например, где указанный уровень сального липида повышен по сравнению с уровнем сального липида в эпидермальном слое субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин (или где указанный уровень сальных липидов повышен относительно уровня сальных липидов в эпидермальном слое пациента до введения клостридиального нейротоксина).

Предпочтительно после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию (например, экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживание пептида тахикинина (такого как вещество Р) в дерме кожи.

Терапевтический или косметический эффект может быть достигнут путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживания пептида тахикинина (такого как вещество Р) в дерме кожи;

после введения пациенту клостридиального нейротоксина.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ лечения кожного заболевания, включающий внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина, где после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию (например, экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживание пептида тахикинина (такого как Вещество Р) в дерме кожи.

В одном аспекте изобретения предложен способ лечения кожного заболевания путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживания пептида тахикинина (такого как вещество Р) в дерме кожи;

после внутрикожного введения клостридиального нейротоксина пациенту.

В другом аспекте изобретения предложен клостридиальный нейротоксин для применения в способе лечения кожного заболевания, включающем внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина, где после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию (например, экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживание пептида тахикинина в дерме кожи.

В одном из аспектов изобретения предложен клостридиальный нейротоксин для применения в способе лечения кожного заболевания путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживание пептида тахикинина в дерме кожи;

где указанный способ включает внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина.

Как преимущество, индукция секреции/экскреции сальных липидов, описанных в настоящем документе, в эпидермисе может улучшить внешний вид/молодость кожи и обеспечить омоложение кожи, благодаря чему изобретение также находит применение в области косметики.

Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для косметической обработки кожи, при этом (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту) клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию (например, экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживание пептида тахикинина в дерме кожи.

В одном аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для косметической обработки кожи путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживания пептида тахикинина в дерме кожи;

где способ предпочтительно включает внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина.

Предпочтительно нетерапевтическое применение и/или косметический способ согласно изобретению включает стимуляцию омоложения кожи путем индукции секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое кожи; где предпочтительно один или больше сальных липидов выбраны из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира.

В еще одном аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для стимуляции омоложения кожи путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживания пептида тахикинина в дерме кожи;

где способ предпочтительно включает внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина.

В другом аспекте предложен косметический способ (косметической) обработки кожи, где (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту) клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию (например, экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживание пептида тахикинина в дерме кожи.

В одном аспекте изобретения предложен косметический способ (косметической) обработки кожи путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживания пептида тахикинина в дерме кожи;

после введения пациенту клостридиального нейротоксина (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту клостридиального нейротоксина).

В одном аспекте изобретения предложен косметический способ стимуляции омоложения кожи путем индукции:

- секреции (например, экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и/или

- удерживания пептида тахикинина в дерме кожи;

после введения пациенту клостридиального нейротоксина (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту клостридиального нейротоксина).

Ключевым преимуществом применения клостридиального нейротоксина для терапии или косметической обработки является то, что клостридиальный нейротоксин не вызывает нежелательных побочных эффектов существующих средств для ухода за кожей, таких как кремы на основе ретиноидов. Например, авторы изобретения обнаружили, что внутрикожная инъекция ботулинического нейротоксина не вызывает эритемы или шелушения (например, отшелушивания) кожи, которые наблюдаются после наружного применения обычного крема на основе ретиноидов.

Далее будут описаны различные (необязательные) варианты осуществления изобретения. Следует отметить, что каждый из следующих вариантов осуществления может применяться к любому способу, клостридиальному нейротоксину для применения или нетерапевтического применения (например, косметическому способу), описанному в настоящем документе.

В одном варианте осуществления эпидермальный слой (например, в котором секретируются сальные липиды) представляет собой один или больше слоев, выбранных из базального слоя, шиповатого слоя, зернистого слоя или рогового слоя. В предпочтительном варианте эпидермальный слой представляет собой роговой слой.

Ссылка на "кожное сало" означает маслянистое/воскообразное вещество, вырабатываемое сальными железами кожи, которое обычно служит для покрытия, увлажнения и защиты кожи. Кожное сало представляет собой сложную смесь жирных кислот, сахаров, восков и других природных химических соединений, которые формируют защитный барьер против испарения воды. Например, кожное сало (например, человеческое кожное сало) обычно содержит жирные кислоты (~57%, основным компонентом которых являются триглицериды), сложные восковые эфиры (~26%), сквален (~12%) и холестерин (~4,5%).

Без ограничения теорией считается, что повышение некоторых компонентов кожного сала (например, сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира), наблюдаемое после внутрикожного введения клостридиального нейротоксина, связано с изменением состава (например, относительных уровней) этих компонентов кожного сала, а не общим увеличением количества кожного сала. То есть было отмечено, что относительные уровни этих липидов к суммарному (общему) уровню кожного сала могут повышаться после внутрикожного введения клостридиального нейротоксина.

Таким образом, неожиданным техническим результатом настоящего изобретения является повышение качества кожного сала (например, за счет повышения уровня компонентов, которые способствуют улучшению полезных свойств кожного сала на коже). В результате улучшения качества кожного сала, а не повышения общего количества кожного сала, можно лечить кожное заболевание, не вызывая при этом случайно другое кожное заболевание (или не повышая вероятность его возникновения), такое как жирную кожу и/или акне.

В одном варианте осуществления пациент не имеет жирной кожи (например, жирной кожи лица) до и/или после введения клостридиального нейротоксина.

Термин "жирная кожа" означает состояние, возникающее в результате избыточной продукции кожного сала (например, из сальных желез под поверхностью кожи). Пациент с жирной кожей может включать кожное сало (например, на коже лица) на уровне, превышающем 180 мг кожного сала на см² кожи (>180 мг/см²). Уровень кожного сала (у пациентов с жирной кожей) может составлять ≥185 мг/см², ≥190 мг/см² или ≥195 мг/см². Указанный уровень может относиться к среднему уровню кожного сала (например, среднему уровню на коже лица). Указанный уровень может предпочтительно относиться к уровню (например, среднему уровню) кожного сала, присутствующему на определенной области лица, такой как лоб, носогубная борозда и/или нос.

Как указано в другой части настоящего документа, кожное сало (например, кожное сало на лице) можно измерять с помощью себуметра (SM 8151, CL-Electronics, Cologne, Germany).

В тексте настоящего описания любая ссылка на уровень кожного сала может относиться к уровню кожного сала, измеряемому с помощью себуметра.

В одном варианте осуществления у пациента не наблюдается избыточной продукции кожного сала (например, общего уровня кожного сала) после введения клостридиального нейротоксина. Другими словами, в одном варианте осуществления пациент не страдает избыточной продукцией кожного сала (например, общего уровня кожного сала) после введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления уровень кожного сала у пациента составляет ≤180 мг/см² кожи (например, кожи лица). Можно сказать, что такой пациент не имеет жирной кожи. Указанный уровень кожного сала может относиться к уровню на участке кожи пациента, где уровень кожного сала у пациента самый высокий (например, поскольку уровни кожного сала имеют тенденцию варьировать в разных участках кожи); например, на участке лица, таком как лоб, носогубная борозда и/или нос. Из-за разного уровня кожного сала пациент может иметь уровень кожного сала от 20 мг/см² до ≤180 мг/см² кожи (например, кожи лица).

В одном варианте осуществления пациент является неакнеическим пациентом.

Термин "акнеический" относится к присутствию акнеической кожи у пациента (и, таким образом, "неакнеический" относится к отсутствию акнеической кожи у пациента). Акнеическая кожа относится к коже с избытком жира/кожного сала в порах (например, обычно это возникает при чрезмерной стимуляции гормонов в организме). Это в сочетании с накоплением бактерий и мертвых клеток кожи может привести к воспалениям и серьезным нарывам. Некоторыми типичными симптомами акнеической кожи являются воспаленные гнойные нарывы (прыщи), сильная угревая сыпь и закупоренные поры, жирность, более грубая и толстая текстура кожи.

Лечение могут проводить на лице пациента; например, на лбу, носогубной борозде и/или носу (переносице и/или вершине). Например, клостридиальный нейротоксин можно вводить (например, внутрикожно) на лицо пациента; например, ко лбу, носогубной борозде и/или носу (переносице и/или кончике).

В одном варианте осуществления лечение (например, индукцию секреции сальных липидов) можно проводить не на лицевой области кожи. Например, клостридиальный нейротоксин можно вводить в нелицевую область кожи пациента (например, в кожу не на лице). Например, клостридиальный нейротоксин можно вводить в руку(и), ступню, шею, кожу головы и/или спину (например, руку(и), ступню и/или спину). Области спины включают верхнюю часть спины и плечи.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина не возникает повышения уровня (например, общего уровня) кожного сала на коже (например, эпидермальном слое) пациента по сравнению с референсным стандартом; при этом референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин (или где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента перед введением клостридиального нейротоксина).

В качестве дополнения или альтернативы после введения клостридиального нейротоксина не возникает снижения уровня (например, общего уровня) кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента по сравнению с референсным стандартом; при этом референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин (или где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента перед введением клостридиального нейротоксина).

Другими словами, в одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента остается неизменным по сравнению с референсным стандартом; при этом референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин (или где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента перед введением клостридиального нейротоксина).

Термин "нет снижения уровня кожного сала на коже" означает, что по существу нет снижения уровня кожного сала на коже. Термин "по существу" при использовании в настоящем документе в отношении термина "нет снижения уровня кожного сала на коже" предпочтительно означает отсутствие статистически значимого снижения. Указанное снижение (которое не является существенным) может быть уменьшением меньше чем на 5%, 2%, 1% или 0,5%. Более предпочтительно при использовании в настоящем документе термин "нет снижения уровня кожного сала" означает, что уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) совсем не снижается (т.е. снижение уровня составляет 0%).

Аналогичным образом, термин "нет повышения уровня кожного сала на коже" означает, что по существу нет повышения уровня кожного сала на коже. Термин "по существу" при использовании в настоящем документе в отношении термина "нет повышения уровня кожного сала на коже" предпочтительно означает отсутствие статистически значимого повышения. Указанное повышение (которое не является существенным) может быть повышением меньше чем на 5%, 2%, 1% или 0,5%. Более предпочтительно термин "нет повышения уровня кожного сала на коже" при использовании в настоящем документе означает, что уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) совсем не повышается (т.е. снижение уровня составляет 0%).

Термин "уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента остается неизменным" означает, что изменения по существу отсутствуют (например, отсутствует повышение или снижение) уровня кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое). Термин "по существу" при использовании в настоящем документе в отношении термина "уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента остается неизменным" предпочтительно означает отсутствие статистически значимого изменения. Указанное изменение (которое не является существенным) может быть изменением меньше чем на 5%, 2%, 1% или 0,5%. Более предпочтительно термин "уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента остается неизменным" при использовании в настоящем документе означает, что уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) вообще не изменяется (т.е. изменение уровня равно 0%).

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента повышается на <30%, <25%, <20%, <15%, <10%, <5% или <1% (например, <20%, <15%, <10%, <5% или <1%). Предпочтительно, после введения клостридиального нейротоксина (уровень) кожного сала на коже (например, эпидермальном слое) пациента может увеличиться на <10%. Указанное повышение уровня кожного сала можно сравнить с референсным стандартом, где референсный стандарт предпочтительно соответствует уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы референсный стандарт может соответствовать уровню кожного сала на коже (например, эпидермальном слое) пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина не происходит повышения уровня эритемы и/или шелушения на коже пациента по сравнению с референсным стандартом; при этом референсный стандарт соответствует уровню эритемы и/или шелушению кожи пациента (имеющего указанное кожное заболевание), которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы референсный стандарт может соответствовать уровню эритемы и/или шелушения кожи пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

Термин "отсутствие повышения уровня эритемы и/или шелушения на коже" означает, что по существу нет повышения уровня эритемы и/или шелушения на коже. Термин "по существу" при использовании в настоящем документе в отношении термина "отсутствие увеличения уровня эритемы и/или шелушения на коже" предпочтительно означает отсутствие статистически значимого увеличения. Указанное увеличение (которое не является существенным) может быть увеличением меньше чем на 5%, 2%, 1% или 0,5%. Более предпочтительно термин "отсутствие повышения уровня эритемы и/или шелушения на коже" при использовании в настоящем документе означает, что уровень эритемы и/или шелушения на коже совсем не повышается (т.е. уровень равен 0%).

Термин "эритема" относится к кожному заболеванию, которое проявляется покраснением кожи или слизистых оболочек, вызванным гиперемией (повышением кровотока) в поверхностных капиллярах. Это может произойти из-за повреждения кожи, инфекции или воспаления.

Термин "отшелушивание" относится к появлению сухой, потрескавшейся или шелушащейся кожи. Также известное как десквамация, шелушение кожи обычно возникает, когда внешний слой кожи, называемый эпидермисом, начинает отслаиваться. Шелушение кожи может возникнуть, когда травма или заболевание приводят к повреждению наружного слоя кожи.

Предпочтительно, после введения клостридиального нейротоксина не происходит изменений (например, повышения или понижения) уровня одного или больше из следующих параметров:

- поверхность сальных желез;

- поверхность утрикул (утрикулы представляют собой, например, структуры в эпидермисе кожи, которые заполнены плотными скоплениями роговых клеток, напоминающими открытые комедоны человека);

- толщина эпидермиса кожи спины;

- воспаление дермы;

- пролиферация кератиноцитов;

- пролиферация фибробластов;

- разрастание сальных желез;

- уровень IL-альфа в дерме;

где изменение сравнивают с уровнем указанного одного или более параметров в референсном стандарте; где референсный стандарт соответствует уровню указанного одного или более параметров у субъекта/пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы референсный стандарт может соответствовать уровню одного или более указанных параметров у субъекта/пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

"Сальные липиды" называются так потому, что они являются частью кожного сала, секретируемого сальной железой. "Сальные железы" представляют собой микроскопические экзокринные железы в коже, которые выделяют кожное сало (напоминающее маслянистое или воскообразное вещество) для смазывания и водонепроницаемости кожи и волос у млекопитающих. У человека они в наибольшем количестве присутствуют на лице и волосистой части головы, а также на всех участках кожи, кроме ладоней и подошв стоп. Тип секреции сальных желез называется голокринным.

При использовании в настоящем документе термин "секреция" может использоваться попеременно с термином "экскреция". Это связано с тем, что кожное сало (и, следовательно, сальные липиды) вырабатывается клетками сальной железы, называемыми себоцитами, которые лизируются с высвобождением содержащихся в них липидов/кожного сала (обычно на дно волосяного фолликула, после чего липиды/кожное сало медленно продвигаются вверх по волосяному фолликулу на поверхность кожи). Таким образом, можно считать, что эти клетки "экскретируют" липиды/кожное сало в эпидермальный слой. Например, термин "высвобождение" может использоваться для обозначения секреции и/или экскреции.

По всему тексту данного описания любая ссылка на уровень сального липида, описанная в настоящем документе, предпочтительно относится к уровню указанного сального липида на участке введения или вблизи от участка введения клостридиального нейротоксина. Например, любая ссылка на уровень сального липида, описанная в настоящем документе, может относиться к уровню указанного сального липида (например, на коже) ≤1 см, ≤2 см, ≤4 см, ≤6 см, ≤8 см, ≤10 см, ≤12 см, ≤16 см, ≤18 см или ≤20 см от участка введения клостридиального нейротоксина. Ссылка на уровень сального липида, описанный в настоящем документе, может относиться к уровню указанного сального липида ≤2 см, ≤4 см, ≤6 см, ≤8 см или ≤10 см (предпочтительно ≤4 см) от участка введения клостридиального нейротоксина.

В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ лечения кожного заболевания, включающий внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина, где после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- высвобождение (например, секрецию/экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

В одном аспекте изобретения предложен способ лечения кожного заболевания путем индукции:

- высвобождения (например, секреции/экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи

после внутрикожного введения клостридиального нейротоксина пациенту.

В другом аспекте изобретения предложен клостридиальный нейротоксин для применения в способе лечения кожного заболевания, где указанный способ включает внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина, где после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- высвобождение (например, секрецию/экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

В одном из аспектов изобретения предложен клостридиальный нейротоксин для применения в способе лечения кожного заболевания путем индукции:

- высвобождения (например, секреции/экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи;

где указанный способ включает внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина.

В другом аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для косметической обработки кожи, где (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту) клостридиальный нейротоксин вызывает:

- высвобождение (например, секрецию/экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

В другом аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для стимуляции омоложения кожи, где (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту) клостридиальный нейротоксин вызывает:

- высвобождение (например, секрецию/экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

В другом аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для косметической обработки кожи путем индукции:

- высвобождения (например, секреции/экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи,

после введения клостридиального нейротоксина пациенту (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту клостридиального нейротоксина).

В другом аспекте изобретения предложено нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для стимуляции омоложения кожи путем индукции:

- высвобождения (например, секреции/экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи,

после введения клостридиального нейротоксина пациенту (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту клостридиального нейротоксина).

В еще одном аспекте предложен косметический способ (косметической) обработки кожи, где (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту) клостридиальный нейротоксин вызывает:

- высвобождение (например, секрецию/экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

В еще одном аспекте предложен косметический способ стимуляции омоложения кожи, где (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту) клостридиальный нейротоксин вызывает:

- высвобождение (например, секрецию/экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

В еще одном аспекте предложен косметический способ (косметической) обработки кожи, путем индукции:

- высвобождения (например, секреции/экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи,

после введения клостридиального нейротоксина пациенту (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту клостридиального нейротоксина).

В еще одном аспекте предложен косметический способ стимуляции омоложения кожи путем индукции:

- высвобождения (например, секреции/экскреции) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи,

после введения клостридиального нейротоксина пациенту (предпочтительно после внутрикожного введения пациенту клостридиального нейротоксина).

Термин "высвобождение" при использовании в настоящем документе охватывает секрецию сальных липидов, а также экскрецию сальных липидов. Например, термин "высвобождение" при использовании в настоящем документе может означать экскрецию (сального липида). В качестве дополнения или альтернативы термин "высвобождение" при использовании в настоящем документе может означать секрецию (сального липида).

Термины "высвобождение", "секреция" и "экскреция" сального липида(ов) означают высвобождение/секрецию/экскрецию (соответственно) из сальной железы (например, себоцита) пациента.

Термин "лечить" или "лечение" при использовании в настоящем документе охватывает профилактическое лечение (например, для предотвращения возникновения кожного заболевания), а также корректирующее лечение (лечение пациента, уже страдающего кожным заболеванием). В предпочтительном варианте осуществления термин "лечить" или "лечение" при использовании в настоящем документе означает корректирующее лечение. Термин "лечить" или "лечение" охватывает лечение как кожного заболевания, так и его симптома. В некоторых вариантах осуществления термин "лечить" или "лечение" относится к симптому кожного заболевания.

Таким образом, клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту в терапевтически эффективном количестве или профилактически эффективном количестве.

"Терапевтически эффективное количество" является любым количеством клостридиального нейротоксина, которое при введении отдельно или в комбинации пациенту для лечения кожного заболевания (или его симптома) является достаточным для осуществления такого лечения кожного заболевания или его симптома.

"Профилактически эффективное количество" является любым количеством клостридиального нейротоксина, которое при введении пациенту отдельно или в комбинации замедляет или задерживает возникновение или рецидив кожного заболевания (или его симптома). В некоторых вариантах осуществления профилактически эффективное количество полностью предотвращает возникновение или рецидив кожного заболевания. "Замедление" возникновения означает либо снижение вероятности возникновения кожного заболевания (или его симптома), либо полное предотвращение возникновения.

Терапевтически и/или профилактически эффективное количество предпочтительно является таким количеством, которое не приводит к мышечному параличу. Термин "мышечный паралич" предпочтительно относится к длительному мышечному параличу, поскольку преходящий мышечный паралич может возникать в течение короткого периода времени после введения.

Термины "субъект", "лицо" и "пациент" используются в настоящем документе попеременно для обозначения субъекта-млекопитающего. В одном варианте осуществления "пациент" является человеком, животным-компаньоном (например, домашним животным, таким как собака, кошка и/или кролик), сельскохозяйственным животным (например, свиньей, овцой, крупным рогатым скотом и/или козой) и/или лошадью. В предпочтительном варианте осуществления субъектом (пациентом) является человек.

Термин "нетерапевтическое применение" относится к применению клостридиального нейротоксина в косметических целях, а не в терапевтических целях. Термин "косметический способ" относится к способу, в котором клостридиальный нейротоксин вводят в косметических целях, а не в терапевтических целях. В аспектах и вариантах осуществления, которые относятся к "нетерапевтическому" применению изобретения, субъект (например, которому вводят клостридиальный нейротоксин) предпочтительно не имеет кожное заболевание, например, субъект может не иметь кожное заболевание, описанное в настоящем документе. Нетерапевтическое применение предпочтительно предназначено для улучшения эстетического вида (например, молодости) кожи, например, у пожилых людей, с учетом того, что эндогенная секреция сальных липидов обычно уменьшается с возрастом. В аспектах и вариантах осуществления, которые относятся к "косметическому способу" изобретения, субъект (например, которому вводят клостридиальный нейротоксин) предпочтительно не имеет кожного заболевания, например, субъекта может не иметь кожного заболевания, описанного в настоящем документе. Косметический способ предпочтительно предназначен для улучшения эстетического вида (например, молодости) кожи, например, у пожилых людей, с учетом того, что эндогенная секреция сальных липидов обычно уменьшается с возрастом.

В способах согласно изобретению у пациента может быть ранее не диагностировано кожное заболевание. В альтернативе у пациента может быть ранее диагностировано кожное заболевание. Пациентом также может быть тот, кто демонстрирует факторы риска заболевания, или тот, у кого кожное заболевание протекает бессимптомно. Пациент также может быть тем, кто страдает кожным заболеванием или подвергается риску его развития. В одном варианте осуществления пациент ранее получал терапию для лечения кожного заболевания.

Кожное заболевание может быть любым кожным заболеванием, которое можно облегчать (или предотвращать) благодаря присутствию кожного сала более высокого качества на коже. Уровень одного или больше сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в "кожном сале более высокого качества" повышен.

Предпочтительно кожное заболевание, подлежащее лечению, связано с присутствием сниженного уровня одного или больше сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое здорового пациента (например, пациента, который не имеет кожного заболевания).

Предпочтительно кожное заболевание вызвано пониженным уровнем одного или больше сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не имеет кожного заболевания.

Предпочтительно кожное заболевание является кожным заболеванием, которое подавляется (например, поддается лечению или предотвращению) в результате присутствия одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира в эпидермальном слое кожи.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает жирные кислоты в концентрации ≤50% (об./об.), ≤45% (об./об.), ≤40% (об./об.), ≤35% (об./об.), ≤30% (об./об.), ≤25% (об./об.), ≤20% (об./об.), ≤15% (об./об.) или ≤10% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает жирные кислоты в концентрации ≤45% (об./об.), ≤40% (об./об.), ≤35% (об./об.), ≤30% (об./об.), ≤25% (об./об.). Клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает жирные кислоты в концентрации ≤45% (об./об.). Предпочтительно клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, у которого кожное сало включает жирную кислоту в концентрации ≤40% (об./об.).

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает восковой эфир в концентрации ≤20% (об./об.), ≤15% (об./об.), ≤10% (об./об.) или ≤5% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает жирные кислоты в концентрации ≤15% (об./об.), ≤10% (об./об.) или ≤5% (об./об.). Клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает сложный восковой эфир в концентрации ≤15% (об./об.). Предпочтительно клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает сложный восковой эфир в концентрации ≤10% (об./об.).

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает сквален в концентрации ≤10% (об./об.), ≤8% (об./об.), ≤6% (об./об.), ≤4% (об./об.) или ≤2% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает сквален в концентрации ≤8% (об./об.), ≤6% (об./об.) или ≤4% (об./об.). Клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает сквален в концентрации ≤8% (об./об.). Предпочтительно клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает сквален в концентрации ≤6% (об./об.).

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает холестерин в концентрации ≤4% (об./об.), ≤3% (об./об.), ≤2% (об./об.) или ≤1% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает холестерин в концентрации ≤3% (об./об.), ≤2% (об./об.) или ≤1% (об./об.). Клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает холестерин в концентрации ≤3% (об./об.). Предпочтительно клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, имеющему кожное сало, которое включает холестерин в концентрации ≤2% (об./об.).

В одном варианте кожное заболевание представляет собой нарушение, связанное с аберрантной секрецией сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое пациента. Предпочтительно у пациента указанный сальный липид в эпидермальном слое присутствует на более низком уровне, чем у субъекта, который не имеет кожного заболевания. Другими словами, в одном варианте осуществления уровень указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое (например, роговом слое) у пациента (перед введением клостридиального нейротоксина) ниже, чем уровень указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не имеет кожного заболевания (например, предпочтительно ниже по меньшей мере на 5%, 10%, 15% или 20%; более предпочтительно ниже по меньшей мере на 10%).

Например, такие состояния, как ксероз, псориаз, атопический дерматит и ихтиоз, могут быть связаны со снижением таких сальных липидов.

В одном варианте осуществления кожное заболевание представляет собой одно или несколько состояний, выбранных из акне (например, вульгарных угрей), атопического дерматита, синдрома Нетертона, псориаза, зуда, обезвоженной кожи (например, сухой или потрескавшейся кожи), актинического кератоза, розацеа, карбункула, экземы (например, атопической экземы), целлюлита, дерматита, рака кожи, фолликулярного кератоза, старения кожи (например, нормального и/или преждевременного старения кожи), ожога, рубцевания, болезни Гоше 2-го типа, синдрома Шегрена-Ларссона, ламеллярного ихтиоза, Х-сцепленного ихтиоза, буллезной ихтиозиформной эритродермии, дефицита незаменимых свободных жирных кислот (СЖК), возрастной сухости кожи и гипогидротической эктодермальной дисплазии.

В одном варианте осуществления кожное заболевание представляет собой одно или более состояний, выбранных из акне, атопического дерматита, синдрома Нетертона, псориаза, обезвоженной кожи (например, сухой или потрескавшейся кожи), актинического кератоза, розацеа, карбункула, экземы (например, атопической экземы), целлюлита, дерматита, рака кожи, фолликулярного кератоза, старения кожи (например, нормального и/или преждевременного старения кожи), ожогов или рубцов. Например, кожное заболевание может быть одним или больше, выбранными из акне, атопического дерматита, дерматита, псориаза, экземы или обезвоженной кожи (например, сухой или потрескавшейся кожи). В качестве дополнения или альтернативы кожное заболевание может быть одним или больше, выбранными из дерматита, псориаза или экземы.

В одном варианте осуществления кожное заболевание представляет собой одно или больше состояний, выбранных из акне (например, вульгарных угрей), атопического дерматита, псориаза, прурита, ксероза, обезвоженной кожи (например, сухой или потрескавшейся кожи), экземы (например, атопической экземы), болезни Гоше 2-го типа, синдрома Шегрена-Ларссона, ламеллярного ихтиоза, Х-сцепленного ихтиоза, буллезной ихтиозиформной эритродермии, дефицита незаменимых СЖК, возрастной сухости кожи и гипогидротической эктодермальной дисплазии. Например, кожное заболевание может быть одним или больше, выбранными из атопического дерматита, псориаза, ксероза, обезвоженной кожи (например, сухой или потрескавшейся кожи), экземы (например, атопической экземы), болезни Гоше 2-го типа, синдрома Шегрена-Ларссона, ламеллярного ихтиоза, Х-сцепленного ихтиоза, буллезной ихтиозиформной эритродермии, дефицит незаменимых СЖК, возрастной сухости кожи и гипогидротической эктодермальной дисплазии.

Предпочтительно кожное заболевание может быть одним или больше, выбранными из ксероза, псориаза, атопического дерматита и ихтиоза (более предпочтительно ксероза).

В качестве дополнения или альтернативы клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, который подвергался воздействию одного или более факторов (предпочтительно внешних факторов), которые влияют на состав сальных липидов, например, химического вещества, используемого в целях очистки и санитарной обработки, загрязнителя окружающей среды и/или фармацевтического ингредиента. Термин "влияет на состав сальных липидов" означает снижение уровня сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое у пациента.

Как преимущество клостридиальный нейротоксин можно вводить после (или до, или одновременно с) альтернативной (например, первой) обработки кожи, которая может снижать качество кожного сала на коже пациента, что, например, вызывает у пациента предрасположенность (или потенциальную предрасположенность) к развитию кожных заболеваний в качестве побочного эффекта. Термин "снижение качества кожного сала на коже пациента" предпочтительно относится к снижению уровня сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое у пациента.

Например, клостридиальный нейротоксин можно вводить после (или до, или одновременно с) лазерной обработки, химического пилинга и/или лечения акне (например, лечения адапаленом, которое обычно снижает уровень кожного сала), предпочтительно улучшая восстановление кожи после указанного альтернативного лечения.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин вводят пациенту, кожа которого была подвергнута воздействию агента, вызывающего снижение уровня одного или больше сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не подвергался воздействию такого агента.

Клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, чья кожа подверглась воздействию химического загрязнителя, который, например, может действовать как контактный аллерген или раздражители, вызывающие аллергический или неаллергический контактный дерматит. Примеры таких химических веществ включают металл(ы), мыло(а), ароматизатор(ы), консервант(ы), растительное(ые) вещество(а) и парафенилендиамин.

Клостридиальный нейротоксин можно вводить пациенту, кожа которого была подвергнута воздействию повышенной температуры (например, >30°C) и/или влажности, например, такого уровня тепла и/или влаги, который может повлиять на состав сальных липидов. Такая повышенная температура и/или влажность могут привести к повышенному потоотделению, вызывая потерю воды, сухость кожи и кожный зуд.

В одном варианте осуществления пациент является пациентом, который получил (или получит) лечение (например, обработку кожи), которое снижает уровень одного или больше сальных липидов (например, одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерин и сложного воскового эфира) в эпидермальном слое кожи; например, сниженный по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в референсном стандарте; при этом референсный стандарт соответствует уровню указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое пациента, который не получал указанное лечение (например, обработку кожи), или где референсный стандарт соответствует уровню указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое пациента до получения указанного лечения (например, обработки кожи). Примеры такого лечения могут включать лазерное лечение, химический пилинг и/или лечение акне (например, лечение адапаленом).

Термин "один или больше сальных липидов" предпочтительно означает, что по меньшей мере 2, 3 или 4 из указанных сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) индуцируются после введения клостридиального нейротоксина. Таким образом, секреция по меньшей мере 2, 3 или 4 сальных липидов может быть индуцирована клостридиальным нейротоксином. Более предпочтительно, термин "один или больше сальных липидов" означает, что секреция всех указанных сальных липидов (например, сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) индуцируется после введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления сальный липид ("один или больше сальных липидов") представляет собой жирную кислоту; и одно или больше (например, два или больше, три или больше или четыре или больше), выбранных из сквалена, холестерина и сложного воскового эфира. В одном варианте осуществления сальный липид представляет собой сквален; и одно или больше (например, два или больше, три или больше или четыре или больше), выбранных из жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира. В одном варианте осуществления сальный липид представляет собой холестерин; и одно или больше (например, два или больше, три или больше или четыре или больше), выбранных из жирной кислоты, сквалена и сложного воскового эфира. В одном варианте осуществления сальный липид представляет собой сложный восковой эфир; и одно или больше (например, два или больше, три или больше или четыре или больше), выбранных из жирной кислоты, сквалена и холестерина.

В одном варианте осуществления сальный липид представляет собой жирную кислоту. Примеры жирных кислот включают свободную жирную кислоту(ы), диглицерид(ы) (например, глицерид, состоящий из двух цепей жирных кислот, которые ковалентно связаны с одной молекулой глицерина сложноэфирной связью), триглицерид(ы) (например, сложный эфир, полученный из глицерина и трех цепей жирных кислот), церамид(ы) и сложный холестериловый эфир(ы). Например, жирная кислота может быть триглицеридом и/или свободной жирной кислотой. Жирная кислота предпочтительно может быть триглицеридом.

Свободная жирная кислота может включать (например, с одной или более заменами) или состоять из следующей формулы:

Триглицерид может включать или состоять из следующей формулы:

Многие жирные кислоты, вырабатываемые сальными железами, связаны с двумя уникальными особенностями, а именно с тем, что они являются жирными кислотами с разветвленной цепью, и что они сильно ненасыщенные. Вместе с триглицеридами они составляют преобладающую долю (например, ~57%) кожного сала. Считается, что жирные кислоты кожного сала (помимо прочего) важны для обеспечения доставки жирорастворимых антиоксидантов на поверхность кожи и про- и противовоспалительной активности, проявляемой некоторыми молекулами. В одном варианте осуществления жирная кислота может быть жирной кислотой с разветвленной цепью. В качестве дополнения или альтернативы (предпочтительно дополнения) жирная кислота может быть сильно ненасыщенной жирной кислотой.

Предпочтительные примеры жирных кислот включают линолевую кислоту (полиненасыщенную омега-6-жирную кислоту) и сапиеновую кислоту (например, цис-6-гексадеценовую).

Сальный липид (например, жирная кислота) может быть определен по времени удерживания на колонке газовой хроматографии (ГХ). "Время удерживания" (tR) представляет собой количество времени (предпочтительно в минутах), требуемое для прохождения растворенного вещества (например, липида) через хроматографическую колонку, где образец, содержащий аналит, подвергают газохроматографическому анализу (предпочтительно газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием). Его вычисляют как время от введения (в ГХ колонку) образца (например, в настоящей заявке, кожного сала/сальных липидов) до обнаружения аналита. Указанное обнаружение обычно осуществляют по определенному пику на газовой хроматограмме (причем площадь указанного пика позволяет определить уровень сальных липидов).

Газохроматографический (ГХ) анализ может быть проведен с помощью ГХ/пламенно-ионизационного детектора (ПИД), такого как 7890B (Agilent); и, необязательно, с выполнением регистрации данных при использовании Empower версии 3471 (Waters).

Указанный ГХ анализ может включать:

- газ-носитель гелий;

- колонку для ГХ размером 30 м × 0,25 мм × 0,1 мкм;

- температуру инжектора примерно 350°C, ввод пробы в режиме деления потока;

- градиент температуры ГХ колонки:

• от 80°C до 240°C со скоростью 10°C/мин;

• от 240°C до 320°C со скоростью 5°C/мин;

• от 320°C до 350°C со скоростью 2°C/мин; и

• 350°C в течение 20 минут;

- температуру пламенно-ионизационного детектора (ПИД) 250°C;

- скорость потока водорода ПИД 35 мл/мин;

- скорость потока воздуха ПИД 350 мл/мин; и/или

- скорость потока поддувочного гелия ПИД 25 мл/мин.

Предпочтительно указанный ГХ анализ включает проведение ГХ анализа 1 мкл кожного сала с гелием-носителем (35 см/сек) и ГХ колонку, включающую 5% фенил, 95% диметилполисилоксана и имеющую размеры 30 м × 0,25 мм × 0,1 мкм (например, ГК Zebron ZB-SHT);

- где ввод пробы осуществляют в режиме деления потока (например, вкладыш с внутренним диаметром 4 мм, прямой, деактивированный, без набивки)

- где градиент температуры колонки включает:

• от 80°C до 240°C со скоростью 10°C/мин;

• от 240°C до 320°C со скоростью 5°C/мин;

• от 320°C до 350°C со скоростью 2°C/мин;

• 350°C в течение 20 мин.

- где обнаружение липидов проводят с использованием пламенно-ионизационного детектора (ПИД), демонстрирующего:

• температуру детектора 250°C

• скорость потока водорода ПИД 35 мл/мин;

• скорость потока воздуха ПИД 350 мл/мин;

• скорость потока поддувочного гелия ПИД 25 мл/мин.

В одном варианте осуществления жирная кислота представляет собой жирную кислоту, имеющую время удерживания приблизительно 15,5-16 минут (например, приблизительно 15,7 или 15,8 минуты), приблизительно 20-20,2 минуты (например, приблизительно 20 минут) и/или приблизительно 22-22,2 минуты (например, приблизительно 22,1 минуты) на ГХ колонке. Предпочтительно жирная кислота может быть жирной кислотой, имеющей время удерживания приблизительно 22-22,2 минуты (например, на ГХ колонке); более предпочтительно приблизительно 22,1 минуты.

Время удерживания может быть выражено в абсолютных величинах или в относительном величинах (в сравнении с референсного/стандартного аналита). Например, жирная кислота может быть определена при сравнении с "относительным временем удерживания" (RRT) на газохроматографической колонке. RRT представляет собой выражение времени удерживания аналита (например, липида) по отношению ко времени удерживания референсного/стандартного аналита (например, RRT=tR стандарта/tR образца). Аналит и референсный/стандартный аналит предпочтительно подвергают ГХ анализу одновременно. Например, образец (например, образец сального липида), который подвергают ГХ анализу, может содержать как аналит (например, жирную кислоту), так и референсный/стандартный аналит.

Референсным/стандартным аналитом предпочтительно может быть, например, сквален.

Например, сравните время удерживания жирной кислоты (FA4) со временем удерживания сквалена (ST1) на газовой хроматограмме на Фигуре 17A (изображение с разделением пиков представлено на Фигуре 17B). В данном случае можно видеть, что время удерживания сквалена составляет приблизительно 25 минут, а время удерживания жирной кислоты (FA4) - 22,1 минуты. Это демонстрирует, что RTT (по отношению ко времени удерживания сквалена) для жирной кислоты может быть: 25 минут/22,1 минуты = ~1,13 минуты.

В одном варианте осуществления жирная кислота представляет собой жирную кислоту, имеющую относительное время удерживания:

- приблизительно 1,5-1,6 минуты (например, приблизительно 1,6 или 1,58 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена;

- приблизительно 1,23-1,25 минуты (например, приблизительно 1,25 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена; и/или

- приблизительно 0,9-1,14 мин (например, приблизительно 1,13 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена;

- предпочтительно, где время удерживания (например, относительное время удерживания) можно определить с помощью газовой хроматографии.

Жирная кислота может быть жирной кислотой, имеющей относительное время удерживания 1-1,15 минуты (например, приблизительно 1,13 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемого с помощью газовой хроматографии).

Предпочтительно жирная кислота может быть жирной кислотой, имеющей относительное время удерживания 0,9-1,14 минуты (например, приблизительно 1,13 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографии); более предпочтительно приблизительно 1,12-1,14 минуты (например, приблизительно 1,13 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографии).

Термин "жирная кислота" охватывает церамиды (которые обычно состоят из жирной кислоты и сфингозина). Например, повышение уровня жирных кислот/церамидов, таких как линолеат церамида 1, может быть полезным при лечении кожных заболеваний, включая атопический дерматит. Линолеат церамида 1 является основным депо эпидермальной линолевой кислоты, при этом изменения его уровня связывают с кожными заболеваниями, такими как атопический дерматит. Также его уровень подвержен резким сезонным колебаниям и уменьшается с возрастом, поэтому лечение согласно настоящему изобретению может применяться для борьбы с такими сезонными и возрастными изменениями.

Церамид может включать (например, с одной или больше дополнительными заменами) или состоять из следующей формулы:

Термин "жирная кислота" при использовании в настоящем документе может также охватывать "сложный холестериловый эфир", который представляет собой сложный эфир холестерина, где эфирная связь образуется между карбоксильной группой жирной кислоты и гидроксильной группой холестерина.

Сложный холестериловый эфир может быть сложным холестериловым эфиром, имеющим время удерживания приблизительно 40-42 минуты (например, приблизительно 41 минуту), например, на ГХ колонке.

Сложный холестериловый эфир может быть сложным холестериловым эфиром, имеющим относительное время удерживания 0,55-0,65 минуты, 0,57-0,63 минуты или 0,59-0,61 минуты (например, приблизительно 0,6 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографии).

Предпочтительно сложный холестериловый эфир может быть сложным холестериловым эфиром, имеющим относительное время удерживания 0,59-0,625 минуты (например, приблизительно 0,6 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографией).

Сложный холестериловый эфир может включать (например, с одной или больше дополнительными заменами) или состоять из следующей формулы:

В одном варианте осуществления сальный липид является сложным восковым эфиром.

Сложные восковые эфиры, как правило, представляют собой второй самым распространенный липид в сале, составляющий приблизительно 26% (нормального) сала у человека. "Сложный восковой эфир" является сложным эфиром жирной кислоты и жирного спирта (например, сложные восковые эфиры образуются в результате соединения одной жирной кислоты с одним жирным спиртом). Сложные восковые эфиры важны для уменьшения потерь воды при испарении с кожи и, таким образом, дегидратации кожи.

В одном варианте осуществления сложный восковой эфир является сложным восковым эфиром, имеющим время удерживания приблизительно 30-32 минуты (например, приблизительно 31 минуту), приблизительно 35-36 минут (например, приблизительно 35,5 минуты) и/или приблизительно 37-39 минут (например, приблизительно 38 минут), например, на ГХ колонке.

Предпочтительно сложный восковой эфир может быть сложным восковым эфиром, имеющим относительное время удерживания 0,78-0,83 минуты (например, приблизительно 0,8 минуты), 0,69-0,71 минуты (например, 0,7 минуты) и/или приблизительно 0,64-0,67 минуты (например, приблизительно 0,74 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографией).

Сложный восковой эфир может включать или состоять из следующей формулы:

В одном варианте осуществления сальным липидом является сквален.

Сквален (как указано в настоящем изобретении) предпочтительно включает (например, с одной или больше дополнительными заменами) или состоит из следующей структуры:

Сквалены уникальны для кожного сала (т.е. они не содержатся ни в каких других выделениях тела) и обычно составляют около 12% (нормального) кожного сала у человека. Сквален представляет собой линейный предшественник, предшествующий холестерину в его биосинтезе. Более конкретно, в сальных железах продуцируемый сквален не превращается в ланостерол, останавливая завершение пути биосинтеза, приводящего к холестерину. Предполагается, что возможные объяснения накопления сквалена в сальных железах включают повышенную экспрессию/повышение активности сквален-синтазы в клетках; или снижение уровня/активности ферментов, участвующих в превращении сквалена в холестерин. Без ограничения теорией, предполагается, что внутрикожное введение клостридиального нейротоксина может положительно влиять на один или больше механизмов, которые приводят к накоплению сквалена в сальных железах.

Сквален, как один из самых важных увлажняющих агентов в природе, помогает поддерживать гидратацию наружного слоя эпидермиса. Кроме того, сквален обладает антиоксидантными свойствами против солнечного излучения и, следовательно, рака кожи, поскольку он снижает образование свободных радикалов на уровне подверженной воздействию солнца кожи. Сообщалось, что жир печени акулы, богатый скваленом и алкилглицерином, обладает защитными свойствами против бактериальных и грибковых инфекций, особенно у пациентов с атопическим дерматитом и поражениями кожи, связанными с ксерозом. При наружном применении (например, в экзогенном/коммерческом составе) сквален быстро и эффективно проникает в кожу и обеспечивает здоровую эластичность и восстановление гибкости.

Указанный сквален может иметь время удерживания приблизительно 24-26 минут (например, около 25 минут), например, на ГХ колонке.

В одном варианте осуществления сальным липидом является холестерин.

Холестерин (как указано в настоящем описании) предпочтительно включает (например, с одной или больше дополнительными заменами) или состоит из следующей структуры

.

Холестерин является наименее распространенным липидом в кожном сале, составляя (вместе со своими сложными эфирами) примерно 2-4,5% от общего количества сальных липидов у человека. Повышая уровень холестерина в кожном сале, изобретение может позволить бороться с состояниями, связанными с возрастным снижением уровня холестерина в коже. Уровни природного холестерина в коже начинают резко снижаться с середины пятого десятка лет, вызывая нарушение липидного барьера. Это приводит к усилению обезвоживания, растрескиванию кожи и повышению вероятности инфекции.

Указанный холестерин может иметь время удерживания приблизительно 24,2-24,6 минуты (например, приблизительно 24,4 минуты), например, на ГХ колонке.

Холестерин может иметь относительное время удерживания 0,95-1,1 минуты, 0,97-1,07 минуты, 1-1,05 минуты или 1,01-1,03 минуты (например, приблизительно 1,02 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографии).

Предпочтительно холестерин может иметь относительное время удерживания 1,01-1,03 минуты (например, приблизительно 1,02 минуты) по отношению ко времени удерживания сквалена (например, определяемому с помощью газовой хроматографии).

Термины "вызывающий секрецию", "вызывающий экскрецию" и "вызывающий высвобождение" в контексте указанного одного или больше сальных липидов означают, что уровень одного или больше сальных липидов в кожном сале повышается. Предпочтительные уровни такого повышения указаны ниже вместе с референсными/контрольными значениями, относительно которых такое увеличение может быть определено количественно. Во избежание неопределенности необходимо уточнить, что следующие варианты осуществления по-прежнему относятся к любому способу лечения, клостридиальному нейротоксину для применения, нетерапевтическому применению и косметическому способу, которые описаны в настоящем документе.

Термин "стимуляция омоложения кожи" предпочтительно количественно определяют по соответствующему повышению уровня одного или больше сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в кожном сале. Например, термин "омоложение кожи" предпочтительно относится к стимуляции молодости/молодого внешнего вида кожи за счет эффектов сальных липидов, описанных в настоящем документе, например, эффектов, включающих улучшенную гидратацию кожи, эластичность и т.д. Таким образом, следующий вариант осуществления, описывающий повышение уровней сальных липидов, можно комбинировать с любым нетерапевтическим применением и/или косметическим способом, описанным в настоящем документе, для количественной оценки стимуляции омоложения кожи. Например, когда уровень одного или больше сальных липидов в кожном сале повышается по меньшей мере на 10%, можно сказать, что омоложение кожи увеличилось на соответствующий уровень (10%).

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень одного или больше сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться. Например, уровень одного или больше сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%). Предпочтительно указанное повышение представляет собой повышение по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение может быть повышением по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в кожном сале (например, кожном сале пациента) пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

Например, после введения клостридиального нейротоксина согласно изобретению:

- уровень жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%);

- уровень сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%);

- уровень сквалена в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%); и/или

- уровень холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%).

Предпочтительно указанное повышение представляет собой повышение по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение может быть повышением по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в кожном сале (например, кожном сале пациента) пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. Например, после введения клостридиального нейротоксина уровень жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно уровень жирной кислоты в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может быть повышен по меньшей мере на 50%. Указанное повышение уровня жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем жирной кислоты в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение уровня жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем жирной кислоты в кожном сале пациента до введения клостридиального нейротоксина. По всему тексту данного описания сравнения уровней липидов предпочтительно относятся к сравнению на участке введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень сложного воскового эфира в кожном сале (например, в кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. Например, после введения клостридиального нейротоксина уровень сложного воскового эфира в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно уровень сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышен по меньшей мере на 50%. Указанное повышение уровня воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем сложного воскового эфира в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение уровня воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем сложного воскового эфира в кожном сале пациента перед введением клостридиального нейротоксина. По всему тексту данного описания сравнения уровней липидов предпочтительно относятся к сравнению в месте введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень сквалена в кожном сале (например, в кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% или 160%. Например, после введения клостридиального нейротоксина уровень сквалена в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно уровень сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышен по меньшей мере на 50%. Указанное повышение уровня сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем сквалена в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение уровня сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем сквалена в кожном сале пациента до введения клостридиального нейротоксина. По всему тексту данного описания сравнения уровней липидов предпочтительно относятся к сравнению в месте введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина уровень холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% или 160%. Например, после введения клостридиального нейротоксина уровень холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно уровень холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышен по меньшей мере на 50%. Указанное повышение уровня холестерина в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с уровнем холестерина в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение уровня холестерина в кожном сале (например, у пациента кожного сала) может быть повышением по сравнению с уровнем холестерина в кожном сале пациента до введения клостридиального нейротоксина. По всему тексту данного описания сравнения уровней липидов предпочтительно относятся к сравнению в месте введения клостридиального нейротоксина.

Введение клостридиального нейротоксина может увеличивать в кожном сале долю, которую составляет жирная кислота, сложный восковой эфир, холестерин и/или сквален.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина согласно изобретению:

- относительная доля жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 57%), по меньшей мере, приблизительно 60%, 65%, 70%, 75% или 80%;

- относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 26%), по меньшей мере, приблизительно 30%, 35%, 40%, 45% или 50%;

- относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 12%), по меньшей мере, приблизительно 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40%; и/или

- относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 4,5%), по меньшей мере, приблизительно 5%, 10%, 15%, 20% или 25%.

Например, после введения клостридиального нейротоксина согласно изобретению:

- относительная доля жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 57%), приблизительно 60%, 65%, 70%, 75% или 80%;

- относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 26%), приблизительно 30%, 35%, 40%, 45% или 50%;

- относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 12%), приблизительно 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40%; и/или

- относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять (например, может повышаться по сравнению с типичными значениями, такими как 4,5%), приблизительно 5%, 10%, 15%, 20% или 25%.

Термин "относительная доля" означает общий объем сальных липидов в кожном сале по отношению к общему объему кожного сала. Относительную пропорцию предпочтительно измеряют как% объема сальных липидов по отношению к объему кожного сала (об./об.).

Сравнение указанной "относительной доли" может относиться к кожному салу в непосредственной близости от участка введения клостридиального нейротоксина, т.е. в пределах расстояния, меньше или равного 5 см, 4 см, 3 см, 2 см или 1 см от участка введения.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75% или 80%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75% или 80%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля жирных кислот в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере около 70%. Указанная относительная доля жирной кислоты в кожном сале может быть увеличена по сравнению с типичным значением (например, исходным значением), таким как приблизительно 57%.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40%, 45% или 50%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 35%, 40%, 45% или 50%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 40%. Указанная относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале может быть повышена по сравнению с обычным значением (например, исходным значением), таким как приблизительно 26%.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере примерно 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, 25%, 30%, 35% или 40%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 25%. Указанная относительная доля сквалена в кожном сале может быть повышена по сравнению с типичным значением (например, исходным значением), таким как приблизительно 12%.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 10% или 15%. В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20% или 25%. В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20% или 25%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может составлять по меньшей мере приблизительно 10%. Указанная относительная доля холестерина в кожном сале может быть повышена по сравнению с обычным значением (например, исходным значением), таким как приблизительно 4,5%.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля одного или больше сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться. Например, относительная доля одного или больше сальных липидов (например, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира) в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%). Предпочтительно указанное повышение представляет собой повышение по сравнению с относительной долей указанного одного или больше сальных липидов в кожном сале (например, кожном сале пациента) пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение может быть повышением по сравнению с относительной долей указанного одного или больше сальных липидов в кожном сале (например, кожном сале пациента) пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

Например, после введения клостридиального нейротоксина согласно изобретению:

- относительная доля жирных кислот в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно по меньшей мере на 60%);

- относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. (предпочтительно по меньшей мере на 60%);

- относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно не менее 60%); и/или

- относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (предпочтительно не менее 60%).

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля жирных кислот в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля жирных кислот в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно относительная доля жирной кислоты в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может быть повышена по меньшей мере на 50%. Указанное повышение относительной доли жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей жирной кислоты в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение относительной доли жирной кислоты в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей жирной кислоты в кожном сале пациента до введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно относительная доля сложного воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышена по меньшей мере на 50%. Указанное повышение относительной доли воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей воскового эфира в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение относительной доли воскового эфира в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей воскового эфира в кожном сале пациента перед введением клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, в кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% или 160%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно относительная доля сквалена в кожном сале (например, в кожном сале пациента) может быть повышена по меньшей мере на 50%. Указанное повышение относительной доли сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей сквалена в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение относительной доли сквалена в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей сквалена в кожном сале пациента до введения клостридиального нейротоксина.

В одном варианте осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, 110%, 120% или 130%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%. В некоторых вариантах осуществления после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) повышается по меньшей мере на 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% или 160%. Например, после введения клостридиального нейротоксина относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может повышаться по меньшей мере на 10%. Предпочтительно относительная доля холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышена по меньшей мере на 50%. Указанное повышение относительной доли холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей холестерина в кожном сале субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, указанное повышение относительной доли холестерина в кожном сале (например, кожном сале пациента) может быть повышением по сравнению с относительной долей холестерина в кожном сале пациента до введения клостридиального нейротоксина.

Индукция секреции сальных липидов (после введения клостридиального нейротоксина) может быть измерена путем обнаружения повышения уровня сальных липидов на поверхности кожи (например, в эпидермальном слое) пациента. Повышение предпочтительно измеряют относительно референсного стандарта, который не вводили с клостридиальным нейротоксином.

Повышение сальных липидов может быть определено любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, с конкретной ссылкой на Примеры, описанные в настоящем документе. Например, уровень липидов можно измерять, подвергая образец кожного сала анализу с помощью газовой хроматографии, с получением хроматограммы; и определяя площадь одного или больше специфических пиков на указанной хроматограмме, где указанные один или больше специфических пиков соответствуют жирной кислоте, восковому эфиру, сквалену и/или холестерину. Площадь указанного одного или больше специфических пиков позволяет определять уровень соответствующего липида в кожном сале. В таких способах образец кожного сала может быть собран (например, уже был собран) при контакте приспособления для сбора с поверхностью кожи. Примеры такого приспособления для сбора включают ватный тампон, стеклянный конус (или цилиндр), стеклянный диск, бумагу и/или гидрофобную пленку. Предпочтительно приспособление для сбора представляет собой стеклянный диск.

Предпочтительно "образец кожного сала" представляет собой экстракт липидов, включающий липиды, выделенные (например, очищенные) из кожного сала. Подходящие способы экстракции липидов описаны в Примерах.

В качестве альтернативы или дополнения, для измерения уровней молекулы, описанной в настоящем документе, могут использоваться иммунологические методы. Например, уровень пептида тахикинина (например, вещества P) можно измерять, подвергая выделенный образец кожи иммунологическому анализу, такому как ИФА.

Пептиды тахикинины представляют собой нейропептиды, обычно длиной от десяти до двенадцати аминокислотных остатков, наиболее известным из которых является вещество Р. Гены, которые продуцируют пептиды тахикинины, кодируют белки-предшественники, называемые препротахикининами, которые процессируются в более короткие пептиды (например, тахикининовые пептиды) в результате посттрансляционного протеолитического процессинга. Гены также кодируют множественные формы сплайсинга, состоящие из разных наборов пептидов. Тахикининовые пептиды участвуют в воспалении.

В одном варианте осуществления после введения клостридиальный нейротоксин может вызывать удерживание тахикининового пептида (предпочтительно вещества P) в дерме кожи. В одном варианте осуществления тахикининовый пептид представляет собой один или больше пептидов, выбранных из вещества P, нейрокинина A, нейропептида K или нейропептида гамма (предпочтительно, вещества P).

В одном варианте осуществления после введения клостридиальный нейротоксин может вызывать секрецию (например, экскрецию) одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи; и вызывать удерживание тахикининового пептида (предпочтительно вещества P) в дерме кожи.

"Вещество P" представляет собой пептид, который является членом семейства тахикининовых нейропептидов. Это нейропептид, действующий как нейромедиатор и как нейромодулятор. Вещество P и близкородственный ему нейрокинин A (NKA) продуцируются из полипротеинового предшественника после дифференциального сплайсинга гена препротахикинина A.

Вещество P, как указано в настоящем документе, может включать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100% (например, по меньшей мере 95%) идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO.: 17. Предпочтительно вещество P, как указано в настоящем документе, может включать или состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO.: 17.

Может быть особенно выгодным индуцировать как секрецию липидов, так и удерживание тахикининового пептида (предпочтительно вещества P). Удаление или нарушение основных сальных липидов в коже/роговом слое (которое может быть вызвано различными факторами окружающей среды и физическими факторами, такими как мыло, сухой воздух и возраст) является одним из этиологических факторов, вызывающих сухость и нарушение кожного барьера. В результате кожа теряет воду и становится сухой, потрескавшейся и покрытой трещинами, и позволяет проникать аллергенам, токсинам и микроорганизмам, которые могут вызывать воспаление и раздражение кожи. Воспаление, в свою очередь, может вызвать еще большее нарушение барьерной функции. Это можно смягчить либо путем индукции секреции сальных липидов, либо путем удерживания тахикининовых пептидов способом согласно изобретению, и, фактически, путем индукции секреции липидов и удерживания тахикининовых пептидов. Таким образом, изобретение позволяет предотвратить потерю барьерной функции сальных липидов, что может привести к таким состояниям кожи, как сильная сухость, зуд и расчесывание, которые в дальнейшем могут приводить к вторичным кожным инфекциям, таким как герпес, моллюск, бородавки, стафилококк, стрептококк, Pseudomonas, грибки, дрожжи и туберкулез.

Индукцию секреции сальных липидов (и/или уменьшение эритемы/шелушения) можно измерять у пациента/субъекта-человека (например, можно провести анализ выделенного образца кожного сала, полученного у пациента/субъекта-человека).

Для удобства индукцию секреции сальных липидов (и/или уменьшение эритемы/шелушения) можно измерять на подходящем модельном организме, таком как мышь.

Наиболее подходящим модельным организмом является (бесшерстная) мышь Rhino (несущая мутацию hr^rh-J). Мыши Rhino имеют клетки селезенки с нарушенным ответом на T-зависимые антигены мышей и имеют повышенное количество Thy1-положительных эпидермальных дендритных клеток. В результате к 5 неделям мыши Rhino теряют шерсть, и их кожа становится морщинистой и утолщается. Мыши Rhino в настоящее время являются широко известным модельным организмом для изучения кожных заболеваний (и влияния терапевтических/косметических средств на такие состояния кожи). Важно отметить, что мыши Rhino продолжают вырабатывать кожное сало (например, на эффективных уровнях дикого типа), которое можно легко собирать с поверхности кожи (например, с помощью стеклянного конуса) из-за отсутствия шерсти у мышей.

Дополнительные подробности по поводу клостридиальных нейротоксинов, охватываемых изобретением, представлены ниже вместе с технологической справочной информацией.

Бактерии рода Clostridia продуцируют сильнодействующие и специфические белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые они доставляются. Примеры таких клостридиальных токсинов включают нейротоксины, продуцируемые C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипов A-G, а также нейротоксины, продуцируемые C. baratii и C. butyricum.

Нейротоксины клостридий вызывают мышечный паралич в результате ингибирования холинергической передачи в периферической нервной системе, в частности, в нервно-мышечном синапсе, и, таким образом, могут вызвать летальный исход. В природе клостридиальные нейротоксины синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который подвергается посттрансляционной модификации в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных вместе дисульфидной связью. Расщепление происходит по специфическому сайту расщепления, часто называемому сайтом активации, который расположен между остатками цистеина, которые образуют межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепь), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. Н-цепь включает N-концевой компонент транслокации (H_N-домен) и С-концевой направляющий компонент (H_C-домен). Сайт расщепления расположен между L-цепью и H_N-доменом.

Механизм действия клостридиальных нейротоксинов включает пять отдельных этапов: (1) связывание H_C-домена с клеточной мембраной нейрона-мишени с последующей (2) интернализацией связанного токсина в клетку посредством эндосомы, (3) транслокацию L-цепи H_N-доменом через эндосомальную мембрану в цитозоль, (4) протеолитическое расщепление внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE, L-цепью, которая обеспечивает нецитотоксическую протеазную функцию, и (5) ингибирование клеточной секреции из клетки-мишени.

В этом каскаде событий белки SNARE (от англ. Soluble N-ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment protein REceptor - рецептор растворимых белков присоединения N-этилмалеимид-чувствительного фактора) являются неотъемлемой частью слияния внутриклеточных везикул и, таким образом, секреции молекул посредством везикулярного транспорта из клетки. Примеры белков SNARE, присутствующих в нейронах, включают, помимо прочего, SNAP-25, VAMP или синтаксин. Нецитотоксическая протеазная функция L-цепи, с другой стороны, является цинк-зависимой эндопептидазной активностью, которая демонстрирует высокую субстратную специфичность в отношении белков SNARE. Таким образом, после доставки в нейрональную клетку-мишень, нецитотоксическая протеаза клостридиальных нейротоксинов, при расщеплении своего субстратного белка SNARE, ингибирует высвобождение нейромедиатора, что впоследствии приводит к нейропараличу. Таким образом, клостридиальные нейротоксины действуют путем подавления секреции.

Благодаря своим уникальным свойствам клостридиальные нейротоксины, такие как ботулинический токсин, успешно применяются в целом ряде терапевтических направлений, в частности, при двигательных и вегетативных нарушениях, например, для восстановления активности гиперактивных нервных окончаний до нормального уровня. На данный момент описано по меньшей мере семь антигенно различающихся серотипов BoNT, а именно BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G (Rossetto, O. et al., "Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights". Nature Reviews Microbiology 12.8 (2014): 535-549). В дополнение к семи основным серотипам также существуют природные химерные серотипы, такие как BoNT/D-C (Moriishi et al., "Mosaic structures of neurotoxins produced from Clostridium botulinum types C and D organisms". Biochim Biophys Acta. (1996); 1307:123-126).

Кроме того, недавно был идентифицирован восьмой серотип, BoNT/X (Zhang, et al. "Identification and characterization of a novel botulinum neurotoxin". Nature Communications, vol 8, Article number: 14130 (2017)). Термин "клостридиальный нейротоксин" также может охватывать недавно открытые представители семейства белков ботулинического нейротоксина, экспрессируемые неклостридиальными микроорганизмами, такие как токсин, кодируемый Enterococcus, который имеет наиболее близкую к BoNT/X последовательность, токсин, кодируемый Weissella oryzae, называемый BoNT/Wo (NCBI Ref Seq: WP_027699549.1), который расщепляет VAMP2 по W89-W90, токсин, кодируемый Enterococcus faecium (GenBank: OTO22244.1), который расщепляет VAMP2 и SNAP25, и токсин, кодируемый Chryseobacterium pipero (NCBI Ref.Seq: WP_034687872.1).

Несмотря на такое разнообразие, BoNT/А остается предпочтительным при терапии серотипом, представленным в трех широкодоступных коммерческих препаратах (Ботокс®, Диспорт® и Ксеомин®), при этом на рынке доступен только один продукт BoNT/В (Нейроблок®/Миоблок®). На сегодняшний день эти препараты BoNT/A и BoNT/B, которые представляют собой токсины, очищенные из штаммов клостридий, являются двумя единственными серотипами BoNT, которые в настоящее время одобрены регулирующими органами для применения человеком в различных областях, включающих, помимо прочего, от спастичности, дисфункции мочевого пузыря или гипергидроза (для BoNT/A) (см., например: https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/870, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162, полностью включенные в настоящий документ посредством отсылки) до цервикальной дистонии (для BoNT/B) (см., например, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568, полностью включенный в настоящий документ посредством отсылки).

В отличие от цитотоксических протеаз (например, рицина, дифтерийного токсина, экзотоксина синегнойной палочки), которые действуют, вызывая гибель своей природной клетки-мишени, клостридиальные нейротоксины представляют собой нецитотоксические протеазы, действующие путем временного выведения из строя клеточной функции своей природной клетки-мишени. Важно отметить, что нецитотоксическая протеаза не убивает природную клетку-мишень, на которую она действует. В дополнение к клостридиальным нейротоксинам (например, ботулиническому нейротоксину, распространяемому на рынке под такими наименованиями, как Диспорт™, Нейроблок™ и Ботокс™), некоторые из наиболее известных примеров нецитотоксических протеаз включают протеазы IgA (см., например, WO99/032272) и протеазы антареазы (см., например, WO 2011/022357).

Термин "клостридиальный нейротоксин" при использовании в настоящем документе означает любой полипептид, который проникает в нейрон и ингибирует высвобождение нейромедиатора. Этот процесс охватывает связывание нейротоксина с низкоаффинным или высокоаффинным рецептором, интернализацию нейротоксина, транслокацию эндопептидазного фрагмента нейротоксина в цитоплазму и ферментативную модификацию субстрата нейротоксина. В частности, термин "нейротоксин" охватывает любой полипептид, продуцируемый бактериями Clostridium (клостридиальные нейротоксины), который проникает в нейрон и ингибирует высвобождение нейромедиатора, а также такие полипептиды, полученные с помощью рекомбинантных технологий или химических методов. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепь), молекулярная масса которой составляет примерно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепь), молекулярная масса которой составляет примерно 50 кДа. Предпочтительно клостридиальным нейротоксином является ботулинический нейротоксин (BoNT).

Серотипы BoNT от A до G можно различить на основе инактивации специфическими нейтрализующими антисыворотками, при этом такая классификация по серотипу коррелирует с процентной идентичностью последовательности на уровне аминокислот. Белки BoNT данного серотипа также подразделяются на различные подтипы на основе процента идентичности аминокислотных последовательностей.

Клостридиальный нейротоксин согласно изобретению может быть выбран из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X и TeNT (столбнячного нейротоксина). Предпочтительно клостридиальный нейротоксин является ботулиническим нейротоксином, таким как ботулинический нейротоксин, выбранный из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G и BoNT/X. Например, клостридиальный нейротоксин может быть выбран из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G.

В одном варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/A. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/A представлен как SEQ ID NO: 1 (номер доступа в UniProt A5HZZ9). Другой пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/A представлен как SEQ ID NO: 13 (номер доступа в UniProt P10845). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/B. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/B представлен как SEQ ID NO: 2 (номер доступа в UniProt B1INP5). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/C. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/C представлен как SEQ ID NO: 3 (номер доступа в UniProt P18640). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/D. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/D представлен как SEQ ID NO: 4 (номер доступа в UniProt P19321). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/E. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/E представлен как SEQ ID NO: 5 (номер доступа в WP_003372387). Другой пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/E представлен как SEQ ID NO: 16 (номер доступа в UniProt Q00496). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/F. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/F представлен как SEQ ID NO: 6 (номер доступа в UniProt Q57236) или как SEQ ID NO: 9 (номер доступа в UniProt/UniParc UPI0001DE3DAC). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/G. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/G представлен в виде SEQ ID NO: 7 (номер доступа WP_039635782). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/D-C. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/D-C представлен как SEQ ID NO: 8 (номер доступа BAM65681). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/X. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/X представлен как SEQ ID NO: 11 (номер доступа BAQ12790.1). В другом варианте осуществления клостридиальным нейротоксином может быть TeNT. Пример аминокислотной последовательности нейротоксина TeNT представлен как SEQ ID NO: 12 (номер доступа в UniProt P04958).

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин состоит из или включает аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин состоит из или содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

Используемый в описании термин "процент идентичности последовательности" между двумя или более аминокислотными последовательностями означает функцию количества идентичных аминокислот в идентичных положениях, совпавших в выровненных аминокислотных последовательностях. Таким образом, % идентичности при использовании в настоящем документе может быть вычислен как количество идентичных аминокислот в каждом положении в выравнивании, деленное на общее количество аминокислот в выровненной последовательности, умноженное на 100. При вычислении % идентичности последовательностей также можно учитывать количество пропусков и длину каждого пропуска, которые требуется ввести для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями может быть выполнено при использовании конкретных математических алгоритмов, в частности математического алгоритма глобального выравнивания (такого, как описано в Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3), 443-453), 1972), который будет знаком специалисту.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин состоит из или включает аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1. Например, клостридиальный нейротоксин может состоять из или включать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (более предпочтительно по меньшей мере 95%) идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин состоит из или включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (например, BoNT/A).

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин состоит из или включает аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 13. Например, клостридиальный нейротоксин может состоять или содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% (более предпочтительно, по меньшей мере 95%) идентичности последовательности с SEQ ID NO: 13. В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин состоит из или включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 (например, BoNT/A).

Термин "клостридиальный нейротоксин" охватывает гибридные и химерные клостридиальные нейротоксины. В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин является химерным нейротоксином.

Гибридный клостридиальный нейротоксин включает, по меньшей мере, часть легкой цепи одного клостридиального нейротоксина или его подтипа и, по меньшей мере, часть тяжелой цепи другого клостридиального нейротоксина или подтипа клостридиального нейротоксина. В одном варианте осуществления гибридный клостридиальный нейротоксин может содержать всю легкую цепь из одного подтипа клостридиального нейротоксина и тяжелую цепь другого подтипа клостридиального нейротоксина. В другом варианте осуществления химерный клостридиальный нейротоксин может содержать часть (например, связывающий домен) тяжелой цепи одного подтипа клостридиального нейротоксина, при этом другая часть тяжелой цепи происходит из другого подтипа клостридиального нейротоксина. Аналогично или альтернативно, терапевтический элемент может включать части легкой цепи разных клостридиальных нейротоксинов. Такие гибридные или химерные клостридиальные нейротоксины могут применяться, например, в качестве средств для доставки терапевтических эффектов таких клостридиальных нейротоксинов субъектам, которые иммунологически резистентны к данному подтипу клостридиальных нейротоксинов, субъектам, которые могут иметь ниже средней концентрации рецепторов к данному домену, связывающему тяжелую цепь клостридиального нейротоксина, или субъектам, которые могут иметь устойчивый к действию протеазы вариант мембранного или везикулярного субстрата токсина (например, SNAP-25, VAMP и синтаксин). Гибридные и химерные клостридиальные нейротоксины описаны в US 8,071,110, публикация которого полностью включена в настоящий документ посредством отсылки. Таким образом, в одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин (или его фрагмент) согласно изобретению является гибридным клостридиальным нейротоксином или химерным клостридиальным нейротоксином.

Термин "химерный нейротоксин", который может использоваться в настоящем документе, означает нейротоксин, включающий один или больше доменов, происходящих из первого нейротоксина, и один или больше доменов, происходящих из второго нейротоксина. Например, химерный нейротоксин может включать домен LH_N, происходящий из первого серотипа или подтипа нейротоксина, и домен H_C, происходящий из второго серотипа или подтипа нейротоксина. Другим примером химерного нейротоксина является нейротоксин, включающий домен LH_N-H_CN, происходящий из первого серотипа или подтипа нейротоксина, и домен H_CC, происходящий из второго серотипа или подтипа нейротоксина. Еще одним примером химерного нейротоксина является нейротоксин, включающий домен LH_N из первого серотипа или подтипа нейротоксина и активирующую петлю из второго серотипа или подтипа нейротоксина. Примеры химерных нейротоксинов представлены в WO2017191315 и WO2016156113, которые полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Термин "H_C-домен" при использовании в настоящем документе относится к функционально отличающейся области тяжелой цепи нейротоксина с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, которая обеспечивает связывание нейротоксина с рецептором, расположенным на поверхности клетки-мишени. Домен H_C состоит из двух структурно отличающейся субдоменов, "субдомена H_CN" (N-концевой части H_C домена) и "субдомена H_CC" (C-концевой части H_C домена, также называемого Hcc доменом), каждый из которых имеет молекулярную массу приблизительно 25 кДа. Домен H_CC способен связываться с рецептором белка клостридиального нейротоксина.

Термин "домен LH_N" при использовании в настоящем документе относится к области нейротоксина, которая отличается от H_C домена, и состоит из эндопептидазного домена ("L" или "легкой цепи") и домена, который отвечает за транслокацию эндопептидазы в цитоплазму (H_N домена тяжелой цепи). Эндопептидазный домен ("L" или "легкая цепь") способен расщеплять белок SNARE.

Примеры доменов L, H_N, H_CN и H_CC показаны в Таблице 1.

Таблица 1 - Примеры доменов L, H_N, H_CN и H_CC

BoNT Номер доступа SEQ ID NO: L H_N H_CN H_CC BoNT/A1 A5HZZ9 1 1-448 449-872 873-1094 1095-1296 BoNT/B1 B1INP5 2 1-441 442-859 860-1081 1082-1291 BoNT/C1 P18640 3 1-449 450-867 868-1095 1096-1291 BoNT/D P19321 4 1-442 443-863 864-1082 1083-1276 BoNT/E1 WP_003372387 5 1-423 424-846 847-1069 1070 -1252 BoNT/F1 Q57236 6 1-439 440-865 866-1087 1088-1278 BoNT/F7 UPI0001DE3DAC 9 1-508 509-862 863-1076 1077-1268 BoNT/G WP_039635782 7 1-446 447-864 865-1089 1090-1297 BoNT/DC BAM65681 8 1-442 443-863 864-1091 1092-1285 BoNT/X BAQ12790.1 11 1-439 440-892 893-1306

Идентифицированные выше референсные последовательности нужно считать оринтиром, поскольку небольшие изменения могут присутствовать в соответствии с субсеротипами. В качестве примера, в US 2007/0166332 (которым настоящим включен посредством отсылки во всей полноте) приведены несколько отличающиеся клостридиальные последовательности.

Термин "активирующая петля" относится к полипептидному домену, включающему сайт протеолитического расщепления. Активирующие петли нейротоксинов описаны в уровне техники, например, в WO 2016156113 (полностью включенной в настоящее описание посредством отсылки).

Например, химерный нейротоксин может включать LH_N домен первого нейротоксина, ковалентно связанный с H_C доменом второго нейротоксина, где предпочтительно указанные первый и второй нейротоксины различны,

где С-концевой аминокислотный остаток указанного LH_N домена соответствует первому аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_Nи H_C, в указанном первом нейротоксине, и

где N-концевой аминокислотный остаток указанного H_C домена соответствует второму аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном втором нейротоксине.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин представляет собой химерный нейротоксин, который включает H_C домен из BoNT/B, и LH_N домен из BoNT/A, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F или BoNT/ G (например, BoNT/A).

Например, в одном варианте осуществления H_C домен состоит из или включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 860-1291 из SEQ ID NO: 2 (например, BoNT/B), или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности, и домен LH_N состоит или включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- аминокислотных остатков 1-872 из SEQ ID NO: 1 (например, BoNT/A) или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-867 SEQ ID NO: 3 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-863 SEQ ID NO: 4 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-846 SEQ ID NO: 5 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-865 SEQ ID NO: 6 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-864 SEQ ID NO: 7 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-863 SEQ ID NO: 8 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними, и

- аминокислотных остатков 1-862 SEQ ID NO: 9 или последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин согласно настоящему изобретению может быть химерным клостридиальным нейротоксином, включающим (предпочтительно состоящим из) легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A, и рецепторсвязывающий домен BoNT/B (домен HC), или их часть (например, BoNT/A LH_N-BoNT/B H_C). Подходящий химерный и/или гибридный клостридиальный нейротоксин может быть описан в WO 2017/191315 A1, которая включена в настоящий документ посредством отсылки. Химерный клостридиальный нейротоксин может включать (предпочтительно состоять из) последовательность SEQ ID NO: 10.

Домен LH_N BoNT/A может быть ковалентно связан с H_C доменом BoNT/B. Указанный химерный BoNT/A также указан в настоящем документе как "BoNT/AB" или "химера BoNT/AB".

С-концевой аминокислотный остаток LH_N домена может соответствовать первому аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей LH_N и H_C домены BoNT/A, а N-концевой аминокислотный остаток H_C домена может соответствовать второму аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в BoNT/B.

В настоящем документе ссылка на "первый аминокислотный остаток спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C BoNT/A" означает N-концевой остаток спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C. В настоящем документе ссылка на "второй аминокислотный остаток спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C BoNT/B", означает аминокислотный остаток, следующий после N-концевого остатка спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C.

"Спираль 3₁₀" представляет собой тип вторичной структуры, обнаруженный в белках и полипептидах, наряду с α-спиралями, β-листами и обратными витками. Аминокислоты в спирали 3₁₀ расположены в правовращающей спиральной структуре, где каждый полный виток завершается тремя остатками и десятью атомами, которые разделяют внутримолекулярную водородную связь между ними. Каждая аминокислота соответствует обороту спирали на 120° (т.е. спираль содержит по три остатка в каждом витке) и смещению на 2,0 Å (=0,2 нм) по оси спирали, и содержит 10 атомов в кольце, образованном при образовании водородной связи. Наиболее важно то, что N-H-группа аминокислоты образует водородную связь с C=O-группой аминокислоты за три остатка ранее; такая повторяющаяся i+3→i водородная связь определяет спираль 3₁₀. Спираль 3₁₀ - это стандартная концепция в структурной биологии, которая знакома специалисту.

Эта спираль 3₁₀ соответствует четырем остаткам, которые образуют настоящую спираль и два кэпирующих (или переходных) остатка, по одному на каждом конце этих четырех остатков. Термин "спираль 3₁₀, разделяющая домены LH_N и H_C", используемый в настоящем документе, состоит из этих 6 остатков.

При проведении структурного анализа и выравнивания последовательностей была идентифицирована спираль 3₁₀, разделяющая домены LH_N и H_C. Эта спираль 3₁₀ окружена α-спиралью на ее N-конце (т.е. в С-концевой части домена LH_N) и β-цепью на ее С-конце (т.е. в N-концевой части домена H_C). Первый (N-концевой) остаток (кэп или переходный остаток) спирали 3₁₀ также соответствует С-концевому остатку этой α-спирали.

Спираль 3₁₀, разделяющая домены LH_N и H_C, может быть, например, определена на основе общедоступных кристаллических структур ботулинических нейротоксинов, например, 3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA) и 1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW), для ботулинических нейротоксинов A1 и B1 соответственно.

Инструменты моделирования и выравнивания in silico, которые также общедоступны, можно использовать для определения положения спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в других нейротоксинах, например, серверы моделирования гомологии LOOPP (от англ. Learning, Observing and Outputting Protein Patterns - Изучение, наблюдение и вывод белковых структур, http://loopp.org), PHYRE (от англ. Protein Homology/AnalogY Recognition Engine - средство распознавания гомологии/аналогии белков, http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) и Rosetta (https://www.rosettacommons.org/), сервер наложения белков SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/), программа выравнивания Clustal Omega (http://www.clustal.org/omega/) и ряд других инструментов/сервисов, перечисленных на Интернет-ресурсах для молекулярных и клеточных биологов (http://molbiol-tools.ca/). В частности, область вокруг соединения "H_N/H_CN" является структурно высококонсервативной, что делает ее идеальной областью для наложения различных серотипов.

Например, для определения последовательности этой спирали 3₁₀ в других нейротоксинах можно использовать следующую методологию:

1. Инструмент моделирования структурной гомологии LOOP (http://loopp.org) использовали для получения предсказанной структуры других серотипов BoNT на основе кристаллической структуры BoNT/A1 (3BTA.pdb);

2. Полученные в результате структурные (pdb) файлы отредактировали для включения только N-концевой части домена H_CN и около 80 остатков перед ним (которые являются частью домена H_N), сохранив, таким образом, область "H_N/H_CN", которая структурно высококонсервативна;

3. Сервер наложения белков SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/) использовали для наложения каждого серотипа на структуру 3BTA.pdb;

4. Наложенные файлы pdb изучили для определения положения спирали 3₁₀ в начале H_C домена BoNT/A1, а затем идентифицировали соответствующие остатки в другом серотипе;

5. Последовательности других серотипов BoNT были выравнены с помощью Clustal Omega для проверки правильности соответствующих остатков.

Примеры доменов LH_N, H_C и спирали 3₁₀, определенные с помощью данного способа, представлены ниже:

Нейротоксин Номер доступа (Плюс версия последовательности после десятичного знака) LH_N H_C Спираль 3₁₀ BoNT/A1
(SEQ ID NO: 1) A5HZZ9.1 1-872 873-1296 ⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷ BoNT/A2 X73423.3 1-872 873-1296 ⁸⁷²NIVNTS⁸⁷⁷ BoNT/A3 DQ185900.1 (также Q3LRX9.1) 1-872 873-1292 ⁸⁷²NIVNTS⁸⁷⁷ BoNT/A4 EU341307.1 (также Q3LRX8.1) 1-872 873-1296 ⁸⁷²NITNAS⁸⁷⁷ BoNT/A5 EU679004.1 (также C1IPK2.1) 1-872 873-1296 ⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷ BoNT/A6 FJ981696.1 1-872 873-1296 ⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷ BoNT/A7 JQ954969.1 (также K4LN57.1) 1-872 873-1296 ⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷ BoNT/A8 KM233166.1 1-872 873-1297 ⁸⁷²NITNTS⁸⁷⁷ BoNT/B1 (также SEQ ID NO: 2) B1INP5.1 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B2 AB084152.1 (также Q8GR96.1) 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B3 EF028400.1 (также A2I2S2.1) 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B4 EF051570.1 (также A2I2W0.1) 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B5 EF033130.1 (также A2I2U6.1) 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹DILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B6 AB302852.1 (также A8R089.1) 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B7 JQ354985.1 (также H9CNK9.1) 1-859 860-1291 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴ BoNT/B8 JQ964806.1 (также I6Z8G9.1) 1-859 860-1292 ⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴

При использовании структурного анализа и выравнивания последовательностей было обнаружено, что β-цепь, следующая после спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C, является консервативной структурой во всех ботулинических и столбнячных нейротоксинах и начинается с 8-го остатка, если начинать с первого остатка спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C (например, по остатку 879 в случае BoNT/A1).

Химера BoNT/AB может включать домен LH_N из BoNT/A, ковалентно связанный с доменом H_C из BoNT/B,

• где C-концевой аминокислотный остаток домена LH_N соответствует восьмому аминокислотному остатку на N-конце относительно β-цепи, расположенной вначале (на N-конце) H_C домена BoNT/A, и

• где N-концевой аминокислотный остаток домена H_C соответствует седьмому аминокислотному остатку на N-конце относительно β-цепи, расположенной вначале (на N-конце) H_C домена BoNT/B.

Химера BoNT/AB может включать домен LH_N из BoNT/A, ковалентно связанный с H_C доменом из BoNT/B,

• где C-концевой аминокислотный остаток домена LH_N соответствует C-концевому аминокислотному остатку α-спирали, расположенной на конце (C-конце) LH_N домена BoNT/A, и

• где N-концевой аминокислотный остаток H_C домена соответствует аминокислотному остатку непосредственно на C-конце относительно C-концевого аминокислотного остатка α-спирали, расположенной на конце (C-конце) LH_N домена BoNT/B.

Смысл процесса проектирования химеры BoNT/AB заключался в попытке обеспечить отсутствие нарушений вторичной структуры и тем самым свести к минимуму любые изменения в третичной структуре и в функции каждого домена. Без ограничения теорией предполагается, что отсутствие нарушения четырех центральных аминокислотных остатков спирали 3₁₀ в химере BoNT/AB обеспечивает оптимальную конформацию химерного нейротоксина, что позволяет химерному нейротоксину полностью выполнять свои функции.

В предпочтительном варианте клостридиальный нейротоксин является химерным нейротоксином, который включает H_C домен из BoNT/B и LH_N домен из BoNT/A.

Домен LH_N из BoNT/A может соответствовать аминокислотным остаткам 1-872 из SEQ ID NO: 1 или полипептидной последовательности, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью последовательности. Домен LH_N из BoNT/A может соответствовать аминокислотным остаткам 1-872 из SEQ ID NO: 1 или полипептидной последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, 90% или 95% идентичностью последовательности. Предпочтительно LH_N домен из BoNT/A соответствует аминокислотным остаткам 1-872 SEQ ID NO: 1.

Домен H_C из BoNT/B может соответствовать аминокислотным остаткам 860-1291 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью последовательности. Домен H_C из BoNT/B может соответствовать аминокислотным остаткам 860-1291 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, 90% или 95% идентичностью последовательности. Предпочтительно H_C домен из BoNT/B соответствует аминокислотным остаткам 860-1291 из SEQ ID NO: 2. В более предпочтительном варианте осуществления H_C домен состоит из или включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 860-1291 из SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней, и LH_N домен включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 1-872 из SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

Химера BoNT/AB может включать LH_N домен BoNT/A и H_C домен BoNT/B. Домен LH_N может соответствовать аминокислотным остаткам 1-872 BoNT/A (SEQ ID NO: 1), и H_C домен может соответствовать аминокислотным остаткам 860-1291 BoNT/B (SEQ ID NO: 2).

Клостридиальный нейротоксин, содержащий одну или более модификаций (предпочтительно в аминокислотной последовательности тяжелой цепи), в настоящем документе именуется "модифицированным клостридиальным нейротоксином".

Домен H_C BoNT/B может дополнительно включать замену, добавление или делецию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в субдомене H_CC, что приводит к увеличению аффинности связывания нейротоксина BoNT/B с Syt II человека по сравнению с природной последовательностью BoNT/B. Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотных остатков в субдомене H_CC BoNT/B были раскрыты в WO 2013/180799 и в WO 2016/154534 (обе заявки включены в настоящий документ посредством отсылки).

Например, в вариантах осуществления, где клостридиальный нейротоксин включает H_C домен из BoNT/B (например, где клостридиальный нейротоксин представляет собой BoNT/B или химерный нейротоксин, который включает H_C домен из BoNT/B), клостридиальный нейротоксин может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (например, в H_C домене) с получением "модифицированной тяжелой цепи", где указанная модифицированная тяжелая цепь предпочтительно связывается с нервными клетками-мишенями с более высокой (или более низкой) аффинностью, чем нативный нейротоксин. Такие модификации в H_C домене могут включать модификации аминокислотных остатков в участке связывания ганглиозидов домена H_CC, которые могут изменять связывание с ганглиозидом нервной клетки-мишени, и/или модификации аминокислотных остатков в участке связывания рецептора белка H_CC домена, которые могут изменять связывание с рецептором белка нервной клетки-мишени. Примеры таких модифицированных нейротоксинов описаны в WO 2006027207 и WO 2006114308, которые полностью включены в настоящий документ посредством отсылки.

В одном варианте осуществления модифицированного клостридиального нейротоксина согласно изобретению H_CC домен из BoNT/B модифицирован по сравнению с природным H_CC доменом указанных серотипов BoNT.

В предпочтительном варианте осуществления H_CC домен из нейротоксина BoNT/B включает по меньшей мере одну мутацию аминокислотного остатка, которая увеличивает аффинность связывания указанного H_CC домена с Syt II человека по сравнению с природным H_CC доменом BoNT/B. В любом случае, указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка предпочтительно увеличивает аффинность связывания указанного H_CC домена с Syt II человека по меньшей мере на 50% по сравнению с природным H_CC доменом BoNT/B.

Такие подходящие мутации аминокислотных остатков в H_CC домене BoNT/B были описаны в уровне техники в WO 2013180799 и WO 2016154534, которые включены в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте.

В частности, указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка, подходящая для увеличения аффинности связывания H_CC домена BoNT/B с Syt II человека по меньшей мере на 50% по сравнению с природным H_CC доменом BoNT/B, является заменой, добавлением или делецией аминокислотного остатка, выбранным из группы, состоящей из: 1118M, 1183M, 1191M, 1191I, 1191Q, 1191T, 1199Y, 1199F, 1199L, 1201V, 1191C, 1191V, 1191L, 1191Y, 1199W, 1199E, 1199H, 1178Y, 1178Q, 1178A, 1178S, 1183C, 1183P и их любых комбинаций. Предпочтительно указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка в H_CC домене BoNT/B состоит из замен, добавлений или делеций двух аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: 1191M и 1199L, 1191M и 1199Y, 1191M и 1199F, 1191Q и 1199L, 1191Q и 1199Y, 1191Q и 1199F, 1191M и 1199W, 1191M и 1178Q, 1191C и 1199W, 1191C и 1199Y, 1191C и 1178Q, 1191Q и 1199W, 1191V и 1199W, 1191V и 1199Y или 1191V и 1178Q. Еще предпочтительнее указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка в H_CC домене BoNT/B состоит из замен, добавлений или делеций трех аминокислотных остатков: 1191M, 1199W и 1178Q. Более предпочтительно указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка в H_CC домене BoNT/B состоит из замен, добавлений или делеций двух аминокислотных остатков: 1191M и 1199Y.

В более предпочтительном варианте осуществления указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка, подходящая для увеличения аффинности связывания H_CC домена BoNT/B к Syt II человека по меньшей мере на 50% по сравнению с природным H_CC доменом BoNT/B, является заменой аминокислотного остатка, выбранной из группы, состоящей из: V1118M, Y1183M, E1191M, E1191I, E1191Q, E1191T, S1199Y, S1199F, S1199L, S1201V, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их любых комбинаций. Предпочтительно указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка в H_CC домене BoNT/B состоит из двух замен аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: E1191M и S1199L, E1191M и S1199Y, E1191M и S1199F, E1191Q и S1199L, E1191Q и S1199Y, E1191Q и S1199F, E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W, E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y или E1191V и W1178Q. Еще предпочтительнее указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка в H_CC домене BoNT/B состоит из трех замен аминокислотных остатков: E1191M, S1199W и W1178Q. Более предпочтительно указанная мутация по меньшей мере одного аминокислотного остатка в H_CC домене BoNT/B состоит из двух замен аминокислотных остатков: E1191M и S1199Y.

Другими словами, подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в субдомене H_CC BoNT/B включают мутации с заменой, выбранные из группы, состоящей из: V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций. Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в субдомене H_CC BoNT/B дополнительно включает комбинации двух мутаций с заменой, выбранные из группы, состоящей из: E1191M и S1199L, E1191M и S1199Y, E1191M и S1199F, E1191Q и S1199L, E1191Q и S1199Y, E1191Q и S1199F, E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W, E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y или E1191V и W1178Q. Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в субдомене H_CC BoNT/B также включает комбинацию трех мутаций с заменой, которые представляют собой E1191M, S1199W и W1178Q.

Предпочтительно подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в субдомене H_CC BoNT/B включает комбинацию двух мутаций с заменой, которые представляют собой E1191M и S1199Y.

Модификация может быть модификацией по сравнению с немодифицированным BoNT/B, показанным как SEQ ID NO: 2, где нумерация аминокислотных остатков определяется путем выравнивания с SEQ ID NO: 2. Поскольку присутствие остатка метионина в положении 1 в SEQ ID NO: 2 является необязательным, специалист примет во внимание присутствие/отсутствие остатка метионина при определении нумерации аминокислотных остатков. Например, когда SEQ ID NO: 2 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, E1191 будет E1191 в SEQ ID NO: 2). В альтернативном варианте, когда метионин в SEQ ID NO: 2 отсутствует, нумерация аминокислотных остатков должна быть изменена на -1 (например, E1191 будет E1190 в SEQ ID NO: 2). Аналогичные соображения применимы, когда метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, описанных в настоящем документе, присутствует/отсутствует, при этом специалист в данной области легко определит правильную нумерацию аминокислотных остатков, используя методы, стандартные в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления H_CC домен BoNT/B, подлежащий модификации, соответствует аминокислотным остаткам 1082-1291 в SEQ ID NO: 2 (природный H_CC домен BoNT/B) или аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности.

В одном варианте клостридиальный нейротоксин согласно настоящему изобретению может быть как химерным, так и модифицированным, как описано выше. Например, в предпочтительном варианте клостридиальный нейротоксин включает (или состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85% 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности.

В одном варианте клостридиальный нейротоксин согласно настоящему изобретению может быть как химерным, так и модифицированным, как описано выше. Например, в предпочтительном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин включает (или состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (например, BoNT/AB_MY) или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности.

Модифицированный клостридиальный нейротоксин может содержать одну или больше модификаций в аминокислотной последовательности легкой цепи, например, модификации в субстратсвязывающем или каталитическом домене, которые могут изменять или модифицировать специфичность белка SNARE модифицированной L-цепи. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2010/120766 и US 2011/0318385, которые полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Модифицированный клостридиальный нейротоксин может включать одну или больше модификаций, которые повышают или снижают биологическую активность и/или биологическую устойчивость модифицированного клостридиального нейротоксина. Например, модифицированный клостридиальный нейротоксин может содержать мотив на основе лейцина или тирозина, где указанный мотив увеличивает или снижает биологическую активность и/или биологическую устойчивость модифицированного клостридиального нейротоксина. Подходящие мотивы на основе лейцина включают xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL и xExxxLM (где x является любой аминокислотой). Подходящие мотивы на основе тирозина включают Y-x-x-Hy (где Hy является гидрофобной аминокислотой). Примеры модифицированных клостридиальных нейротоксинов, включающих мотивы на основе лейцина и тирозина, описаны в WO 2002/08268, которая полностью включена в настоящий документ посредством отсылки.

Как описано ниже, модифицированный клостридиальный нейротоксин (или фрагмент клостридиального нейротоксина) может включать одну или больше модификаций, которые повышают изоэлектрическую точку клостридиального нейротоксина по сравнению с эквивалентным немодифицированным клостридиальным нейротоксином, не имеющим указанной одной или больше модификаций. Подходящие модифицированные клостридиальные нейротоксины описаны выше и в WO 2015/004461 A1 и WO 2016/110662 A1, которые включены в настоящий документ посредством отсылки. Примеры последовательностей включают SEQ ID NO: 61 и 42, описанные в настоящем документе.

Модифицированный клостридиальный нейротоксин предпочтительно может включать или состоять из последовательности SEQ ID NO: 15.

В одном варианте осуществления модифицированный клостридиальный нейротоксин предпочтительно может включать или состоять из последовательности SEQ ID NO: 10.

В особенно предпочтительном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин согласно изобретению может включать модифицированный BoNT/A или его фрагмент (предпочтительно H_C домен BoNT/A или его фрагмент). Модифицированный BoNT/A или его фрагмент может включать модификацию одного или более аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277. Такой модифицированный BoNT/A или его фрагмент может демонстрировать снижение или отсутствие побочных эффектов по сравнению с применением известных BoNT/A. Улучшенные свойства удерживания в ткани модифицированного BoNT/A согласно изобретению также могут обеспечивать повышенную эффективность и/или длительность действия и могут позволить применять сниженные дозы по сравнению с известными терапевтическими средствами клостридиального токсина (или повышенные доз без каких-либо дополнительных нежелательных эффектов), что обеспечивает дополнительные преимущества.

Модификация может быть модификацией по сравнению с немодифицированным BoNT/A, показанным как SEQ ID NO: 1, где нумерация аминокислотных остатков определена при выравнивании с SEQ ID NO: 1. Поскольку присутствие остатка метионина в положении 1 в SEQ ID NO: 1 (а также в SEQ ID NO, соответствующих модифицированным полипептидам BoNT/A или их фрагментам, описанным в настоящем документе) является необязательным, специалист в данной области примет во внимание присутствие/отсутствие остатка метионина при определении нумерации аминокислотных остатков. Например, когда SEQ ID NO: 1 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, ASN 886 будет ASN 886 SEQ ID NO: 1). В альтернативном варианте, когда метионин в SEQ ID NO: 1 отсутствует, нумерация аминокислотных остатков должна быть изменена на -1 (например, ASN 886 будет ASN 885 SEQ ID NO: 1). Аналогичные соображения применимы, когда метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, описанных в настоящем документе, присутствует/отсутствует, при этом специалист в данной области легко определит правильную нумерацию аминокислотных остатков, используя методы, стандартные в данной области.

Аминокислотные остатки, указанные выше для модификации, представляют собой аминокислотные остатки, экспонированные на поверхности.

Модифицированный BoNT/A или его фрагмент может включать модификацию одного или больше аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277.

Термин "один или больше аминокислотных остатков" при использовании в отношении модифицированного BoNT/A или его фрагмента предпочтительно означает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 указанных аминокислотных остатков. Таким образом, модифицированный BoNT/A может включать по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 (предпочтительно 7) модификаций по указанным аминокислотным остаткам. Модифицированный BoNT/A или его фрагмент может включать 1-30, 3-20 или 5-10 аминокислотных модификаций. Более предпочтительно термин "один или больше аминокислотных остатков" при использовании в отношении модифицированного BoNT/A или его фрагмента означает все указанные аминокислотные остатки.

Предпочтительно, помимо одной или больше аминокислотных модификаций по указанному аминокислотному остатку(ам), модифицированный BoNT/A или его фрагмент не содержит каких-либо дополнительных аминокислотных модификаций по сравнению с SEQ ID NO: 1.

Модификация может быть выбрана из следующего:

i. замена кислотного поверхностного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком;

ii. замена кислотного поверхностного аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком;

iii. замена незаряженного поверхностного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком;

iv. вставка основного аминокислотного остатка; и

v. делеция кислотного поверхностного аминокислотного остатка.

Модификация, как указано выше, приводит к модифицированному BoNT/A или его фрагменту, который имеет повышенный положительный поверхностный заряд и повышенную изоэлектрическую точку по сравнению с соответствующим немодифицированным BoNT/A или его фрагментом.

Изоэлектрическая точка (pI) является специфическим свойством данного белка. Как хорошо известно из уровня техники, белки состоят из определенной последовательности аминокислот (также называемых в белке аминокислотными остатками). Каждая аминокислота из стандартного набора двадцати аминокислот имеет отличающуюся боковую цепь (или группу R), что означает то, что каждый аминокислотный остаток в белке проявляет разные химические свойства, такие как заряд и гидрофобность. На эти свойства может влиять химическое окружение, такое как температура и рН. Общие химические характеристики белка будут зависеть от суммы этих различных факторов.

Некоторые аминокислотные остатки (подробно описанные ниже) обладают ионизируемыми боковыми цепями, которые могут демонстрировать разный электрический заряд в зависимости от рН окружающей среды. Заряжена ли такая боковая цепь или нет при данном pH, зависит от pKa соответствующего ионизируемого фрагмента, где pKa представляет собой отрицательный логарифм константы диссоциации кислоты (Ka) для определенного протона из конъюгированного основания.

Например, кислотные остатки, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, содержат карбоксильные группы боковой цепи со значениями pKa приблизительно 4,1 (точные значения pKa могут зависеть от температуры, ионной силы и микроокружения ионизируемой группы). Таким образом, эти боковые цепи демонстрируют отрицательный заряд при рН 7,4 (который часто называют "физиологическим рН"). При низких значениях pH эти боковые цепи становятся протонированными и теряют заряд.

Напротив, основные остатки, такие как лизин и аргинин, содержат азотсодержащие группы боковых цепей со значениями pKa приблизительно 10-12. Таким образом, эти боковые цепи демонстрируют положительный заряд при рН 7,4. Эти боковые цепи становятся депротонированными и теряют заряд при высоких значениях рН.

Общий (суммарный) заряд белковой молекулы, таким образом, зависит от количества кислотных и основных остатков, присутствующих в белке (и их степени поверхностного экспонирования), а также от рН окружающей среды. Изменение рН окружающей среды изменяет общий заряд белка. Соответственно, для каждого белка существует заданный рН, при котором количество положительных и отрицательных зарядов одинаково, и белок не имеет общего суммарного заряда. Эта точка известна как изоэлектрическая точка (pI). Изоэлектрическая точка представляет собой стандартное понятие в биохимии белков, с которым будет знаком специалист в данной области.

Изоэлектрическая точка (pI), таким образом, определяется как значение pH, при котором белок демонстрирует нулевой суммарный заряд. Увеличение pI означает, что для того, чтобы белок имел нулевой суммарный заряд, требуется более высокое значение pH. Таким образом, увеличение pI представляет собой увеличение чистого положительного заряда белка при данном pH. И наоборот, уменьшение pI означает, что для того, чтобы белок имел нулевой суммарный заряд, требуется более низкое значение pH. Таким образом, уменьшение pI представляет собой уменьшение суммарного положительного заряда белка при данном pH.

Способы определения pI белка известны в данной области техники и будут знакомы специалисту в данной области. Например, pI белка можно вычислить на основе средних значений pKa каждой аминокислоты, присутствующей в белке ("расчетная pI"). Такие вычисления можно выполнять при использовании компьютерных программ, известных в данной области, таких как Compute pI/MW Tool от ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/), который представляет собой предпочтительный метод вычисления pI в соответствии с настоящим изобретением. Сравнения значений pI различных молекул следует проводить при использовании одной и той же методики/программы вычисления.

При необходимости расчетная pI белка может быть подтверждена экспериментально при использовании метода изоэлектрического фокусирования ("наблюдаемая pI"). В этом методе электрофорез используется для разделения белков в соответствии с их pI. Изоэлектрическое фокусирование обычно проводят при использовании геля с иммобилизованным градиентом рН. При приложении электрического поля, белок мигрирует по градиенту pH до тех пор, пока не достигнет pH, при котором он имеет нулевой суммарный заряд, и эта точка является pI белка. Результаты, полученные с помощью изоэлектрического фокусирования, обычно имеют относительно низкое разрешение по своей природе, и поэтому авторы настоящего изобретения считают, что результаты, полученные с помощью вычисления значения pI (как описано выше), являются более подходящими для примения.

В настоящем описании "pI" означает "расчетную pI", если не указано иное.

pI белка можно повысить или понизить, изменяя количество основных и/или кислотных групп, экспонированных на его поверхности. Этого можно достичь при модификации одной или больше аминокислот белка. Например, повышение pI можно обеспечить при уменьшении количества кислотных остатков или при увеличении количества основных остатков.

Модифицированный BoNT/A или его фрагмент согласно изобретению может иметь значение pI, которое по меньшей мере на 0,2, 0,4, 0,5 или 1 единицу pI выше, чем у немодифицированного BoNT/A (например, SEQ ID NO: 1) или его фрагмента. Предпочтительно модифицированный BoNT/A или его фрагмент может иметь pI по меньшей мере 6,6, т.е. по меньшей мере 6,8.

Свойства 20 стандартных аминокислот указаны в таблице ниже:

Аминокислота Боковая цепь Аспарагиновая кислота Asp D Незаряженная (кислотная) Глутаминовая кислота Glu E Заряженная (кислотная) Аргинин Arg R Заряженная (основная) Лизин Lys K Заряженная (основная) Гистидин His H Незаряженная (полярная) Аспарагин Asn N Незаряженная (полярная) Глутамин Gln Q Незаряженная (полярная) Серин Ser S Незаряженная (полярная) Треонин Thr T Незаряженная (полярная) Тирозин Tyr Y Незаряженная (полярная) Метионин Met M Незаряженная (полярная) Триптофан Trp W Незаряженная (полярная) Цистеин Cys C Незаряженная (полярная) Аланин Ala A Незаряженная (гидрофобная) Глицин Gly G Незаряженная (гидрофобная) Валин Val V Незаряженная (гидрофобная) Лейцин Leu L Незаряженная (гидрофобная) Изолейцин Ile I Незаряженная (гидрофобная) Пролин Pro P Незаряженная (гидрофобная) Фенилаланин Phe F Незаряженная (гидрофобная)

Следующие аминокислоты считаются заряженными аминокислотами: аспарагиновая кислота (отрицательная), глутаминовая кислота (отрицательная), аргинин (положительный) и лизин (положительный).

При pH 7,4 боковые цепи аспарагиновой кислоты (pKa 3,1) и глутаминовой кислоты (pKa 4,1) имеют отрицательный заряд, тогда как боковые цепи аргинина (pKa 12,5) и лизина (pKa 10,8) имеют положительный заряд. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота называются кислотными аминокислотными остатками. Аргинин и лизин называются основными аминокислотными остатками.

Следующие аминокислоты считаются незаряженными, полярными (что означает то, что они могут участвовать в образовании водородных связей) аминокислотами: аспарагин, глутамин, гистидин, серин, треонин, тирозин, цистеин, метионин и триптофан.

Следующие аминокислоты считаются незаряженными, гидрофобными аминокислотами: аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, пролин и глицин.

При вставке аминокислоты дополнительный аминокислотный остаток (которые обычно не присутствует) включается в полипептидную последовательность BoNT/A или ее фрагмент, что увеличивает общее число аминокислотных остатков в указанной последовательности. При делеции аминокислоты аминокислотный остаток удаляется из аминокислотной последовательности клостридиального токсина, что уменьшает общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности.

Предпочтительно модификация является заменой, при которой в модифицированном BoNT/A или его фрагменте предпочтительно сохраняется такое же количество аминокислотных остатков. При аминокислотной замене аминокислотный остаток, который формирует часть полипептидной последовательности BoNT/A или ее фрагмента, заменяется другим аминокислотным остатком. Заменяющий аминокислотный остаток может быть одной из 20 стандартных аминокислот, как описано выше. В альтернативе заменяющая аминокислота при аминокислотной замене может быть нестандартной аминокислотой (аминокислотой, которая не входит в стандартный набор из 20 аминокислот, описанный выше). Например, заменяющая аминокислота может быть основной нестандартной аминокислотой, например, L-орнитином, L-2-амино-3-гуанидинопропионовой кислотой или D-изомерами лизина, аргинина и орнитина. Способы введения нестандартных аминокислот в белки известны в данной области и включают синтез рекомбинантных белков с применением ауксотрофных экспрессионных хозяев E. coli.

В одном варианте осуществления замена выбрана из: замены кислотнго аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком, замены кислотного аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком и замены незаряженного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком. В одном варианте осуществления, где замена является заменой кислотного аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком, кислотный аминокислотный остаток заменяется соответствующим незаряженным амидным аминокислотным остатком (т.е. аспарагиновая кислота заменяется аспарагином, а глутаминовая кислота заменяется глутамином).

Предпочтительно основный аминокислотный остаток является остатком лизина или остатком аргинина. Другими словами, замена является заменой лизином или аргинином. Наиболее предпочтительно модификация является заменой лизином.

Предпочтительно модифицированный BoNT/A или его фрагмент для применения в изобретении включает от 4 до 40 аминокислотных модификаций, расположенных в H_CN домене клостридиального токсина. Указанный модифицированный BoNT/A или его фрагмент предпочтительно также имеет pI по меньшей мере 6,6. Указанный модифицированный BoNT/A предпочтительно включает модификации по меньшей мере 4 аминокислот, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026 и ASN 1052, где указанная модификация включает замену аминокислот остатком лизина или остатком аргинина. Например, указанный модифицированный BoNT/A или его фрагмент могут включать модификации по меньшей мере 5 аминокислот, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052 и GLN 1229, где указанная модификация включает замену аминокислот остатком лизина или остатком аргинина.

Способы модификации белков путем замены, вставки или делеции аминокислотных остатков известны в уровне техники. Например, аминокислотные модификации могут быть введены путем модификации последовательности ДНК, кодирующей полипептид (например, кодирующей немодифицированный BoNT/A или его фрагмент). Это может быть достигнуто с применением стандартных методов молекулярного клонирования, например, с помощью направленного мутагенеза, при котором короткие цепи ДНК (олигонуклеотиды), кодирующие требуемую аминокислоту(ы), используют для замены исходной кодирующей последовательности с использованием фермента полимеразы, или путем вставки/делеции частей гена с помощью различных ферментов (например, лигаз и эндонуклеаз рестрикции). В альтернативе модифицированная последовательность гена может быть химически синтезирована.

Таким образом, модифицированный клостридиальный нейротоксин может иметь одну или больше таких аминокислотных модификаций (например, замен) по сравнению с BoNT/A дикого типа, которые увеличивают изоэлектрическую точку полипептида. Без ограничения какой-либо теорией, считается, что повышенный суммарный положительный заряд способствует электростатическим взаимодействиям между полипептидом и анионными внеклеточными компонентами, что способствует связыванию между полипептидом и клеточной поверхностью, увеличивая, таким образом, удерживание в участке введения и/или длительность действия.

Для модифицированных полипептидов BoNT/A, описанных выше (например, SEQ ID NO: 15), одним из способов определения этих преимущественных свойств (которые представляют собой увеличение терапевтического индекса) является коэффициент безопасности модифицированного BoNT/A. В этом отношении нежелательные эффекты клостридиального нейротоксина (вызванные диффузией токсина из участка введения) можно оценивать экспериментально путем измерения процентной потери массы тела в соответствующей модели на животных (например, на мышах, у которых потерю массы тела обнаруживают в течение семь дней введения). Напротив, требуемые эффекты клостридиального нейротоксина в отношении мишени могут оценивать экспериментально с помощью анализа Digital Abduction Score (DAS), измерения мышечного паралича. Анализ DAS может быть выполнен путем инъекции 20 мкл клостридиального нейротоксина, приготовленного в желатин-фосфатном буфере, в комплекс икроножной/камбаловидной мышц мыши с последующей оценкой показателя отведения пальцев с использованием метода Аоки (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001). В анализе DAS мышей ненадолго подвешивают за хвост, чтобы вызвать характерную реакцию испуга, при которой мышь вытягивает конечности и разводит пальцы. После инъекции клостридиального нейротоксина различные степени отведения пальцев оценивают по пятибалльной шкале (от 0=норма до 4=максимальное уменьшение отведения пальцев и разгибания лап).

Коэффициент безопасности клостридиального нейротоксина может быть затем выражен как отношение количества токсина, необходимого для снижения массы тела на 10% (измеряемого при пиковом эффекте в течение первых семи дней после введения дозы у мыши), и количества токсина, требуемого для оценки DAS, равной 2. Таким образом, желательны высокие оценки коэффициента безопасности, которые указывают, что токсин способен эффективно парализовать целевую мышцу с небольшими нежелательными побочными эффектами. Модифицированный BoNT/A согласно настоящему изобретению может иметь коэффициент безопасности, который выше, чем коэффициент безопасности эквивалентного немодифицированного (нативного) ботулинического токсина (например, SEQ ID NO: 1).

Таким образом, в одном варианте модифицированный BoNT/A согласно настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности, равный по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50), где коэффициент безопасности вычисляют как: доза токсина, требуемая для изменения массы тела на -10% (пг/мышь), деленная на DAS ED₅₀ (пг/мышь) [ED₅₀=доза, требуемая для получения оценки DAS, равной 2].

В одном варианте модифицированный BoNT/A согласно настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности по меньшей мере 10. В одном варианте модифицированный BoNT/A или его фрагмент согласно настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности по меньшей мере 15.

Клостридиальные нейротоксины, включающие по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 15, описаны в WO 2015/004461 A1, которая полностью включена в настоящий документ посредством отсылки.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин, включающий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 15, и/или включающий полипептидную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14, включает замену в одном или более (предпочтительно двух или более, трех или более, четырех или более, пяти или более или шести или более, более предпочтительно во всех) положениях 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229 и 886. Нумерация положений соответствует положениям SEQ ID NO: 1 и может быть определена при выравнивании полипептидной последовательности с SEQ ID NO: 1 (немодифицированный/BoNT/A дикого типа). Поскольку присутствие остатка метионина в положении 1 в SEQ ID NO: 1 является необязательным, специалист в данной области будет принимать во внимание присутствие/отсутствие остатка метионина при определении нумерации аминокислотных остатков. Например, когда SEQ ID NO: 1 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, положение 886 будет соответствовать ASN 886 SEQ ID NO: 1). В альтернативе, когда метионин в SEQ ID NO: 62 отсутствует, нумерация аминокислотных остатков должна быть изменена на -1 (например, положение 886 будет соответствовать ASN 885 SEQ ID NO: 1). Аналогичные соображения применимы, когда метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, описанных в данном документе, присутствует/отсутствует, при этом специалист в данной области легко определит правильную нумерацию аминокислотных остатков, используя методы, стандартные в данной области.

Предпочтительно клостридиальный нейротоксин, включающий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 15, и/или включающий полипептидную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14, включает лизин или аргинин (более предпочтительно лизин) в одном или более положениях 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229 и 886. В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин включает лизин или аргинин (более предпочтительно лизин) по меньшей мере в двух, трех, четырех, пяти, шести или всех положениях 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229 и 886. Наиболее предпочтительно клостридиальный нейротоксин включает лизин или аргинин (более предпочтительно лизин) во всех положениях 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229 и 886.

Как описано выше, клостридиальные нейротоксины обычно включают направляющий компонент (например, С-концевой направляющий компонент, H_C домен), опосредующий связывание рецептора с клетками-мишенями, причем клостридиальные нейротоксины также могут обладать аффинностью связывания с некоторыми ганглиозидами, которые присутствуют на клетках-мишенях. Например, BoNT/A, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и TeNT связываются с белком синаптических везикул 2 (SV2), при этом BoNT/A способен связываться со всеми тремя его изоформами (SV2A, SV2B и SV2C), а BoNT/E способен связываться с изоформами SV2A и SV2B. BoNT/B и BoNT/G связываются с обеими изоформами (I и II) синаптотагмина. Синаптотагмин и SV2 могут локализоваться на синаптических везикулах и выходят во внеклеточное пространство, когда везикулы сливаются с пресинаптической мембраной. Именно в этот период клостридиальные нейротоксины связываются со своими белковыми рецепторами. Дополнительную информацию в отношении подходящих рецепторов/ганглиозидов см. в публикации Binz and Rummel (Journal of Neurochemistry, Volume 109, Issue 6, June 2009, стр. 1584-1595), включенной в настоящий документ посредством отсылки.

Клостридиальный нейротоксин согласно изобретению может быть указан на основе целевого рецептора/ганглиозида, с которым он связывается. Например, клостридиальный нейротоксин согласно изобретению может связываться с рецептором, выбранным из SV2 (SV2A, SV2B и/или SV2C) и синаптотагмина (синаптотагмина I и/или II).

В предпочтительном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин связывает SV2. В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин связывает SV2A, SV2B и/или SV2C. Предпочтительно клостридиальный нейротоксин может связывать SV2A. В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин связывает SV2A, SV2B и SV2C. Клостридиальный нейротоксин может включать домен BoNT HCC, выбранный из домена BoNT/A HCC (например, аминокислоты 1095-1296 SEQ ID NO.: 1), домен BoNT/D HCC (например, аминокислоты 1083-1276 SEQ ID NO.: 4), домен BoNT/E HCC (например, аминокислоты 1070-1252 SEQ ID NO.: 5) и домен BoNT/F HCC (например, аминокислоты 1088-1278 SEQ ID NO.: 6 и/или аминокислоты 1077-1268 SEQ ID NO.: 9).

В предпочтительном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин включает H_CC домен BoNT/A (например, аминокислоты 1095-1296 SEQ ID NO.: 1).

В некоторых вариантах осуществления клостридиальный нейротоксин связывает Syt-I и/или Syt-II. Клостридиальный нейротоксин может включать H_CC домен BoNT/B (например, аминокислоты 1082-1291 SEQ ID NO.: 2). В некоторых вариантах осуществления SV2A и/или SV2B (предпочтительно SV2A и SV2B). Клостридиальный нейротоксин может включать H_CC домен BoNT/E (например, аминокислоты 1070-1252 SEQ ID NO.: 5).

Клостридиальный нейротоксин согласно настоящему изобретению может быть получен с применением рекомбинантных технологий. Таким образом, в одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин согласно изобретению представляет собой рекомбинантный клостридиальный нейротоксин.

В одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин ассоциирован с белками, образующими комплекс c BoNT, также известными как нетоксичные нейротоксин-ассоциированные белки (NAP). Другими словами, клостридиальный нейротоксин вводят пациенту-человеку в ассоциации или в комбинации с белками, образующими комплекс c BoNT. Следовательно, в одном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин образует комплекс с одним или больше белками, образующими комплекс c BoNT.

В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин не содержит образующих комплекс c BoNT белков (или не находится в ассоциации или в комбинации с ними). Другими словами, клостридиальный нейротоксин вводят пациенту-человеку не в ассоциации или не в комбинации с образующими комплекс c BoNT белками.

Предпочтительно клостридиальный нейротоксин (например, для применения, как описано в настоящем документе) входит в состав фармацевтической композиции вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем. Под "фармацевтически приемлемым носителем" в настоящем документе подразумевается любой компонент, который совместим с другими ингредиентами фармацевтической композиции, в частности с клостридиальным нейротоксином, и который не оказывает вредного воздействия на пациента-человека. Фармацевтически приемлемый носитель может быть выбран в зависимости от требуемого пути введения, в соответствии со стандартной фармацевтической практикой, и включает, без ограничения, вспомогательные вещества, разбавители, адъюванты, пропелленты и соли.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для применения при лечении кожного заболевания у пациента-человека, где указанная композиция вклюает клостридиальный нейротоксин согласно изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, причем доза клостридиального нейротоксина для введения пациенту является такой, как описано выше. Также охвачены соответствующие применения и способы лечения кожного заболевания, включающие введение фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту-человеку.

Клостридиальный нейротоксин согласно настоящему изобретению предпочтительно может быть включен в состав для внутрикожного введения.

Предпочтительным путем введения является внутрикожное введение. Предпочтительно внутрикожное введение подразумевает внутрикожную инъекцию.

Предпочтительно указанный BoNT/A для лечения того же кожного заболевания представляет собой очищенный BoNT/A. При использовании в настоящем документе термин "очищенный BoNT/A" означает ботулинический нейротоксин типа A, очищенный из клостридиального штамма, который продуцирует его в природе (природный штамм клостридий). Очищенный BoNT/A может быть ассоциирован с комплексообразующими белками или может не содержать комплексообразующих белков. Примеры коммерчески доступных очищенных BoNT/A включают Ботокс®, Диспорт® и Ксеомин®.

Дозы клостридиального нейротоксина в настоящем документе предпочтительно измеряются в нанограммах.

Под дозами клостридиального нейротоксина согласно изобретению следует понимать дозы активного двухцепочечного клостридиального нейротоксина, т.е. без учета количества комплексообразующих белков, с которыми нейротоксин может быть ассоциирован. Другими словами, это относится к дозам активного двухцепочечного клостридиального нейротоксина независимо от того, вводят ли указанный нейротоксин пациенту в ассоциации с комплексообразующими белками или без них. Как хорошо известно специалистам, активный двухцепочечный клостридиальный нейротоксин способен связываться с мембранным рецептором (например, на клеточной мембране), транслоцировать легкую цепь в цитоплазму и расщеплять белок SNARE, тогда как комплексообразующие белки не проявляют такой биологической активности (т.е. не являются "активными").

В альтернативе дозы клостридиального нейротоксина можно измерять в "единицах" (Ед) клостридиального нейротоксина.

Фактически, как хорошо известно специалистам в данной области, эффективность клостридиального нейротоксина зависит от количества (например, нанограммов) нейротоксина, требуемого для достижения единицы LD50 (летальной дозы 50); одна единица LD50 определяется как медианная летальная внутрибрюшинная доза (измеренная на мышах). Однако фармацевтические препараты ботулотоксина, представленные в настоящее время на рынке, содержат различное количество нейротоксина с молекулярной массой 150 кДа, и также в единицах LD50. Кроме того, в этих препаратах нейротоксин может быть ассоциирован или не ассоциирован (т.е. может находиться в комбинации с) с нетоксичными нейротоксин-ассоциированными белками (NAP), также известными как комплексообразующие белки. Для простоты пересчета единиц (как сообщается в Field et al., "AbobotulinumtoxinA (Dysport®), OnabotulinumtoxinA (Botox®) and IncobotulinumtoxinA (Xeomin®) Neurotoxin Content and Potential Impacts for Duration of Response in Patients". Toxins 2018, 10(12), 535):

- 100 Единиц Ботокса® (также известного как OnabotulinumtoxinA) содержат приблизительно 0,9 нг 150 кДа BoNT/A, а также комплексообразующие белки;

- 500 Единиц Диспорта® (также известного как AbobotulinumtoxinA) содержат приблизительно 2,69 нг 150 кДа BoNT/A, а также комплексообразующие белки;

- 100 Единиц Ксеомина® (также известного как IncobotulinumtoxinA) содержат приблизительно 0,40 нг 150 кДа BoNT/A без комплексообразующих белков.

Необходимо отметить, что значения при пересчете единиц могут немного изменяться. Например, значения для пересчета, приведенные в Frevert, 2012 ("Content of botulinum neurotoxin in Botox ®/Vistabel®, Dysport®/Azzalure®, and Xeomin®/Bocouture®"; Drugs R D. 2010; 10 (2):67-73), являются следующими:

- 100 единиц Ботокса® (также известного как OnabotulinumtoxinA) содержат приблизительно 0,73 нг 150 кДа BoNT/A, а также комплексообразующие белки;

- 100 единиц Диспорта® (также известного как AbobotulinumtoxinA) содержат приблизительно 0,65 нг 150 кДа BoNT/A, а также комплексообразующие белки;

- 100 единиц Ксеомина® (также известного как IncobotulinumtoxinA) содержат приблизительно 0,44 нг 150 кДа BoNT/A без комплексообразующих белков;

- 100 единиц Нейроблок/Миоблок® (также известного как RimabotulinumtoxinB) содержат от приблизительно 0,2 нг до приблизительно 1 нг 150 кДа BoNT/B, а также комплексообразующие белки.

Количество клостридиального нейротоксина может быть измерено квалифицированным специалистом в соответствии с методами, обычно используемыми в данной области для количественного определения белков, предпочтительно на уровне нанограммов, включающих, помимо прочего, масс-спектроскопию, такую как масс-спектроскопия с изотопным разбавлением (Muñoz et al., Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotope dilution mass spectrometry, Anal. Biochem. 2011, 408, 124-131) или флуориметрический анализ (Poras et al., Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type A by a Novel Rapid In Vitro Fluorimetric Assay, Appl Environ Microbiol., 2009 Jul, 75(13): 4382-4390).

Таким образом, диапазоны доз для введения клостридиальных нейротоксинов согласно настоящему изобретению являются такими, которые позволяют получать требуемый терапевтический и/или профилактический эффект. Следует иметь в виду, что требуемый диапазон доз зависит от точной природы клостридиального нейротоксина или композиции, пути введения, свойств состава, возраста субъекта, природы, степени или тяжести состояния субъекта, противопоказаний, если таковые имеются, а также от заключения лечащего врача. Вариации этих уровней дозы можно корректировать с применением стандартных эмпирических методов для оптимизации.

В одном варианте осуществления доза клостридиального нейротоксина является фиксированной дозой. Фиксированная доза может находиться в диапазоне от 50 мкг до 250 мкг, предпочтительно от 100 мкг до 100 мкг. В одном варианте осуществления фиксированная доза может составлять по меньшей мере 50 мкг, 100 мкг, 500 мкг, 1 нг, 50 нг, 100 нг, 500 нг, 1 мкг или 50 мкг. Указанная доза может быть однократной фиксированной дозой.

Жидкие лекарственные формы обычно изготавливают с применением клостридиального нейротоксина и апирогенной стерильной несущей среды. Клостридиальный нейротоксин, в зависимости от используемой несущей среды и концентрации, может быть либо растворен, либо суспендирован в несущей среде. В случае приготовления растворов клостридиальный нейротоксин можно растворять в растворителе, при необходимости сделать раствор изотоническим путем добавления хлорида натрия и стерилизовать фильтрованием через стерильный фильтр с использованием асептических методик с последующим наполнением подходящих стерильных флаконов или ампул и укупориванием. В альтернативном варианте, если стабильность раствора достаточна, раствор в герметичных контейнерах можно стерилизовать автоклавированием. Преимущественно в растворителе могут быть растворены такие добавки, как буферные, солюбилизирующие, стабилизирующие, консервирующие или бактерицидные, суспендирующие или эмульгирующие вещества и/или местные анестетики.

Сухие порошки, которые перед применением растворяют или суспендируют в подходящей несущей среде, можно изготавливать путем заполнения предварительно стерилизованных ингредиентов в стерильный контейнер с использованием асептической технологии в стерильной зоне. В альтернативном варианте ингредиенты могут быть растворены в подходящих контейнерах с использованием асептической технологии в стерильной зоне. Затем продукт лиофилизируют, а контейнеры асептически укупоривают.

Суспензии для парентерального применения, подходящие для способа введения, описанного в настоящем документе, изготавливают по существу так же, за исключением того, что стерильные компоненты суспендируют в стерильной несущей среде, а не растворяют, при этом стерилизацию нельзя выполнить с помощью фильтрации. Компоненты могут быть выделены в стерильном состоянии или, в альтернативе, их могут стерилизовать после выделения, т.е. при обработке гамма-излучением.

Предпочтительно в композицию(и) включают суспендирующее вещество, например поливинилпирролидон, для облегчения равномерного распределения компонентов.

При введении в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться различные технологии доставки, включая инкапсулирование в микрочастицах или распыление аэрозоля под высоким давлением.

Внутрикожное введение может включать внутрикожную инъекцию при использовании такой иглы, как игла калибра 30G, предпочтительно, где иглу (такую как иглу 30G) вводят в дерму кожи под углом приблизительно 5-15° по отношению к поверхности (например, плоской поверхности) кожи. Предпочтительно глубина инъекции (глубина относительно поверхности кожи) составляет около 0,2-0,3 (предпочтительно около 0,25) дюйма (0,5-0,8 см). Термин "плоская поверхность" может относиться к области контакта с кожей.

Если в настоящем документе указан диапазон значений, следует понимать, что, если из контекста прямо не следует иное, также конкретно раскрыто каждое промежуточное значение с точностью до десятых долей между верхней и нижней границами указанного диапазона. Каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в рамки данного описания. Кроме того, следует понимать, что любой диапазон числовых значений, обозначенный в настоящем документе выражением "от а до b", означает диапазон числовых значений, идущий от а до b (т.е. включая строгие конечные значения а и b).

Кроме того, под термином "приблизительно" в настоящем документе следует понимать плюс или минус (±) 5%, предпочтительно ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±0,5%, ±0,1%, от числового значения, с которым его используют.

В предпочтительном варианте осуществления доза клостридиального нейротоксина согласно изобретению, вводимая для лечения кожного заболевания у пациента-человека (т.е. терапевтическая или косметическая доза), составляет от приблизительно 0,00025 нг до приблизительно 3 нг.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтическая (или косметическая) доза клостридиального нейротоксина составляет от приблизительно 0,0003 нг до приблизительно 2 нг, предпочтительно от приблизительно 0,0004 нг до приблизительно 1,5 нг, от приблизительно 0,0005 нг до приблизительно 1 нг, еще предпочтительнее от приблизительно 0,0006 нг до приблизительно 0,5 нг указанного клостридиального нейротоксина.

Например, доза клостридиального нейротоксина, включающего BoNT/A, предпочтительно составляет от приблизительно 0,001 нг до приблизительно 2 нг.

Тем не менее следует понимать, что требуемый диапазон доз зависит от точной природы клостридиального нейротоксина, максимально переносимой дозы у конкретного пациента/субъекта (например, пациента/субъекта-человека), состояния кожи, пути введения, природы состава, возраста пациента, природы, степени или тяжести состояния пациента, противопоказаний, если таковые имеются, а также от заключения лечащего врача. Вариации таких уровней дозы можно корректировать при использовании стандартных эмпирических методов оптимизации.

В тех случаях, когда референсный стандарт указан в настоящем документе с целью сравнения уровня кожного сала (после введения) по сравнению с референсным стандартом, референсный стандарт может соответствовать уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента, которому не вводили клостридиальный нейротоксин. В качестве дополнения или альтернативы, референсный стандарт может соответствовать уровню кожного сала на коже (например, в эпидермальном слое) пациента (например, пациента, которому вводили клостридиальный нейротоксин) перед введением клостридиального нейротоксина.

Предполагается, что варианты осуществления, относящиеся к различным терапевтическим применениям изобретения, должны в равной степени применяться к способам лечения, клостридиальным нейротоксинам согласно изобретению, и наоборот.

ПУНКТЫ

1. Способ лечения кожного заболевания, включающий внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина, где после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

2. Клостридиальный нейротоксин для применения в способе лечения кожного заболевания, включающем внутрикожное введение пациенту клостридиального нейротоксина, где после введения клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

3. Нетерапевтическое применение клостридиального нейротоксина для косметической обработки кожи, где клостридиальный нейротоксин вызывает:

- секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи.

4. Нетерапевтическое применение согласно пункту 3, где клостридиальный нейротоксин вводят путем внутрикожного введения.

5. Способ согласно пункту 1 или клостридиальный нейротоксин для применения согласно пункту 2, где кожное заболевание является состоянием, связанным с аберрантным уровнем сальных липидов, где сальный липид присутствует в эпидермальном слое на более низком уровне, чем в эпидермальном слое пациента, который не имеет кожного заболевания.

6. Способ согласно пункту 1 или пункту 5, или клостридиальный нейротоксин для применения согласно пункту 2 или пункту 5, где кожное заболевание является одним или больше из состояний, выбранных из акне, атопического дерматита, синдрома Нетертона, псориаза, обезвоженной кожи (например, сухой или потрескавшейся кожи), актинического кератоза, розовых угрей, карбункула, экземы, целлюлита, дерматита, рака кожи и фолликулярного кератоза.

7. Способ согласно любому из пунктов 1, 5 или 6, или клостридиальный нейротоксин для применения согласно любому из пунктов 2, 5 или 6, где кожное заболевание является одним или больше состояниями, выбранными из псориаза, экземы и дерматита.

8. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где после введения клостридиального нейротоксина:

- не происходит повышения уровня сала на коже пациента по сравнению с референсным стандартом; и предпочтительно не происходит снижения уровня сала на коже пациента по сравнению с референсным стандартом;

- где референсный стандарт соответствует уровню сала на коже субъекта, которому не вводили клостридиальный нейротоксин.

9. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где пациент не имеют жирной кожи до и/или после введения клостридиального нейротоксина.

10. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где указанным клостридиальным нейротоксином является нейротоксин BoNT/A.

11. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где указанный клостридиальный нейротоксин является химерным нейротоксином.

12. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно пункту 11, где химерный нейротоксин выбран из группы, состоящей из BoNT/DC и BoNT/X.

13. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно пункту 11, где химерный нейротоксин включает домен LH_N из первого нейротоксина, ковалентно связанный с доменом H_C из второго нейротоксина, предпочтительно:

где указанный первый и второй нейротоксины являются разными,

где C-концевой аминокислотный остаток указанного домена LH_N соответствует первому аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном первом нейротоксине, и

где N-концевой аминокислотный остаток указанного домена H_C соответствует второму аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном втором нейротоксине.

14. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно пункту 13, где указанным первым нейротоксином является BoNT/A, и где указанным вторым нейротоксином является BoNT/B.

15. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где внутрикожное введение включает введение дозы клостридиального нейротоксина в пределах от приблизительно 0,00025 нг до 3 нг в участок введения.

16. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где внутрикожное введение включает внутрикожную инъекцию иглой калибра 30G, предпочтительно, где иглу калибра 30G вводят в дерму кожи под углом приблизительно 5-15° относительно плоской поверхности кожи.

17. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где эпидермальный слой представляет собой один или больше, выбранных из базального слоя, шиповатого слоя, зернистого слоя или рогового слоя.

18. Способ, клостридиальный нейротоксин для применения или нетерапевтического применения согласно любому из предыдущих пунктов, где эпидермальный слой представляет собой роговой слой.

ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Для определения процента идентичности может использоваться любой из множества методов выравнивания последовательностей, в том числе, без ограничения, глобальные методы, локальные методы и гибридные методы, такие как, например, методы сегментного подхода. Методики определения процента идентичности представляют собой стандартные процедуры, доступные специалисту в данной области. В глобальных методах выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание путем суммирования оценок отдельных пар остатков и наложения штрафов за пропуски. Неограничивающие методы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). В локальных методах выравнивают последовательности, идентифицируя один или больше консервативных мотивов, присутствующих во всех введенных последовательностях. Неограничивающие методы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Fey™ans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); выборку Гиббса, см., например, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004).

Таким образом, процент идентичности последовательности определяют стандартными методами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986, и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Вкратце, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации показателей выравнивания с использованием штрафа за введение пропуска, равного 10, штрафа за продолжение пропуска, равного 1, и матрицы замен "blosum 62" (Henikoff and Henikoff, там же), как показано ниже (аминокислоты обозначены стандартными однобуквенными кодами).

"Процент идентичности последовательностей" между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией количества идентичных положений, совпавших в последовательностях. Таким образом, % идентичности можно вычислить как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, умноженное на 100. При вычислении % идентичности последовательности также можно учитывать количество пропусков и длину каждого пропуска, который необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями можно проводить при использовании конкретных математических алгоритмов, таких как BLAST, которые знакомы специалисту в данной области.

Затем процент идентичности вычисляется как:

Общее количество совпавших идентичных положений ×100

[длина более протяженной последовательности плюс

количество пропусков, введенных в более протяженную

последовательность для выравнивания двух последовательностей]

По существу гомологичные полипептиды характеризуются присутствием одной или больше аминокислотных замен, делеций или добавлений. Эти изменения предпочтительно носят незначительный характер, то есть это - консервативные аминокислотные замены (см. ниже) и другие замены, которые не оказывают существенного влияния на фолдинг или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до приблизительно 30 аминокислот; и небольшие удлинения на N- или C-концах, такие как N-концевой остаток метионина, малый линкерный пептид, состоящий приблизительно из 20-25 остатков, или аффинная метка.

КОНСЕРВАТИВНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ

Основные: аргинин, лизин, гистидин

Кислотные: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота

Полярные: глутамин, аспарагин

Гидрофобные: лейцин, изолейцин, валин

Ароматические: фенилаланин, триптофан, тирозин

Малого размера: глицин, аланин, серин, треонин, метионин

В дополнение к 20 стандартным аминокислотам аминокислотные остатки полипептидов согласно настоящему изобретению могут быть заменены нестандартными аминокислотами (такими как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин). Аминокислотные остатки полипептида могут быть заменены ограниченным количеством неконсервативных аминокислот, аминокислот, не кодируемых генетическим кодом, и неприродных аминокислот. Полипептиды согласно настоящему изобретению также могут включать неприродные аминокислотные остатки.

Неприродные аминокислоты включают, без ограничения, транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В уровне техники известны несколько способов включения неприродных аминокислотных остатков в белки. Например, может использоваться система in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляют с помощью химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в уровне техники. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе, включающей экстракт E. coli S30 и доступные в продаже ферменты и другие реагенты. Белки очищают с помощью хроматографии. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993. Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus путем микроинъекции мутантной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В третьем методе клетки E. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, которая подлежит замене (например, фенилаланина), и в присутствии требуемой неприродной аминокислоты (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Неприродная аминокислота включается в полипептид вместо ее природного аналога. См. Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Природные аминокислотные остатки могут быть превращены в неприродные остатки путем химической модификации in vitro. Химическую модификацию можно объединить с сайт-направленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

Аминокислотные остатки полипептидов согласно настоящему изобретению могут быть заменены ограниченным количеством неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, неприродных аминокислот и нестандартных аминокислот.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах согласно настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Участки биологического взаимодействия также можно определить с помощью физического анализа структуры, как определяют с помощью таких методов, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот в предполагаемой области контакта. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть установлена в анализе гомологии с родственными компонентами (например, транслокационными или протеазными компонентами) полипептидов согласно настоящему изобретению.

Множественные аминокислотные замены могут быть сделаны и протестированы с использованием известных методов мутагенеза и скрининга, таких как описанные в публикациях Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Вкратце, эти авторы раскрывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора функционального полипептида, и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие методы, которые могут использоваться, включают фаговый дисплей (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США 5,223,409; Huse, публикация ВОИС WO 92/06204) и мутагенез, направленный на конкретную область (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно известно среднему специалисту в области, к которой относится данное изобретение. В Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) специалисту предоставлен общий словарь множества терминов, используемых в данном описании.

Данное изобретение не ограничивается иллюстративными способами и материалами, раскрытыми в настоящем документе, и любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут использоваться на практике или при тестировании вариантов осуществления данного изобретения. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записаны слева направо в направлении от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от N-конца к C-концу соответственно.

Представленные в настоящем документе заголовки не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения.

Аминокислоты указаны в настоящем документе при использовании названия аминокислоты, трехбуквенного или однобуквенного кода. При использовании в настоящем документе термин "белок" включает белки, полипептиды и пептиды. При использовании в настоящем документе термин "аминокислотная последовательность" является синонимом термина "полипептид" и/или термина "белок". В некоторых случаях термин "аминокислотная последовательность" является синонимом термина "пептид". В некоторых случаях термин "аминокислотная последовательность" является синонимом термина "фермент". Термины "белок" и "полипептид" используются в настоящем документе попеременно. В настоящем описании и формуле изобретения могут использоваться обычные однобуквенные и трехбуквенные коды аминокислотных остатков. Трехбуквенный код аминокислот, определенный в соответствии с Объединенной комиссией ИЮПАК-ИЮБ по биохимической номенклатуре (JCBN). Также следует понимать, что полипептид может кодироваться больше чем одной нуклеотидной последовательностью вследствие вырожденности генетического кода.

Следует отметить, что используемые в настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа "a", "an" и "the" включают множественные ссылки, если из контекста прямо не следует иное. Так, например, ссылка на "(a) клостридиальный нейротоксин" включает множество таких клостридиальных нейротоксинов, а ссылка на "(the) клостридиальный нейротоксин" включает ссылку на один или больше клостридиальных нейротоксинов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее.

Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, предоставлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно считаться допущением того, что такие публикации составляют предшествующий уровень техники для прилагаемой формулы изобретения.

Далее изобретение будет описано, исключительно в качестве примера, со ссылкой на следующие Фигуры и Примеры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее будут описаны варианты осуществления изобретения, исключительно в качестве примера, со ссылкой на следующие Фигуры и Примеры.

На всех Фигурах, Gp1=Группа 1; Gp2=Группа 2; Gp3=Группа 3; Gp4=Группа 4; Gp5=Группа 5; Диспорт=BoNT/A; Ед=Единица; время удерживания=время удерживания в газовой хроматографии.

На Фигуре 1 показано: (a) изображение мыши Rhino, которой ввели BoNT/A (Диспорт) путем внутрикожной инъекции в спину (точки инъекции представляют собой четыре затемненных пятна в середине спины, которые, как видно, образуют четыре угла квадрата). Уровни кожного сала, измеренные затем на коже спины мыши Rhino после инъекции (или нанесения контрольного вещества адапалена), показаны на (В). Диспорт=BoNT/A

На Фигуре 2 показаны уровни репрезентативной жирной кислоты в кожном сале, собранном с кожи спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. Время удерживания для этой жирной кислоты составляло 22,1 минуты (эта жирная кислота соответствует пику, обозначенному "FA4" на Фигуре 17B). Данные представляют собой среднее значение для шести образцов вместе со стандартным отклонением.

На Фигуре 3 показаны уровни сквалена в кожном сале, собранном с кожи спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. Время удерживания для сквалена составляло 25 минут (сквален соответствует пику, обозначенному "ST1" на Фигуре 17B). Данные представляют собой среднее значение для шести образцов вместе со стандартным отклонением.

На Фигуре 4 показаны уровни холестерина в кожном сале, собранном с кожи спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. Время удерживания для холестерина составляло 24,4 минуты (холестерин соответствует пику, обозначенному "Chol" на Фигуре 17B). Данные представляют собой среднее значение для шести образцов вместе со стандартным отклонением.

На Фигуре 5 (a)-(c) показаны уровни трех разных сложных восковых эфиров в кожном сале, собранном с кожи спины у мышей Rhino в различных группах, через 15 дней после инъекции. Время удерживания для "сложного воскового эфира 2", показанного на Фигуре 5A, составляло 31 мин; время удерживания для "сложного воскового эфира 3", показанного на Фигуре 5B, составило 35,5 мин; время удерживания "сложного воскового эфира 4", показанного на Фигуре 5C, составило 38 минут. Сложные восковые эфиры 2-3 соответствуют пику, обозначенному WX2-3 (соответственно) на Фигуре 17C. Данные представляют собой среднее значение шести образцов вместе со стандартным отклонением.

На Фигуре 6 показывает уровни сложного холестерилового эфира в кожном сале, собранном с кожи спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. Время удерживания для этого сложного холестерилового эфира составило 41 минуту (этот сложный холестериловый эфир соответствует пику, обозначенному "CE" на Фигуре 17D). Данные представляют собой значение шести образцов вместе со стандартным отклонением.

На Фигуре 7 показывает уровни вещества P (пг/г ткани) в образцах кожи спины, собранных со спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. ***p<0,001 в сравнении с растворителем (Gp1), односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 8 показано развитие на коже спины (a) эритемы и (b) отшелушивания у мышей Rhino в различных группах. Оценку выполняли в дни 1, 5, 10 и 15.

На Фигуре 9 показан размер поверхности сальных желез на коже спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. ***p<0,001 в сравнении с растворителем (Gp1), односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 10 показан размер поверхности утрикул на коже спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. ***p<0,001 в сравнении с растворителем (Gp1), Односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 11 показана назад толщина эпидермиса кожи на спине у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. *p<0,05, ***p<0,001 в сравнении с растворителем (Gp1), Односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 12 показаны уровни воспаления дермы на спине у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. *p<0,05, **p<0,01 в сравнении с растворителем (Gp1), Односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 13 показаны уровни пролиферации кератиноцитов в эпидермисе спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. **p<0,01 в сравнении с растворителем (Gp1), Односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 14 показаны уровни пролиферации фибробластов в дерме спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. *p<0,05 в сравнении с растворителем (Gp1), Односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 15 показаны уровни пролиферации себоцитов в дерме спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции.

На Фигуре 16 показаны уровни IL-1 альфа (нг/г ткани) в образцах кожи со спины у мышей Rhino в разных группах, через 15 дней после инъекции. ***p<0,001 в сравнении с растворителем (Gp1), Односторонний дисперсный анализ, сопровождаемый апостериорным критерием Даннетта.

На Фигуре 17 показаны примеры хроматограмм, полученных в ходе липидомного анализа, описанного в настоящем документе, для каждой из групп 1-5. Расширенные изображения этой хроматограммы показаны на Фигуре 17B-D. A=полная средняя хроматограмма, полученная в каждой группе для образцов кожного сала (например, образца экстракта липидов кожного сала, включающего сальные липиды); B=расширенное изображение, на котором показаны пики, соответствующие жирной кислоте (пик под обозначением FA4), сквалену (пик под обозначением ST1) и холестерину (пик под обозначением Chol), полученные в каждой группе с образцами кожного сала; C=расширенное изображение, на котором показаны пики, соответствующие воскам/сложным восковым эфирам (пики под обозначениями WX1, WX2, WX3 и WX4), полученные в каждой группе с образцами кожного сала; D=расширенное изображение, на котором показаны пики, соответствующие сложным холестериловым эфирам (пик под обозначением CE), полученные в каждой группе с образцами кожного сала.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В случаях, когда начальный аминокислотный остаток Met или соответствующий начальный кодон указаны в любой из следующих SEQ ID NO, указанный остаток/кодон является необязательным.

SEQ ID NO: 1 - BoNT/A1, номер доступа A5HZZ9, аминокислотная последовательность

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKY™FHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 2 - BoNT/B1, номер доступа B1INP5, аминокислотная последовательность

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQ™IKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSN™DKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

SEQ ID NO: 3 - BoNT/C1, номер доступа P18640, аминокислотная последовательность

MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNE™YADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE

SEQ ID NO: 4 - BoNT/D, номер доступа P19321, аминокислотная последовательность

MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFEN™PFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFREN™LLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE

SEQ ID NO: 5 - BoNT/E1, номер доступа WP_003372387, аминокислотная последовательность

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNC™NFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

SEQ ID NO: 6 - BoNT/F1, номер доступа Q57236, аминокислотная последовательность

MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNC™NFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

SEQ ID NO: 7 - BoNT/G, номер доступа WP̲039635782, аминокислотная последовательность

MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLK™IKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGA™NVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE

SEQ ID NO: 8 - BoNT/DC, номер доступа BAM65681, аминокислотная последовательность

MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGSDVEIIPQIERLQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWSSNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSKHYLPVFANILDDNIYTIINGFNLTTKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTRNSRDDSTCIQVKNNTLPYVADKDSISQEIFESQIITDETNVENYSDNFSLDESILDAKVPTNPEAVDPLLPNVNMEPLNVPGEEEVFYDDITKDVDYLNSYYYLEAQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNIGNSALRGNFKQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHISYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLKTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTIPFNIFSYTNNSLLKDMINEYFNSINDSKILSLQNKKNTLMDTSGYNAEVRVEGNVQLNPIFPFDFKLGSSGDDRGKVIVTQNENIVYNAMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNENSEQDINFSYDISKNAAGYNKWFFVTITTNMMGNMMIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFQMNKIPNTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDDKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYDKEYYMINVNYMNRYMSKKGNGIVFNTRKNNNDFNEGYKIIIKRIIGNTNDTRVRGENVLYFNTTIDNKQYSLGMYKPSRNLGTDLVPLGALDQPMDEIRKYGSFIIQPCNTFDYYASQLFLSSNATTNRIGILSIGSYSFKLGDDYWFNHEYLIPVIKIEHYASLLESTSTHWVFVPASE

SEQ ID NO: 9 - BoNT/F7, аминокислотная последовательность

MPVNINNFNYNDPINNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSEYTNDKILISYFNRFYKRIIDSSILNMKYENNRFIDSSGYGSNISINGDIYIYSTNRNQFGIYSSRLSEVNITQNNTIIYNSRYQNFSVSFWVRIPKYNNLKNLNNEYTIINCMRNNNSGWKISLNYNNIIWTLQDTTGNNQKLVFNYTQMIDISDYINKWTFVTITNNRLGHSKLYINGNLTDQKSILNLGNIHVDDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKIFNMELDKTEIETLYHSEPDSTILKDFWGNYLLYNKKYYLLNLLKPNMSVTKNSDILNINRQRGIYSKTNIFSNARLYTGVEVIIRKVGSTDTSNTDNFVRKNDTVYINVVDGNSEYQLYADVSTSAVEKTIKLRRISNSNYNSNQMIIMDSIGDNC™NFKTNNGNDIGLLGFHLNNLVASSWYYKNIRNNTRNNGCFWSFISKEHGWQE

SEQ ID NO: 10 - mrBoNT/AB (BoNT/AB_MY), аминокислотная последовательность

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERD 49

TFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIY 99

STDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEEL 149

NLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEES 199

LEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNA 249

YYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNK 299

AKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIY 349

TEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAA 399

NFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKA 449

LNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLI 499

QQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYT 549

MFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATE 599

AAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYK 649

DDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNAL 699

SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINY 749

QYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNS 799

MIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDI 849

PFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVE 899

VYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPK 949

YKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVF 999

FEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIA 1049

NGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKD 1099

FWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINY 1149

RDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYF 1199

KKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIG 1249

LIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKD 1299

EGWTE 1304

SEQ ID NO: 11 - BoNT/X, аминокислотная последовательность (GenBank: BAQ12790.1)

MKLEINKFNYNDPIDGINVI™RPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNTNDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIPLPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEGTLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGISNRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISERLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVRKHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFIKICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISNKDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELYEPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPFKNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNIGNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRDQKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAKIKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDKFIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNLGAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNFSISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYIAFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLLDQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWSSFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMGISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETSKPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED

SEQ ID NO: 12 - Полипептидная последовательность TeNT - UniProt P04958

MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQ™VKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRI™TNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND

SEQ ID NO: 13 - Полипептидная последовательность BoNT/A - UniProt P10845

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKY™FHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 14 - Нуклеотидная последовательность mrBoNT/A

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO: 15 - Полипептидная последовательность mrBoNT/A

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKY™FHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 16 - Полипептидная последовательность BoNT/E - UniProt Q00496

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNC™NFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

SEQ ID NO: 17 - вещество P

RPKPQQFFGLM

ПРИМЕРЫ

Далее изобретение будет описано исключительно в качестве примера со ссылкой на следующие Примеры. Примеры служат для иллюстрации конкретных вариантов осуществления изобретения и никоим образом не ограничивают объем изобретения, определенный в формуле изобретения.

Задача данного исследования заключалась в оценке эффективности клостридиального нейротоксина, вводимого внутрикожным путем в модели кожных заболеваний на мышах Rhino. Диспорт (BoNT/A) был выбран в качестве тестируемого клостридиального нейротоксина. Вкратце, животным вводили (в виде однократного введения в день 1) внутрикожным путем (четыре участка инъекции) растворитель (физраствор) или Диспорт в трех возрастающих дозах под анестезией (по 0,1, 0,3 и 1 единицы Диспорта на мышь). Референсная группа получала 0,1% гель адапалена путем наружного применения ежедневно в течение 15 дней. В этот период животных ежедневно наблюдали. Массу тела и толщину кожи на спине измеряли в дни 1, 5, 10 и 15; макроскопические наблюдения (оценку эритемы и шелушения) проводили на мышах одновременно. Образцы кожного сала собирали только в день 15. В день 15 животных гуманно умерщвляли и собирали образцы кожи для гистологического исследования с окрашиванием гематоксилин-эозин-шафраном (HES для структурного/анатомического анализа, например, размера утрикул) и Ki67 (маркер пролиферации), ИФА и липидомных анализов.

В заключение следует отметить, что Диспорт, вводимый внутрикожно в дозах 0,1 Ед и 0,3 Ед на мышь, хорошо переносился. Самая высокая доза Диспорта (1 Ед на мышь) вызывала временную потерю мышечного тонуса, связанную с небольшой потерей массы тела (что было связано с диффузией Диспорта из участка внутрикожной инъекции); мыши восстанавливались до нормального состояния через 8 дней. Диспорт не оказывал значимого влияния на площадь поверхности утрикул (см. Фиг. 10), но вызывал значимое противовоспалительное действие на дерму в двух наиболее высоких дозах (см. Фиг. 12). Воспаление дермы (на области кожи спины) оценивали у каждой мыши по срезам HES путем подсчета количества ядер, которые являются маркером воспалительного инфильтрата. Более того, Диспорт не вызывал никаких побочных эффектов, обычно наблюдаемых при местном лечении ретиноидами (например, адапаленом), а также гиперплазии эпидермиса и воспаления дермы. Никаких изменений уровней цитокина IL-1 альфа при применении Диспорта не наблюдали (см. Фиг. 16), тогда как в коже спины регистрировали дозозависимое повышение концентрации вещества P (см. Фиг. 17), что свидетельствует о том, что Диспорт вызывает накопление нейропептидов в ткани, например, в результате ингибирования механизмов экзоцитоза. Липидомный анализ показал, что Диспорт значительно повышал содержание некоторых (желательных) видов липидов, обладающих защитными свойствами в отношении кожи, таких как жирные кислоты (Фиг. 2), сквален (Фиг. 3), холестерин (Фиг. 4), восковой эфир (Фиг. 5) и холестерил (Фиг. 6). Общий уровень кожного сала существенно не изменялся (Фиг. 1В).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мыши

Используемая линия: RHJ/LeJ (например, мыши Rhino); Пол: самки; возраст: 6-8 недель на момент приема; вес: около 20 г на момент прибытия; количество: 30 животных+2 запасных животных.

Как известно, эта линия мышей является подходящей моделью для оценки эффективности и фармакодинамики новых лекарственных средств для лечения кожных заболеваний. В литературе доступен значительный объем накопленных сведений для сравнения.

Поставщик: Животные были получены из The Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbour ME 04609, USA, и импортированы Charles River Laboratories, BP 0109, 69592 L'Arbresle Cedex, France.

Содержание: Животные содержались в клетках группами по 6 животных. Улучшение физического состояния проводили в клетках. Оборудование и виварии регулярно чистили. Клетки идентифицировали меткой, содержащей, как минимум, номер исследования и идентификационные данные животных. Минимальную и максимальную температуру (цель: 22±2°C) и влажность (цель: SO±20%) в помещениях ежедневно регистрировали и сохраняли в необработанных данных. Цикл света/темноты составлял 12/12 часов.

Исследуемый образец

BoNT/A (Диспорт) хранили при +4°C до применения. Гель адапалена 0,1% был получен из коммерческого источника (Differine®, Galderma, France).

Восстановление Диспорта (552 Ед Диспорта) (в 1 мл стерильного физраствора=исходный раствор) и последующие разведения (в 5 мл силиконизированных пробирках, Vacutainer, BD Biosciences) проводили в стерильном физрастворе следующим образом:

Группа Конечная концентрация нейротоксина (единиц/мл) Исходный раствор Концентрация раствора нейротоксина
(единиц/мл) Раствора нейротоксина (мкл) Физраствор (мкл) Конечный объем
(мкл) 3 1,25 Разбавленный стоковый раствор 55,2 36 1564 1600 4 3,75 Разбавленный стоковый раствор 55,2 108 1492 1600 S 12,5 Стоковый раствор 552 36 1564 1600

Обработка

Диспорт (исследуемый образец) или физраствор (отрицательный контроль) вводили внутрикожно в 4 участка на спине (см. Фигуру 1). Референсное соединение адапален (положительный контроль) наносили наружно (на кожу спины). Все введения производили в один день. Следующие вводимые дозы оценивали следующим образом:

Группа Кол-во животных растворитель состав концентрация Доза на мышь Объем 1 6 физраствор 0 0 0 4×20 мкл (в/к) 2 6 / Адапален, 0,1% гель 0 100 мкг 100 мкл (наружно) 3 6 физраствор Диспорт, доза 1 1,25 Ед/мл 0,1 Ед 4×20 мкл (в/к) 4 6 физраствор Диспорт, доза 2 3,75 Ед/мл 0,3 Ед 4×20 мкл (в/к) Ь 6 физраствор Диспорт, доза 3 12,5 Ед/мл 1 Ед 4×20 мкл (в/к)

В первый день введение получали по 6 животных в каждой группе (30 животных, подлежащих введению).

Внутрикожная инъекция (BoNT) и нанесение референсного соединения (Адапалена)

Внутрикожные инъекции (группы 1, 3, 4 и 5) проводили (только в день 1) под анестезией (изофлуран) в 4 участка на коже спины (4×20 мкл, в прямоугольник площадью около 2-3 см², по 80 мкл на мышь, см. Фигуру 1) при использовании иглы 30G, присоединенной к микрошприцу на 100 мкл.

Нанужное нанесение (без анестезии) референсного соединения (группа 2) производили ежедневно на участке спины площадью около 4 см², что соответствует прямоугольнику размером приблизительно от 1,5 см до 2,5 см на коже. После нанесения геля (100 мкл) область мягко массировали пальцем в перчатке в течение 10 секунд.

Конечные показатели эффективности

В 4-х точках, в дни 1 (до лечения), 5, 10 и 15 (до умерщвления) оценивали следующие параметры:

- Толщину кожи на спине с помощью штангенциркуля на участке нанесения

- Макроскопическое описание кожи на участке нанесения (если применимо)

Дополнительные наблюдения, такие как эритему или шелушение, отмечали при наличии признаков. Эти параметры оценивали, как указано ниже:

баллы эритема шелушение 0 Нормальное состояние Нормальное состояние 1 Легкая Легкое 2 Умеренная Умеренное 3 Выраженная Выраженное

Калиброванные цифровые изображения области нанесения составов получали в 4 точках (дни 1, 5, 10 и 15) до регистрации конечного показателя эффективности.

Сбор и обработка образцов

В день 15 (после инъекции/нанесения) мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков под анестезией изофлураном. Образцы кожи со спины удаляли на участке нанесения, одну часть ткани обозначали для гистологического исследования, переносили в формалин на 48 ч, затем в EtOH. Другую часть образцов замораживали и хранили при -80°C для ИФА.

Для анализа липидов (проводимого в день 15) стеклянный конус прикладывали к области кожи спины приблизительно на 10 секунд и удаляли для сбора кожного сала и хранили при -80°C до проведения анализа.

Гистология

Гистологию обрабатывали на платформе ANEXPLO, Toulouse, France. После заключения в парафин изготавливали срезы и проводили окрашивание HES (гематоксилин/эозин/шафран, для структурного/анатомического анализа, например, размера утрикул) и Ki67 (маркер пролиферации) (иммуногистохимия) на 2 разных срезах. Окрашенные срезы переводили в цифровые изображения (микроскоп с ×20 объективом) и сохраняли в архиве.

Сканирование изображений, анализ изображений и патологоанатомическое исследование проводили с зашифрованными данными, чтобы обеспечить объективный анализ следующих параметров (путем классического измерения поверхности/подсчета ядер при использовании программы для гистологического исследования):

- Измерения поверхности утрикул (HES)

- Поверхность сальных желез (HES)

- Толщина эпидермиса (HES)

- Воспаление дермы (HES)

- Пролиферация кератиноцитов и фибробластов (только Ki67)

Липидомный анализ

Образцы кожного сала (n=30) анализировали на липидомику для оценки состава липидов кожного сала при использовании анализа методом газовой хроматографии после экстракции липидов.

Исследовали следующие семейства липидов:

- Свободные жирные кислоты/моноглицериды

- Сквален

- Холестерин

- Восковые эфиры/диглицериды

- Холестериловые эфиры/триглицериды

Экстракцию липидов проводили следующим образом:

- 2 мл н-гексана добавляли на стеклянный конус (содержащий собранное кожное сало) в стеклянной пробирке объемом 5 мл.

- Пробирки встряхивали 1 мин

- Растворитель отбирали и помещали в другую чистую стеклянную пробирку, взвешенную перед анализом

- Растворитель выпаривали в токе азота при +60°C

- Пробирки взвешивали для вычисления общего количества собранного кожного сала (весы тщательно регулировали по весу тары/устанавливали на ноль)

- Во взвешенные сухие пробирки добавляли 700 мкл хлороформа/изопропанола 1:1

- Пробирки встряхивали 1 мин

- Добавляли 300 мкл воды

- Пробирки встряхивали 1 мин и помещали на орбитальный встряхиватель на 10 мин

- Пробирки центрифугировали 5 мин при 3000 g при окружающей температуре

- Органическую фазу отделяли и помещали в чистую стеклянную пробирку

- Растворитель выпаривали в токе азота при +60°C

- Сухой остаток экстрагировали 100 мкл этилацетата, помещали в пробирку для ГХ для ввода образца и хранили на +4°C до проведения анализа

Анализ ГХ выполняли на приборе ГХ/ПИД 7890B (Agilent), регистрацию данных проводили при использовании Empower 3 версии 3471 (Waters).

Использовали капиллярную колонку для газовой хроматографии Zebron ZB-SHT, ref.7HG-G015-02, размеры 30 м × 0,25 мм × 0,1 мкм. Использовали следующий метод ГХ:

- Температура инжектора 350°C/раздельный ввод

- Градиент температуры колонки:

от 80°C до 240°C со скоростью 10°C/мин

от 240°C до 320°C со скоростью 5°C/мин

от 320°C до 350°C со скоростью 2°C/мин

350°C в течение 20 мин.

- температура ПИД детектора 250°C

- скорость потока водорода ПИД 35 мл/мин;

- скорость потока воздуха ПИД 350 мл/мин; и/или

- скорость потока поддувочного гелия ПИД 25 мл/мин

После регистрации данных усредненные хроматограммы вычисляли для каждой группы и сравнивали между группами. Пики, представляющие интерес, интегрировали и использовали для сравнения между группами. Более подробно, была выполнена интеграция (основного) пика хроматограммы, соответствующего интересующему липиду, после чего площадь пика каждого соединения (липида) определяли в соответствии с площадью пика "стандартов" (известной концентрации) соответствующих липидов.

ИФА анализ

Образцы замороженной кожи (n=30) исследовали с использованием коммерческого набора для определения вещества P (Enzo, Substance P ELISA Kit, France) и IL-1 альфа (набор ИФА для обнаружения мышиного IL-1 альфа, Mabtech AB, France). Анализы ИФА проводили в двух повторностях с экстрактами тканей, полученных из образцов кожи, как указано производителем.

Экстракты тканей получали после механического измельчения (Precellys®, 3 цикла, 6800 об/мин, 30 сек с гранулами CKMixSO-R) в буфере DPBS с добавкой смеси ингибиторов протеаз (таблетки со смесью ингибиторов протеаз, Roche, Complete, Mini Easy Pack, France). После измельчения экстракт центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатанты удаляли и проводили дополнительное центрифугирование при 12000 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатанты хранили при -80°C. Перед измельчением образцы взвешивали, и все образцы ткани разводили одинаково в буфере (10 мг ткани в 0,1 мл буфера). ИФА на вещество P проводили в 96-луночном планшете. Анализ проводили в соответствии с методом, предоставленным поставщиком, и в соответствии с приведенной ниже методикой:

По 50 мкл тканевого экстракта или стандартов, или буфера (пустой образец) добавляли в соответствующие лунки с 50 мкл буфера, 50 мкл синего Конъюгата и 50 мкл антитела, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов при 500 об/мин. Затем планшет опорожняли и 3 раза промывали промывочным раствором. После последней промывки весь оставшийся промывочный буфер удаляли, в каждую лунку добавляли по 200 мкл раствора субстрата p-Npp и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл стоп-раствора и измеряли оптическую плотность при 405 нм. Одну калибровочную стандартную кривую анализировали в день анализа. Вычитание фона и количественный анализ на основе стандартного раствора выполняли в соответствии с рекомендациями поставщика.

ИФА на IL-1 альфа проводили в 96-луночном планшете. Анализ проводили в соответствии с методом, предоставленным поставщиком, и в соответствии с приведенной ниже методикой:

- мАт против IL-1 альфа наносили на лунки в концентрации 2 мкг/мл на лунку в течение ночи при 4°C.

- 2 раза промывали PBS (200 мкл/лунка)

- Добавляли 200 мкл/лунка PBST/BSA и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

- Планшет 5 раз промывали PBST (200 мкл/лунка)

- 100 мкл тканевого экстракта (разведение 1:1000 в PBST/BSA) или стандарта, или пустого образца добавляли в соответствующие лунки и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.

- 5 раз промывали PBST (200 мкл/лунка)

- Добавляли биотинилированные моноклональные антитела (100 мкл/лунка) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

- Планшет 5 раз промывали PBST (200 мкл/лунку)

- Добавляли стрептавидин-ЩФ (100 мкл на лунку) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

- Планшет 5 раз промывали PBST (200 мкл/лунка)

- Добавляли раствор субстрата p-Npp (100 мкл/лунка)

- Измеряли оптическую плотность при 405 нм после появления желтого окрашивания

Одну калибровочную стандартную кривую анализировали в день анализа.

Концентрации вещества P и IL-1 альфа выражены относительно веса ткани (образца).

ПРИМЕР 1

Внутрикожное введение BoNT/A не изменяет уровень кожного сала в эпидермисе

Измеряли уровни кожного сала в эпидермисе мышей в группах 1-5 (как описано в разделе "Обработка" Материалов и методов выше).

Стеклянный конус прикладывали к области кожи на спине приблизительно на 10 секунд и удаляли для сбора кожного сала, а затем взвешивали на аналитических весах (весы уравновешивали/тарировали с использованием того же стеклянного конуса до контакта с кожей для сбора кожного сала). Полученное в результате измерение веса соответствовало весу собранного кожного сала (с получением показания уровня кожного сала на коже мышей).

В уровне кожного сала между группой 1 (получавшей только растворитель) и любой из групп, получавших BoNT/A (группы 3-5) (см. Фиг. 1) не было обнаружено статистически значимого различия. Единственной группой, показывающей изменение (например, снижение) уровня кожного сала, была группа 2 (группа, получавшая адапален).

На Фиг. 1 показано среднее значение (и стандартное отклонение) для шести образцов.

ПРИМЕР 2

BoNT/A вызывает повышение уровня жирных кислот в кожном сале эпидермиса

Площади пиков (например, площади пиков на хроматограмме) представляющей интерес сальной жирной кислоты в образцах кожного сала приведены в Таблице ниже. Внутрикожное введение BoNT/A вызывало повышенную экскрецию жирных кислот в эпидермисе (на уровнях, точно соответствующих дозе), в отличие от адапалена. Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 2:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 3,069 7 4,375 13 14,713 19 15,603 25 22,681 2 8,288 8 7,074 14 10,373 20 12,281 26 14,233 3 6,749 9 4,869 15 9,166 21 10,479 27 9,245 4 10,604 10 13,608 16 11,775 22 12,132 28 21,457 5 8,850 11 6,204 17 14,899 23 13,981 29 10,943 6 13,239 12 7,882 18 15,801 24 12,156 30 14,846 Среднее 8,5 Среднее 7,3 Среднее 12,8 Среднее 12,8 Среднее 15,6 SD 3,5 SD 3,3 SD 2,7 SD 1,8 SD 5,5

ПРИМЕР 3

BoNT/A вызывает повышение уровня холестерина в кожном сале эпидермиса

Площади пиков холестерина (сальных желез) в образцах кожного сала приведены в Таблице ниже. Внутрикожное введение BoNT/A вызывало повышение экскреции холестерина в эпидермисе (на уровнях, точно соответствующих дозе). Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 4:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 11,036 7 38,921 13 79,338 19 101,645 25 152,057 2 26,101 8 59,612 14 62,687 20 77,480 26 73,678 3 32,789 9 43,932 15 58,712 21 66,999 27 63,521 4 57,242 10 114,258 16 68,635 22 83,102 28 152,254 5 51,177 11 53,274 17 93,606 23 82,409 29 78,120 6 66,478 12 69,339 18 91,404 24 75,833 30 107,209 Среднее 40,8 Среднее 63,2 Среднее 75,7 Среднее 81,2 Среднее 104,5 SD 21,0 SD 27,3 SD 14,8 SD 11,6 SD 39,7

ПРИМЕР 4

BoNT/A вызывает повышение уровня сквалена в кожном сале эпидермиса

Площади пиков сквалена (сальных желез) в образцах кожного сала показаны в Таблице ниже. Внутрикожное введение BoNT/A вызывало повышенную экскрецию сквалена в эпидермисе (на уровнях, точно соответствующих дозе). Это было особенно неожиданно, поскольку кожное сало мышей обычно не содержит (или содержит лишь незначительное количество) сквалена. Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 3:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 1,201 7 3,886 13 8,814 19 11,025 25 18,622 2 3,280 8 5,974 14 8,681 20 8,798 26 11,864 3 3,948 9 3,441 15 8,901 21 8,851 27 7,259 4 6,591 10 13,604 16 7,720 22 10,636 28 18,808 5 5,722 11 6,037 17 9,253 23 10,929 29 10,667 6 8,076 12 7,183 18 11,699 24 10,433 30 12,060 Среднее 4,8 Среднее 6,7 Среднее 9,2 Среднее 10,1 Среднее 13,2 SD 2,5 SD 27,3 SD 1,3 SD 1,0 SD 4,6

ПРИМЕР 5

BoNT/A вызывает повышенную экскрецию сквалена в эпидермисе

Площади пиков сложных восковых эфиров (сальных желез) в образцах кожного сала показаны в Таблице ниже. Внутрикожное введение BoNT/A вызывало повышенную экскрецию восковых эфиров в эпидермисе (на уровнях, точно соответствующих дозе). Были проанализированы три восковых эфира (обозначенные Воск 2, 3, 4). Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 5:

Воск 2:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 0,455 7 1,919 13 2,779 19 2,296 25 5,025 2 0,979 8 1,820 14 3,705 20 1,883 26 5,468 3 1,587 9 0,952 15 4,260 21 3,428 27 1,874 4 1,899 10 3,634 16 2,267 22 3,720 28 5,166 5 1,595 11 1,934 17 3,215 23 4,131 29 4,528 6 2,237 12 2,342 18 3,803 24 4,327 30 3,830 Среднее 1,5 Среднее 2,1 Среднее 3,3 Среднее 3,3 Среднее 4,3 SD 0,6 SD 0,9 SD 0,7 SD 1,0 SD 1,3

Воск 3:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 0,194 7 0,707 13 2,013 19 1,834 25 4,363 2 0,567 8 0,947 14 1,896 20 2,108 26 2,257 3 0,731 9 0,774 15 1,872 21 1,814 27 2,401 4 1,331 10 1,735 16 1,997 22 1,959 28 5,776 5 1,113 11 0,909 17 2,488 23 2,532 29 3,032 6 1,877 12 1,161 18 2,820 24 2,305 30 2,899 Среднее 0,97 Среднее 1,04 Среднее 2,19 Среднее 2,09 Среднее 3,45 SD 0,60 SD 0,38 SD 0,39 SD 0,28 SD 1,36

Воск 4:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 0,239 7 0,860 13 3,369 19 2,886 25 9,703 2 0,674 8 0,938 14 3,838 20 4,150 26 2,968 3 1,263 9 0,692 IS 3,707 21 2,849 27 6,110 4 2,512 10 2,067 16 4,589 22 3,139 28 13,906 s 1,801 11 0,850 17 5,439 23 4,827 29 6,596 6 4,034 12 1,287 18 5,719 24 4,245 30 5,844 Среднее 1,8 Среднее 1,1 Среднее 4,4 Среднее 3,7 Среднее 7,5 SD 1,4 SD 0,5 SD 1,0 SD 0,8 SD 3,8

ПРИМЕР 6

BoNT/A вызывает повышение уровня холестерилового эфира в кожном сале эпидермиса

Площади пиков холестерилового эфира (сальных желез) в образцах кожного сала показаны в Таблице ниже. Внутрикожное введение BoNT/A вызывало повышенную экскрецию холестерилового эфира в эпидермисе (на уровнях, точно соответствующих дозе). Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 6:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) ID живот-ного Площадь пика (мкВ*с) 1 ND 7 0,426 13 3,311 19 3,403 25 8,395 2 0,424 8 1,216 14 3,551 20 3,727 26 2,899 3 0,681 9 1,028 15 3,666 21 3,033 27 6,178 4 1,718 10 4,900 16 3,774 22 3,378 28 13,798 S 1,394 11 1,822 17 4,930 23 4,941 29 6,567 6 2,376 12 1,508 18 5,280 24 4,569 30 5,091 Среднее 1,3 Среднее 1,8 Среднее 4,1 Среднее 3,8 Среднее 7,2 SD 0,8 SD 1,6 SD 0,8 SD 0,8 SD 3,8

ПРИМЕР 7

BoNT/A вызывает удерживание вещества P в дерме

Ткани кожи гомогенизировали в DPBS, содержащем смесь ингибиторов протеаз (1 мг ткани: 0,01 мл буфера), методом механического измельчения при использовании керамических бус (3 цикла 6800 об/мин, 30 секунд), затем центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатанты собирали и оценивали уровни вещества P с использованием наборов ИФА (как описано в разделе "Материалы и методы"). Вещество P выражено в пг/г ткани.

Внутрикожное введение BoNT/A вызывало удерживание вещества P в эпидермисе (на уровнях, точно соответствующих дозе). Уровни вещества P в образцах кожи спины показаны в Таблице ниже. Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 7:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Концентрация (пг/г ткани) ID животного Концентрация (пг/г ткани) ID животного Концентрация (пг/г ткани) 1 469,6 7 409,8 13 550,0 2 323,6 8 403,9 14 940,9 3 323,8 9 491,3 15 207,8 4 390,9 10 335,5 16 808,2 5 275,4 11 414,1 17 431,6 6 558,0 12 453,4 18 513,5 Среднее 390,2 Среднее 418,0 Среднее 575,3 SD 106,3 SD 52,37 SD 263,8

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Концентрация (пг/г ткани) ID животного Концентрация (пг/г ткани) 19 1231,7 25 998,6 20 814,2 26 1137,8 21 1044,3 27 10049 22 618,5 28 721,1 23 918,9 29 1444,2 24 1187,8 30 1304,0 Среднее 969,2 Среднее 1101,8 SD 233,2 SD 254,7

ПРИМЕР 8

Динамика клинических показателей эритемы и шелушения

В дни 1, 5, 10 и 15 наблюдали и регистрировали клинические показатели (эритемы и шелушения на коже спины). В этом исследовании эритему и шелушение не наблюдали в группах 1, 3 и 4 (растворитель, Диспорт 0,1 Ед и Диспорт 0,3 Ед соответственно).

Более высокие показатели эритемы и шелушения наблюдали в референсной группе 2 по сравнению с группами, получавшими Диспорт. Только у 2 мышей в группе 5, получавших Диспорт 1 Ед, на день 5 наблюдали очень легкое шелушение (балл=1), которое исчезало ко дню 10.

Результаты представлены в Таблицах ниже. Эти данные проиллюстрированы гистограммами на Фигуре 8:

Динамика клинических показателей (эритемы) на коже спины в группе 2 (Адапален) (среднее +/- SD):

Группа 2 - Адапален 0,1% Параметр День ID животного Среднее SD 7 8 9 10 11 12 Оценка эритемы 1 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 1 0,3 0,5 10 1 1 2 1 1 1 1,2 0,4 15 1 1 1 2 1 0 1,0 0,6

Динамика клинических показателей (шелушение) на коже спины в группах 2 (Адапален) и 5 (Диспорт 1 Ед/мышь) (среднее +/- SD):

Группа 2 - Адапален Параметр День ID животного Среднее SD 7 8 9 10 11 12 Оценка шелушения 1 0 0 0 0 0 0 0 0 5 1 1 2 1 1 2 1,3 0,5 10 0 0 0 1 1 1 0,5 0,5 15 1 2 1 2 1 1 1,3 0,5 Группа 5 - Диспорт 1 Ед/мышь Параметр День ID животного Среднее SD 25 26 27 28 29 30 Оценка шелушения 1 0 0 0 0 0 0 0 0 5 1 0 1 0 0 0 0,3 0,5 10 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0

ПРИМЕР 9

Поверхность сальных желез после лечения

В день 15 образцы кожи, собранные вокруг двух верхних участков инъекции, собирали и фиксировали для окрашивания HES (гематоксилин/эозин/шафран) и Ki67.

На срезах HES оценивали несколько параметров: толщину эпидермиса, воспаление дермы, поверхность утрикул и сальных желез.

Для каждой мыши вычисляли поверхность 10 сальных желез на срезах HES. Адапален значимо увеличивал поверхность сальных желез, в отличие от Диспорта (BoNT/A). Результаты (среднее значение 10 измерений на мышь) с SD показаны в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 9:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Поверхность сальных желез (мкм²) ID животного Поверхность сальных желез (мкм²) ID животного Поверхность сальных желез (мкм²) 1 1684,7 7 3242,0 13 2072,3 2 2152,9 8 4040,2 14 2520,6 3 1825,4 9 2344,5 15 3293,6 4 2072,0 10 3534,4 16 2093,7 5 2682,4 11 5356,4 17 3548,7 6 1538,9 12 3301,4 18 1826,3 Среднее 1992,7 Среднее 3636,5 Среднее 2559,2 SD 409,0 SD 1006,8 SD 708,6

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Поверхность сальных желез (мкм²) ID животного Поверхность сальных желез (мкм²) 19 1624,2 25 1593,4 20 1764,6 26 2123,4 21 1747,9 27 2109,6 22 2197,0 28 1987,9 23 2300,1 29 1470,1 24 1505,2 30 1414,3 Среднее 1856,5 Среднее 1783,1 SD 319,5 SD 326,9

ПРИМЕР 10

Поверхность утрикул после обработки

Поверхность 10 утрикул вычисляли для каждой мыши на срезах HES. Адапален значимо уменьшал поверхность утрикулы, в отличие от Диспорта (BoNT/A). Результаты (среднее значение 10 измерений на мышь) с SD показаны в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 10:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного поверхность утрикул (мкм²) ID животного поверхность утрикул (мкм²) ID животного поверхность утрикул (мкм²) 1 8816,8 7 515,2 13 11871,1 2 8272,8 8 806,1 14 8247,5 3 8257,6 9 527,4 15 12172,1 4 11590,3 10 605,0 16 8537,3 5 10643,4 11 515,3 17 13359,6 6 13615,5 12 545,4 18 14739,6 Среднее 10199,4 Среднее 585,7 Среднее 11487,9 SD 2153,9 SD 113,1 SD 2603,8

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного поверхность утрикул (мкм²) ID животного поверхность утрикул (мкм²) 19 5705,2 25 9614,3 20 7213,5 26 5024,0 21 10045,7 27 10840,1 22 10159,0 28 10875,4 23 9468,5 29 10513,2 24 11972,7 30 8495,0 Среднее 9094,1 Среднее 9227,0 SD 2257,8 SD 2250,5

ПРИМЕР 11

Толщина эпидермиса после лечения

Толщину эпидермиса (на участке кожи спины) вычисляли для каждой мыши на срезах HES. Адапален значимо увеличивал толщину эпидермиса, в отличие от Диспорта (BoNT/A). Результаты (среднее по 6 измерениям на мышь) с SD показаны в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 11:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Толщина эпидермиса (мкм²) ID животного Толщина эпидермиса (мкм²) ID животного Толщина эпидермиса (мкм²) 1 19,3 7 61,3 13 24,8 2 22,0 8 59,3 14 20,0 3 23,1 9 59,9 15 23,3 4 20,6 10 58,8 16 24,2 5 20,7 11 62,4 17 24,0 6 19,8 12 59,7 18 23,2 Среднее 20,9 Среднее 60,2 Среднее 23,3 SD 1,4 SD 1,4 SD 1,7

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Толщина эпидермиса (мкм²) ID животного Толщина эпидермиса (мкм²) 19 23,9 25 22,5 20 21,5 26 24,1 21 26,0 27 22,3 22 20,8 28 24,0 23 22,3 29 23,5 24 21,8 30 22,3 Среднее 22,7 Среднее 23,1 SD 1,9 SD 0,8

ПРИМЕР 12

Воспаление дермы после обработки

Воспаление в дерме (на участке кожи спины) оценивали для каждой мыши на срезах HES путем измерения количества ядер/1000 мкм².

Адапален значимо усиливал воспаление, а Диспорт (BoNT/A) значимо уменьшал воспаление (в точном соответствии с дозой). Результаты с SD показаны в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 12:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Воспаление дермы (ядер/1000 мкм²) ID животного Воспаление дермы (ядер/1000 мкм²) ID животного Воспаление дермы (ядер/1000 мкм²) 1 4,56 7 4,15 13 4,34 2 4,15 8 6,46 14 4,65 3 5,04 9 5,16 15 4,08 4 5,23 10 6,79 16 4,30 5 4,70 11 6,91 17 4,90 6 4,80 12 5,65 18 3,58 Среднее 4,74 Среднее 5,85 Среднее 4,31 SD 0,38 SD 1,1 SD 0,46

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Воспаление дермы (ядер/1000 мкм²) ID животного Воспаление дермы (ядер/1000 мкм²) 19 3,76 25 3,81 20 3,99 26 3,06 21 3,26 27 3,64 22 3,83 28 3,49 23 3,61 29 3,31 24 4,61 30 3,68 Среднее 3,84 Среднее 3,50 SD 0,45 SD 0,27

ПРИМЕР 13

Пролиферация кератиноцитов после обработки

Пролиферацию кератиноцитов проводили путем автоматического подсчета Ki67-положительных клеток в эпидермисе на срезах после иммуноокрашивания Ki67. Адапален приводил к значимому увеличению пролиферации кератиноцитов, в отличие от Диспорта (BoNT/A). Результаты (среднее значение по шести областям на срез) представлены в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 13:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² 1 2956,0 7 4121,7 13 2616,4 2 3553,0 8 4733,8 14 3072,2 3 3664,2 9 4411,7 15 3277,7 4 3964,6 10 4260,9 16 3720,8 5 2481,0 11 4248,9 17 7571,8 6 3265,7 12 3981,7 18 3579,1 Среднее 3314,4 Среднее 4293,1 Среднее 3139,7 SD 534,3 SD 259,9 SD 479,7

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² 19 3051,5 25 2864,2 20 3316,0 26 3379,2 21 2608,9 27 4248,0 22 3381,6 28 3672,1 23 3481,3 29 3792,6 24 2539,4 30 2735,6 Среднее 3063,1 Среднее 3448,6 SD 405,2 SD 576,5

ПРИМЕР 14

Пролиферация фибробластов после обработки

Оценку пролиферации фибробластов проводили путем автоматического подсчета Ki67-положительных клеток в дерме на срезах после Ki67 иммуноокрашивания вместе с морфологическим анализом для идентификации фибробластов (что позволило количественно определить популяцию пролиферирующих фибробластов). Адапален приводил к значимому увеличению пролиферации фибробластов, в отличие от Диспорта (BoNT/A). Результаты (среднее значение по шести областям на срез) представлены в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 14:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² 1 872,3 7 1088,8 13 708,0 2 863,0 8 1181,9 14 920,1 3 1181,6 9 1229,8 15 1324,7 4 1233,8 10 1499,9 16 962,2 5 935,7 11 2072,0 17 1165,0 6 693,8 12 1218,1 18 1354,6 Среднее 963,3 Среднее 1381,8 Среднее 1072,4 SD 206,2 SD 365,0 SD 253,0

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² 19 3051,5 25 948,8 20 3316,0 26 928,2 21 2608,9 27 1087,2 22 3381,6 28 1005,1 23 3481,3 29 878,1 24 2539,4 30 782,1 Среднее 3063,1 Среднее 938,4 SD 405,2 SD 104,5

ПРИМЕР 15

Пролиферация себоцитов после обработки

Оценку пролиферации себоцитов проводили путем автоматического подсчета Ki67-положительных клеток в сальных железах на срезах после иммуноокрашивания Ki67, вместе с морфологическим анализом для идентификации себоцитов (что позволило количественно определить популяцию пролиферирующих себоцитов). Никаких изменений в пролиферации фибробластов не наблюдали ни в одной группе обработки. Результаты (среднее значение по шести областям на срез) представлены в Таблице ниже. Эти данные проиллюстрированы на гистограммах на Фигуре 15:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² 1 5390,6 7 4299,5 13 4091,2 2 4891,2 8 2928,2 14 4307,0 3 5238,0 9 3722,1 15 5359,8 4 5637,1 10 4331,9 16 4532,2 5 3251,1 11 3916,9 17 3199,1 6 4584,8 12 3392,4 18 4849,8 Среднее 4832,2 Среднее 3765,2 Среднее 4389,9 SD 858,8 SD 542,4 SD 733,0

группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Ki67-положительные клетки на мм² ID животного Ki67-положительные клетки на мм² 19 5017,9 25 3180,9 20 4448,9 26 3558,0 21 3107,3 27 5014,0 22 4436,8 28 4651,3 23 3481,3 29 4458,0 24 3764,3 30 3724,3 Среднее 4042,8 Среднее 4097,8 SD 712,6 SD 713,7

ПРИМЕР 16

Уровни цитокина IL-1 альфа после обработки

Ткани кожи гомогенизировали в DPBS, содержащем смесь ингибиторов протеаз (1 мг ткани: 0,01 мл буфера), методом механического измельчения при использовании керамических бус (3 цикла 6800 об/мин, 30 секунд), затем центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатанты собирали и оценивали уровни IL-1 альфа с использованием наборов для ИФА (как описано в разделе "Материалы и методы"). Уровни IL-1 альфа выражены в нг/г ткани.

Внутрикожное введение BoNT/A не вызывало изменения экскреции IL-1 альфа в эпидермис, однако обработка альдапаленом значительно снижала уровни IL-1 альфа. Уровни IL-1 альфа в образцах кожи спины показаны в Таблице ниже. Эти данные представлены в виде гистограммы на Фигуре 16:

группа 1 - растворитель группа 2 - Адапален группа 3 - Диспорт 0,1 Ед ID животного Концентрация (пг/г ткани) ID животного Концентрация (пг/г ткани) ID животного Концентрация (пг/г ткани) 1 771,8 7 69,3 13 748,4 2 799,4 8 36,4 14 843,6 3 881,4 9 50,4 15 1257,4 4 1216,3 10 40,3 16 906,9 5 978,7 11 45,1 17 889,3 6 636,1 12 45,1 18 991,6 Среднее 880,6 Среднее 47,8 Среднее 939,5 SD 200,3 SD 11,6 SD 175,0 группа 4 - Диспорт 0,3 Ед Группа 5 - Диспорт 1 Ед ID животного Концентрация (пг/г ткани) ID животного Концентрация (пг/г ткани) 19 835,8 25 1047,5 20 571,3 26 426,7 21 621,5 27 1047,9 22 857,2 28 1150,5 23 649,3 29 837,8 24 895,9 30 841,8 Среднее 738,5 Среднее 892,1 SD 140,0 SD 258,7

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в оценке эффективности Диспорта в модели сальных желез на мышах Rhino.

Вкратце, животным внутрикожно (однократная инъекция) вводили нейротоксин (Диспорт) в трех возрастающих дозах (0,1, 0,3 и 1 единица Диспорта на мышь) под анестезией. Дополнительной группе мышей ежедневно вводили адапален в форме 0,1% геля путем наружного применения в течение 15 дней в качестве сравнительного контроля. Группе, получавшей "только растворитель", внутрикожно вводили только физраствор в качестве контроля. В течение этого периода животных ежедневно наблюдали на присутствие клинических признаков, связанных с инъекцией токсина. Массу тела и параметры кожи на спине измеряли в дни 1, 5, 10 и 15. Возникновение эритемы и шелушения на участке нанесения также исследовали в те же дни. В день 15 эксперимент останавливали путем гуманного умерщвления. С обработанного участка кожи собирали кожное сало для липидомных анализов, затем образцы кожи собирали для проведения гистологических исследований и определения уровней цитокина IL-1 альфа и вещества P.

Во время исследования в группах 1, 2, 3 и 4 не было отмечено каких-либо существенных наблюдений или нежелательных эффектов. Что касается толщины кожи на спине, в группах, получавших Диспорт, не было выявлено значимых изменений (<10% между днями 1 и 15), небольшое и незначительное утолщение кожи (+14%) наблюдали в группе адапалена по сравнению с группой, получавшей растворитель. Мыши, ежедневно получавшие адапален, также демонстрировали более выраженную эритему на коже спины (средний балл от 0,3 до 1,1) со дня 5 по 15, нежели другие группы, при этом шелушение (средний балл от 0,5 до 1,3) также было повышено в данной группе в течение этого же периода. Никаких признаков эритемы или шелушения не наблюдали у мышей из групп 1, 3 и 4. В целом, макроскопическое исследование кожи не выявило каких-либо заметных проявлений после обработки Диспортом.

Что касается гистопатологии на срезах HES, Диспорт не оказывал значимого влияния на площадь поверхности утрикул ни при одной из исследованных доз (увеличение площади поверхности утрикул на 12% в группе 3 (Диспорт 0,1 Ед); снижение на 11% в группе 4 (Диспорт 0,3 Ед); снижение на 9,5% в группе 5 (Диспорт 1 Ед), тогда как адапален резко ингибировал этот параметр (снижение на 94%), что является основным проявлением активности ретиноидов в модели акне Rhino. Что касается параметра, связанного с утрикулами, площадь поверхности сальных желез не изменялась под воздействием Диспорта ни при одной из трех протестированных доз. У мышей, ежедневно получавших адапален, наблюдали значительное увеличение поверхности сальных желез (+82% по сравнению с группой, получавшей растворитель). Этот результат можно объяснить раскрытием утрикул, которые были чрезвычайно плотными после обработки Адапаленом, что могло привести к неэффективному опорожнению кожного сала и отеку соседних сальных желез. Окрашивание HES выявило значительную гиперплазию эпидермиса (увеличение толщины эпидермиса +188%), связанную с паракератозом у мышей, получавших адапален. Этот эффект широко описан при повторном лечении ретиноидами в качестве побочного эффекта и часто связан с усилением воспаления дермы (увеличение +23% в группе адапалена в данном исследовании). Диспорт не вызывал значимой гиперплазии эпидермиса ни при одной из трех доз (вариации толщины эпидермиса от 8% до 11% в группах 3, 4 и 5). Более того, Диспорт дозозависимо уменьшал инфильтрацию иммунных клеток в дерме, что свидетельствует о значимом противовоспалительном эффекте (10%, 19% и 26% снижение по сравнению с растворителем, группы 3, 4 и 5 соответственно).

Наконец, иммуноокрашивание Ki67, биомаркером клеточной пролиферации, использовали для выявления пролиферативного действия при лечении Диспортом или Адапаленом на себоциты (клетки сальных желез), фибробласты (клетки дермы) и кератиноциты (клетки эпидермиса). Диспорт не оказывал пролиферативного действия на сальные железы, дерму или клетки эпидермиса, тогда как в группе Адапалена наблюдали значительное увеличение числа Ki67-положительных клеток, как в эпидермисе, так и дерме (30% и 43% увеличение, кератиноциты и фибробласты, соответственно). Этот пролиферативный эффект соответствовал гиперплазии эпидермиса и инфильтрации иммунных клеток, наблюдаемых в этой группе. Вещество P и IL-1 альфа определяли методом ИФА в экстрактах тканей из разных групп. У контрольных и получавших адапален мышей уровни вещества P были аналогичными (390,2±106,3 и 418,0±52,4 пг/г ткани соответственно). Лечение диспортом дозозависимо повышало уровни вещества P (575,3±263,8; 969,2±233,2 и 1101,8±254,7 пг/г ткани, группы 3, 4 и 5 соответственно). У мышей, получавших диспорт в двух дозах, 0,3 Ед и 1 Ед, наблюдали значимое изменение содержания вещества P по сравнению с контрольными мышами (+148% и +182%, р<0,001 соответственно). Этот результат можно объяснить механизмом действия нейротоксина, который блокирует экзоцитоз на клеточном уровне, что приводит к накоплению нейропептидов в виде вещества P в нервных окончаниях кожи. Таким образом, этот результат подтверждает активность Диспорта in vivo.

Что касается уровней IL-1 альфа, повторное применение адапалена резко снижало уровни IL-1 альфа (880,6±200,3 в сравнении с 47,7±11,5 нг/г ткани, р<0,001, снижение на 96%). IL-1 альфа является основным цитокином в эпидермисе, который конститутивно секретируется кератиноцитами и значительно повышается в провоспалительном контексте, когда кератиноциты активируются при возмущениях кожной среды, например, при поражении кожи, бактериальных инфекциях или воздействии химических веществ. Ингибирование IL-1 альфа в группе адапалена соответствует противовоспалительным свойствам ретиноидов. Диспорт не изменял уровня IL-1 альфа ни при одной из трех испытанных доз (939,5±175,0; 738,5±140,0 и 892,0±259,7 нг/г ткани в группах 3, 4 и 5 соответственно).

Наконец, содержание липидов в кожном сале из кожи спины изменялось при лечении Диспортом: как указано в результатах, по изменению площади пика липидных соединений на хроматограммах уровни жирных кислот были повышены (+83%) у мышей, получавших Диспорт 1 Ед. Холестерин и сквален также значительно повышались в кожном сале при обработке Диспортом 0,3 Ед и 1 Ед (холестерин, +99% и +154% увеличение у мышей, получавших 0,3 Ед и 1 Ед, соответственно; сквален, +110% и +175% увеличение у мышей, получавших 0,3 Ед и 1 Ед соответственно). Уровни представляющих интерес сложных восковых эфиров изменялись под действием Диспорта: уровень воска 2 повышался на +126%, +128% и +195% у мышей, получавших Диспорт 0,1 Ед, 0,3 Ед и 1 Ед соответственно. Обработка Диспортом также увеличивала количество соединений Воск 3 и Воск 4 в кожном сале, аналогично Воску 2. Также содержание холестериловых эфиров в кожном сале было значимо повышено на 440% при самой высокой дозе Диспорта. Адапален, напротив, не вызывал существенного изменения содержания липидов кожного сала. В целом, эти результаты показывают, что лечение Диспортом может влиять на содержание кожного сала за счет повышения уровня некоторых липидов, проявляющих защитные свойства на коже.

В заключение, адапален продемонстрировал резкое уменьшение поверхности утрикул в данном исследовании, основной эффект, обычно наблюдаемый с ретиноидами в модели акне Rhino, что указывает на положительный эффект этого референсного соединения. Диспорт не изменял площади поверхности утрикул ни при одной из протестированных доз, но не вызывал побочных эффектов, обычно наблюдаемых при лечении ретиноидами, таких как гиперплазия эпидермиса и воспаление дермы. Диспорт не усиливал клеточную пролиферацию в эпидермисе и дерме и проявлял противовоспалительное действие на дерме уже при дозе 0,3 Ед, что представляет собой положительный эффект в данной модели. Диспорт не влиял на провоспалительный цитокин IL-1 альфа. И наоборот, Диспорт дозозависимо увеличивал в коже уровни вещества P, нейропептида, присутствующего в нервных окончаниях, что подтверждает активность нейротоксина in vivo в этом исследовании. Наконец, содержание липидов в кожном сале было изменено при лечении Диспортом, увеличение количества некоторых липидов с защитными свойствами кожи может быть благоприятным эффектом лечения Диспортом кожных заболеваний.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ипсен Биофарм Лимитед

<120> Лечение кожных заболеваний

<130> P63517WO

<150> GB2001353.8

<151> 2020-01-31

<160> 33

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 1

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 2

<211> 1291

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 3

<211> 1291

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 3

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn

1 5 10 15

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu

20 25 30

Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp

35 40 45

Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn

130 135 140

Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly

145 150 155 160

Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr

165 170 175

Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile

180 185 190

Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp

195 200 205

Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile

245 250 255

Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala

260 265 270

Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr

275 280 285

Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser

325 330 335

Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn

355 360 365

Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn

385 390 395 400

Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn

435 440 445

Lys Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro

450 455 460

Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys

465 470 475 480

Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Ser

485 490 495

Val Asp Gln Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gln Leu

500 505 510

Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly

515 520 525

Glu Asn Gln Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gln Asn Val Asp Tyr Leu

530 535 540

Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu

545 550 555 560

Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala

565 570 575

Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly

580 585 590

Val Gln Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp

595 600 605

Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp

610 615 620

Val Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn

625 630 635 640

Ser Val Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val

645 650 655

Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly

660 665 670

Ala Phe Val Ile Tyr Ser Lys Val Gln Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys

675 680 685

Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gln Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser

690 695 700

Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gln Phe

705 710 715 720

Asn Asn Ile Ser Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gln Ala Gly

725 730 735

Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser

740 745 750

Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu

755 760 765

Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg

770 775 780

Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile

785 790 795 800

Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn

805 810 815

Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gln Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile

835 840 845

Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr

850 855 860

Phe Asn Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys

865 870 875 880

Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu

885 890 895

Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly

900 905 910

Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn

915 920 925

Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile

930 935 940

Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp

945 950 955 960

Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe

965 970 975

Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn

980 985 990

Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe

995 1000 1005

Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr

1010 1015 1020

Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr

1025 1030 1035

Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met

1055 1060 1065

Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys

1070 1075 1080

Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val

1085 1090 1095

Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr

1100 1105 1110

Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser

1115 1120 1125

Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn

1130 1135 1140

Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn

1145 1150 1155

Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr

1160 1165 1170

Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met

1175 1180 1185

Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu

1190 1195 1200

Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile

1205 1210 1215

Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys

1220 1225 1230

Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly

1235 1240 1245

Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr

1250 1255 1260

Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu

1265 1270 1275

Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu

1280 1285 1290

<210> 4

<211> 1276

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 4

Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr

20 25 30

Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro

50 55 60

Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val

100 105 110

Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly

165 170 175

Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val

210 215 220

Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly

245 250 255

Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln

275 280 285

Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn

325 330 335

Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser

340 345 350

Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn

355 360 365

Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn

385 390 395 400

Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser

435 440 445

Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys

450 455 460

Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Asn Lys Ile Ile Thr Asp Glu

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile

485 490 495

Leu Asp Gly Gln Val Pro Ile Asn Pro Glu Ile Val Asp Pro Leu Leu

500 505 510

Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Glu Glu Ile Val

515 520 525

Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr

530 535 540

Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu

545 550 555 560

Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr

565 570 575

Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly

580 585 590

Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn

595 600 605

Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Val Ile

610 615 620

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg

625 630 635 640

Gly Asn Phe Asn Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu

645 650 655

Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe

660 665 670

Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn

675 680 685

Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Asn

705 710 715 720

Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala

725 730 735

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn

740 745 750

Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile

755 760 765

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val

770 775 780

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn

785 790 795 800

Lys Phe Asp Leu Arg Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser

805 810 815

His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val

820 825 830

Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Met Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr

835 840 845

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile

850 855 860

Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val

865 870 875 880

Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln

885 890 895

Leu Asn Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp

900 905 910

Lys Ile Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr

915 920 925

Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr

930 935 940

Asn Ser His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln

965 970 975

Asp Val Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser

980 985 990

Leu Ser His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu

1010 1015 1020

Lys Gln Ser Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp

1025 1030 1035

Lys Thr Ile Val Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln

1040 1045 1050

Met Leu Trp Ile Arg Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser

1055 1060 1065

Asn Glu Asp Ile Asn Ile Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn

1070 1075 1080

Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu

1085 1090 1095

Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro

1100 1105 1110

Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Pro Asp Arg Ser Lys

1115 1120 1125

Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys Ser Val Ser Asp Lys

1130 1135 1140

Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn Ile Ile Leu His

1145 1150 1155

Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg Asp Thr Asp

1160 1165 1170

Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Cys Val

1175 1180 1185

Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile Gly

1190 1195 1200

Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp

1220 1225 1230

Ile Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro

1235 1240 1245

Val Ala Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser

1250 1255 1260

Phe Trp Lys Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu

1265 1270 1275

<210> 5

<211> 1252

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 5

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr

1205 1210 1215

Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr

1220 1225 1230

Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly

1235 1240 1245

Trp Gln Glu Lys

1250

<210> 6

<211> 1278

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 6

Met Pro Val Val Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asp Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser

50 55 60

Leu Glu Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr

65 70 75 80

Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys

85 90 95

Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Glu Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser

100 105 110

Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Glu His Thr Pro Ile Asn Glu Phe

115 120 125

His Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Ser Ser Thr Asn

130 135 140

Val Lys Ser Ser Ile Ile Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ile Phe Glu Asn Ser Ser Tyr Pro Val Arg Lys Leu Met Asp Ser

165 170 175

Gly Gly Val Tyr Asp Pro Ser Asn Asp Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile

180 185 190

Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly

195 200 205

Gly Tyr Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser

210 215 220

Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg

225 230 235 240

Gly Val Thr Tyr Lys Glu Thr Ile Lys Val Lys Gln Ala Pro Leu Met

245 250 255

Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

260 265 270

Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn

275 280 285

Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Arg Val

290 295 300

Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

305 310 315 320

Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val

325 330 335

Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr

340 345 350

Glu Ile Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr

355 360 365

Phe Ile Lys Tyr Gly Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp

370 375 380

Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn

385 390 395 400

Asn Arg Gly Gln Asn Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile

405 410 415

Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val

420 425 430

Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val

435 440 445

Asn Asn Arg Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu

450 455 460

Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn

465 470 475 480

Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser

485 490 495

Glu Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Gln Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln

500 505 510

Asp Asp Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile

515 520 525

Glu Glu His Asn Val Val Asp Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala

530 535 540

Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile

545 550 555 560

Asp Thr Ala Leu Ser Glu Glu Ser Gln Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser

565 570 575

Glu Phe Ile Asn Thr Ile Asn Lys Pro Val His Ala Ala Leu Phe Ile

580 585 590

Ser Trp Ile Asn Gln Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln

595 600 605

Lys Ser Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Val Val Pro Tyr

610 615 620

Val Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Val Gln Lys Glu Asn Phe

625 630 635 640

Lys Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val

645 650 655

Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe

660 665 670

Ile Gly Ser Ser Glu Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Ala Ile Asn Asn

675 680 685

Ser Leu Met Glu Arg Glu Thr Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys

705 710 715 720

Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr

725 730 735

Val Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Arg Asn Arg

740 745 750

Leu Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Arg Glu Glu Leu Asn Lys

755 760 765

Lys Val Ser Leu Ala Met Glu Asn Ile Glu Arg Phe Ile Thr Glu Ser

770 775 780

Ser Ile Phe Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Ser Lys

785 790 795 800

Leu Arg Glu Tyr Asp Glu Gly Val Lys Glu Tyr Leu Leu Asp Tyr Ile

805 810 815

Ser Glu His Arg Ser Ile Leu Gly Asn Ser Val Gln Glu Leu Asn Asp

820 825 830

Leu Val Thr Ser Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser

835 840 845

Tyr Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Leu Tyr Phe Asn Lys Leu Tyr Lys

850 855 860

Lys Ile Lys Asp Asn Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys

865 870 875 880

Phe Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asp

885 890 895

Val Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Ser

900 905 910

Lys Pro Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn

915 920 925

Gly Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys

930 935 940

Tyr Phe Asn Lys Val Asn Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asp Cys

945 950 955 960

Ile Arg Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Asn Tyr Asn Lys

965 970 975

Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Asn Gln Lys Leu Val

980 985 990

Phe Asn Tyr Thr Gln Met Ile Ser Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp

995 1000 1005

Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser Arg Ile

1010 1015 1020

Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Glu Lys Ser Ile Ser Asn Leu

1025 1030 1035

Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Gly

1040 1045 1050

Cys Asn Asp Thr Arg Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys Val Phe

1055 1060 1065

Asp Thr Glu Leu Gly Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr Ser Asp

1070 1075 1080

Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu

1085 1090 1095

Leu Tyr Asn Lys Arg Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Leu Arg Thr Asp

1100 1105 1110

Lys Ser Ile Thr Gln Asn Ser Asn Phe Leu Asn Ile Asn Gln Gln

1115 1120 1125

Arg Gly Val Tyr Gln Lys Pro Asn Ile Phe Ser Asn Thr Arg Leu

1130 1135 1140

Tyr Thr Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Ser Thr Asp

1145 1150 1155

Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala Tyr

1160 1165 1170

Ile Asn Val Val Asp Arg Asp Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala Asp

1175 1180 1185

Ile Ser Ile Ala Lys Pro Glu Lys Ile Ile Lys Leu Ile Arg Thr

1190 1195 1200

Ser Asn Ser Asn Asn Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser

1205 1210 1215

Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Gly

1220 1225 1230

Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser

1235 1240 1245

Ser Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Arg Lys Asn Thr Ser Ser Asn Gly

1250 1255 1260

Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly Trp Gln Glu Asn

1265 1270 1275

<210> 7

<211> 1297

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 7

Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn

1 5 10 15

Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly

50 55 60

Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys

65 70 75 80

Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile

100 105 110

Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys

115 120 125

Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln

130 135 140

Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile

165 170 175

Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met

180 185 190

Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe

245 250 255

Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile

275 280 285

Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn

290 295 300

Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met

340 345 350

Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr

355 360 365

Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala

385 390 395 400

Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn

405 410 415

Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg

420 425 430

Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu

435 440 445

Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys

450 455 460

Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn

465 470 475 480

Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile

485 490 495

Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr

500 505 510

Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys

515 520 525

Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu

530 535 540

Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu

545 550 555 560

Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr

565 570 575

Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala

580 585 590

Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser

595 600 605

Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile

610 615 620

Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala

625 630 635 640

Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu

645 650 655

Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr

660 665 670

Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser

675 680 685

Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu

690 695 700

Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile

705 710 715 720

Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu

725 730 735

Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met

740 745 750

Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser

755 760 765

Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu

785 790 795 800

Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp

805 810 815

Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys

820 825 830

Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr

835 840 845

Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn

850 855 860

Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu

865 870 875 880

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val

885 890 895

Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu

900 905 910

Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser

915 920 925

Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr

930 935 940

Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

945 950 955 960

Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn

965 970 975

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile

980 985 990

Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys

995 1000 1005

Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn

1010 1015 1020

Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn

1025 1030 1035

Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile

1040 1045 1050

Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn

1055 1060 1065

Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr

1070 1075 1080

Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met

1100 1105 1110

Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu

1115 1120 1125

Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln

1130 1135 1140

Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn

1145 1150 1155

Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr

1160 1165 1170

Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val

1175 1180 1185

Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu

1190 1195 1200

Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile

1205 1210 1215

Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys

1220 1225 1230

Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe

1235 1240 1245

Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe

1250 1255 1260

Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn

1265 1270 1275

Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu

1280 1285 1290

Gly Trp Thr Glu

1295

<210> 8

<211> 1285

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 8

Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr

20 25 30

Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro

50 55 60

Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val

100 105 110

Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly

165 170 175

Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val

210 215 220

Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly

245 250 255

Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Phe Gly Gly Ser Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Leu Gln

275 280 285

Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ser Ser Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn

325 330 335

Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser

340 345 350

Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn

355 360 365

Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Lys His Tyr Leu Pro Val Phe

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Ile Asn Gly Phe Asn

385 390 395 400

Leu Thr Thr Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Arg Asn Ser Arg Asp Asp Ser

435 440 445

Thr Cys Ile Gln Val Lys Asn Asn Thr Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys

450 455 460

Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Ser Gln Ile Ile Thr Asp Glu

465 470 475 480

Thr Asn Val Glu Asn Tyr Ser Asp Asn Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile

485 490 495

Leu Asp Ala Lys Val Pro Thr Asn Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu Leu

500 505 510

Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Val Pro Gly Glu Glu Glu Val

515 520 525

Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Asp Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr

530 535 540

Tyr Leu Glu Ala Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu

545 550 555 560

Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr

565 570 575

Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly

580 585 590

Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn

595 600 605

Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Ala Ile

610 615 620

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg

625 630 635 640

Gly Asn Phe Lys Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu

645 650 655

Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe

660 665 670

Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn

675 680 685

Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Ser

705 710 715 720

Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala

725 730 735

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn

740 745 750

Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile

755 760 765

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val

770 775 780

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn

785 790 795 800

Lys Phe Asp Leu Lys Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser

805 810 815

His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val

820 825 830

Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr

835 840 845

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Met Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile

850 855 860

Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Thr Leu Met

865 870 875 880

Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu Gly Asn Val Gln

885 890 895

Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Asp

900 905 910

Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn

915 920 925

Ala Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys

930 935 940

Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn

945 950 955 960

Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr

965 970 975

Leu Lys Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn Phe Ser Tyr Asp

980 985 990

Ile Ser Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile

995 1000 1005

Thr Thr Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile Asn Gly Lys

1010 1015 1020

Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe

1025 1030 1035

Ser Lys Thr Ile Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr Gly

1040 1045 1050

Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp

1055 1060 1065

Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile

1070 1075 1080

Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val Lys Asp Tyr Trp

1085 1090 1095

Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Met Ile Asn Val

1100 1105 1110

Asn Tyr Met Asn Arg Tyr Met Ser Lys Lys Gly Asn Gly Ile Val

1115 1120 1125

Phe Asn Thr Arg Lys Asn Asn Asn Asp Phe Asn Glu Gly Tyr Lys

1130 1135 1140

Ile Ile Ile Lys Arg Ile Ile Gly Asn Thr Asn Asp Thr Arg Val

1145 1150 1155

Arg Gly Glu Asn Val Leu Tyr Phe Asn Thr Thr Ile Asp Asn Lys

1160 1165 1170

Gln Tyr Ser Leu Gly Met Tyr Lys Pro Ser Arg Asn Leu Gly Thr

1175 1180 1185

Asp Leu Val Pro Leu Gly Ala Leu Asp Gln Pro Met Asp Glu Ile

1190 1195 1200

Arg Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Ile Gln Pro Cys Asn Thr Phe Asp

1205 1210 1215

Tyr Tyr Ala Ser Gln Leu Phe Leu Ser Ser Asn Ala Thr Thr Asn

1220 1225 1230

Arg Ile Gly Ile Leu Ser Ile Gly Ser Tyr Ser Phe Lys Leu Gly

1235 1240 1245

Asp Asp Tyr Trp Phe Asn His Glu Tyr Leu Ile Pro Val Ile Lys

1250 1255 1260

Ile Glu His Tyr Ala Ser Leu Leu Glu Ser Thr Ser Thr His Trp

1265 1270 1275

Val Phe Val Pro Ala Ser Glu

1280 1285

<210> 9

<211> 1268

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 9

Met Pro Val Asn Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn

1 5 10 15

Thr Thr Ile Leu Tyr Met Lys Met Pro Tyr Tyr Glu Asp Ser Asn Lys

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Asp Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Asn Ile Ile Gly Lys Lys Pro Ser Asp Phe Tyr Pro Pro Ile Ser

50 55 60

Leu Asp Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr

65 70 75 80

Asp Ala Glu Lys Asp Arg Phe Leu Lys Thr Val Ile Lys Leu Phe Asn

85 90 95

Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Gln Val Leu Leu Glu Glu Ile Lys

100 105 110

Asn Gly Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Ala Val Asn Glu Phe

115 120 125

Cys Ala Asn Asn Arg Ser Thr Ser Val Glu Ile Lys Glu Ser Lys Gly

130 135 140

Thr Thr Asp Ser Met Leu Leu Asn Leu Val Ile Leu Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Asn Ile Leu Glu Cys Ser Thr Phe Pro Val Arg Ile Phe Pro Asn Asn

165 170 175

Ile Ala Tyr Asp Pro Ser Glu Lys Gly Phe Gly Ser Ile Gln Leu Met

180 185 190

Ser Phe Ser Thr Glu Tyr Glu Tyr Ala Phe Asn Asp Asn Thr Asp Leu

195 200 205

Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser Leu Ala His Glu Leu Ile His Val

210 215 220

Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys Gly Val Thr Asn Lys Lys Val Ile

225 230 235 240

Glu Val Asp Gln Gly Ala Leu Met Ala Ala Glu Lys Asp Ile Lys Ile

245 250 255

Glu Glu Phe Ile Thr Phe Gly Gly Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Asn

260 265 270

Ser Thr Asn Gln Lys Ile Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Asn Tyr Thr Ala

275 280 285

Ile Ala Ser Arg Leu Ser Gln Val Asn Ile Asn Asn Ser Ala Leu Asn

290 295 300

Thr Thr Tyr Tyr Lys Asn Phe Phe Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Gln

305 310 315 320

Asp Ser Asn Gly Asn Tyr Thr Val Asn Ile Ser Lys Phe Asn Ala Ile

325 330 335

Tyr Lys Lys Leu Phe Ser Phe Thr Glu Cys Asp Leu Ala Gln Lys Phe

340 345 350

Gln Val Lys Asn Arg Ser Asn Tyr Leu Phe His Phe Lys Pro Phe Arg

355 360 365

Leu Leu Asp Leu Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Ser Ile Ser Glu Gly Phe

370 375 380

Asn Ile Gly Ser Leu Arg Val Asn Asn Asn Gly Gln Asn Ile Asn Leu

385 390 395 400

Asn Ser Arg Ile Val Gly Pro Ile Pro Asp Asn Gly Leu Val Glu Arg

405 410 415

Phe Val Gly Leu Cys Lys Ser Ile Val Ser Lys Lys Gly Thr Lys Asn

420 425 430

Ser Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Arg Asp Leu Phe Phe Val Ala Ser

435 440 445

Glu Ser Ser Tyr Asn Glu Asn Gly Ile Asn Ser Pro Lys Glu Ile Asp

450 455 460

Asp Thr Thr Ile Thr Asn Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Leu Asp Glu Val

465 470 475 480

Ile Leu Asp Tyr Asn Ser Asp Ala Ile Pro Asn Leu Ser Ser Arg Leu

485 490 495

Leu Asn Thr Thr Ala Gln Asn Asp Ser Tyr Val Pro Lys Tyr Asp Ser

500 505 510

Asn Gly Thr Ser Glu Ile Lys Glu Tyr Thr Val Asp Lys Leu Asn Val

515 520 525

Phe Phe Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ala Pro Glu Gly Glu Ser Ala Ile

530 535 540

Ser Leu Thr Ser Ser Val Asn Thr Ala Leu Leu Asp Ala Ser Lys Val

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Phe Ile Asn Thr Val Asn Lys Pro Val

565 570 575

Gln Ala Ala Leu Phe Ile Ser Trp Ile Gln Gln Val Ile Asn Asp Phe

580 585 590

Thr Thr Glu Ala Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Ile Ala Asp Ile

595 600 605

Ser Leu Val Val Pro Tyr Val Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu

610 615 620

Val Gln Lys Gly Asn Phe Lys Glu Ala Ile Glu Leu Leu Gly Ala Gly

625 630 635 640

Ile Leu Leu Glu Phe Val Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val

645 650 655

Phe Thr Ile Lys Ser Phe Ile Asn Ser Asp Asp Ser Lys Asn Lys Ile

660 665 670

Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Arg Glu Arg Glu Leu Lys Trp Lys

675 680 685

Glu Val Tyr Ser Trp Ile Val Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr

690 695 700

Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln

705 710 715 720

Val Asp Gly Ile Lys Lys Ile Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr

725 730 735

Leu Asp Glu Lys Asn Arg Leu Lys Ala Glu Tyr Asn Ile Tyr Ser Ile

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Asn Lys Lys Val Ser Leu Ala Met Gln Asn Ile Asp

755 760 765

Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn

770 775 780

Glu Ala Lys Ile Asn Lys Leu Ser Glu Tyr Asp Lys Arg Val Asn Gln

785 790 795 800

Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Glu Asn Ser Ser Thr Leu Gly Thr Ser

805 810 815

Ser Val Gln Glu Leu Asn Asn Leu Val Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ser

820 825 830

Ile Pro Phe Glu Leu Ser Glu Tyr Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ser

835 840 845

Tyr Phe Asn Arg Phe Tyr Lys Arg Ile Ile Asp Ser Ser Ile Leu Asn

850 855 860

Met Lys Tyr Glu Asn Asn Arg Phe Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ser

865 870 875 880

Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asp Ile Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn

885 890 895

Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Ser Arg Leu Ser Glu Val Asn Ile Thr Gln

900 905 910

Asn Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Ser Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Val Ser

915 920 925

Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys Tyr Asn Asn Leu Lys Asn Leu Asn Asn

930 935 940

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys

945 950 955 960

Ile Ser Leu Asn Tyr Asn Asn Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Thr

965 970 975

Gly Asn Asn Gln Lys Leu Val Phe Asn Tyr Thr Gln Met Ile Asp Ile

980 985 990

Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Thr Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

995 1000 1005

Leu Gly His Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Thr Asp Gln

1010 1015 1020

Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val Asp Asp Asn Ile

1025 1030 1035

Leu Phe Lys Ile Val Gly Cys Asn Asp Thr Arg Tyr Val Gly Ile

1040 1045 1050

Arg Tyr Phe Lys Ile Phe Asn Met Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile

1055 1060 1065

Glu Thr Leu Tyr His Ser Glu Pro Asp Ser Thr Ile Leu Lys Asp

1070 1075 1080

Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Leu

1085 1090 1095

Asn Leu Leu Lys Pro Asn Met Ser Val Thr Lys Asn Ser Asp Ile

1100 1105 1110

Leu Asn Ile Asn Arg Gln Arg Gly Ile Tyr Ser Lys Thr Asn Ile

1115 1120 1125

Phe Ser Asn Ala Arg Leu Tyr Thr Gly Val Glu Val Ile Ile Arg

1130 1135 1140

Lys Val Gly Ser Thr Asp Thr Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg

1145 1150 1155

Lys Asn Asp Thr Val Tyr Ile Asn Val Val Asp Gly Asn Ser Glu

1160 1165 1170

Tyr Gln Leu Tyr Ala Asp Val Ser Thr Ser Ala Val Glu Lys Thr

1175 1180 1185

Ile Lys Leu Arg Arg Ile Ser Asn Ser Asn Tyr Asn Ser Asn Gln

1190 1195 1200

Met Ile Ile Met Asp Ser Ile Gly Asp Asn Cys Thr Met Asn Phe

1205 1210 1215

Lys Thr Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Leu

1220 1225 1230

Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr Lys Asn Ile Arg Asn

1235 1240 1245

Asn Thr Arg Asn Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu

1250 1255 1260

His Gly Trp Gln Glu

1265

<210> 10

<211> 1304

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 10

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala

885 890 895

Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe

900 905 910

Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln

915 920 925

Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp

930 935 940

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His

945 950 955 960

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys

965 970 975

Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn

980 985 990

Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile

995 1000 1005

Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn

1025 1030 1035

Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp

1055 1060 1065

Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn

1070 1075 1080

Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp

1115 1120 1125

Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn

1130 1135 1140

Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

1145 1150 1155

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

1160 1165 1170

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn

1175 1180 1185

Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu

1190 1195 1200

Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr

1205 1210 1215

Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser

1220 1225 1230

Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile

1235 1240 1245

Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe

1250 1255 1260

Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys

1265 1270 1275

Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp

1280 1285 1290

Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1295 1300

<210> 11

<211> 1306

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 11

Met Lys Leu Glu Ile Asn Lys Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Gly

1 5 10 15

Ile Asn Val Ile Thr Met Arg Pro Pro Arg His Ser Asp Lys Ile Asn

20 25 30

Lys Gly Lys Gly Pro Phe Lys Ala Phe Gln Val Ile Lys Asn Ile Trp

35 40 45

Ile Val Pro Glu Arg Tyr Asn Phe Thr Asn Asn Thr Asn Asp Leu Asn

50 55 60

Ile Pro Ser Glu Pro Ile Met Glu Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Leu Asn Thr Pro Ser Glu Lys Asp Glu Phe Leu Gln Gly Val Ile

85 90 95

Lys Val Leu Glu Arg Ile Lys Ser Lys Pro Glu Gly Glu Lys Leu Leu

100 105 110

Glu Leu Ile Ser Ser Ser Ile Pro Leu Pro Leu Val Ser Asn Gly Ala

115 120 125

Leu Thr Leu Ser Asp Asn Glu Thr Ile Ala Tyr Gln Glu Asn Asn Asn

130 135 140

Ile Val Ser Asn Leu Gln Ala Asn Leu Val Ile Tyr Gly Pro Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ile Ala Asn Asn Ala Thr Tyr Gly Leu Tyr Ser Thr Pro Ile Ser

165 170 175

Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Val Ser Phe Ser Pro Phe Tyr Leu

180 185 190

Lys Pro Phe Asp Glu Ser Tyr Gly Asn Tyr Arg Ser Leu Val Asn Ile

195 200 205

Val Asn Lys Phe Val Lys Arg Glu Phe Ala Pro Asp Pro Ala Ser Thr

210 215 220

Leu Met His Glu Leu Val His Val Thr His Asn Leu Tyr Gly Ile Ser

225 230 235 240

Asn Arg Asn Phe Tyr Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Lys Ile Glu Thr Ser

245 250 255

Arg Gln Gln Asn Ser Leu Ile Phe Glu Glu Leu Leu Thr Phe Gly Gly

260 265 270

Ile Asp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Leu Ile Ile Lys Lys Ile Ile Glu

275 280 285

Thr Ala Lys Asn Asn Tyr Thr Thr Leu Ile Ser Glu Arg Leu Asn Thr

290 295 300

Val Thr Val Glu Asn Asp Leu Leu Lys Tyr Ile Lys Asn Lys Ile Pro

305 310 315 320

Val Gln Gly Arg Leu Gly Asn Phe Lys Leu Asp Thr Ala Glu Phe Glu

325 330 335

Lys Lys Leu Asn Thr Ile Leu Phe Val Leu Asn Glu Ser Asn Leu Ala

340 345 350

Gln Arg Phe Ser Ile Leu Val Arg Lys His Tyr Leu Lys Glu Arg Pro

355 360 365

Ile Asp Pro Ile Tyr Val Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ser Tyr Ser Thr

370 375 380

Leu Glu Gly Phe Asn Ile Ser Ser Gln Gly Ser Asn Asp Phe Gln Gly

385 390 395 400

Gln Leu Leu Glu Ser Ser Tyr Phe Glu Lys Ile Glu Ser Asn Ala Leu

405 410 415

Arg Ala Phe Ile Lys Ile Cys Pro Arg Asn Gly Leu Leu Tyr Asn Ala

420 425 430

Ile Tyr Arg Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Leu Glu Asp

435 440 445

Lys Lys Thr Thr Ser Lys Thr Asn Val Ser Tyr Pro Cys Ser Leu Leu

450 455 460

Asn Gly Cys Ile Glu Val Glu Asn Lys Asp Leu Phe Leu Ile Ser Asn

465 470 475 480

Lys Asp Ser Leu Asn Asp Ile Asn Leu Ser Glu Glu Lys Ile Lys Pro

485 490 495

Glu Thr Thr Val Phe Phe Lys Asp Lys Leu Pro Pro Gln Asp Ile Thr

500 505 510

Leu Ser Asn Tyr Asp Phe Thr Glu Ala Asn Ser Ile Pro Ser Ile Ser

515 520 525

Gln Gln Asn Ile Leu Glu Arg Asn Glu Glu Leu Tyr Glu Pro Ile Arg

530 535 540

Asn Ser Leu Phe Glu Ile Lys Thr Ile Tyr Val Asp Lys Leu Thr Thr

545 550 555 560

Phe His Phe Leu Glu Ala Gln Asn Ile Asp Glu Ser Ile Asp Ser Ser

565 570 575

Lys Ile Arg Val Glu Leu Thr Asp Ser Val Asp Glu Ala Leu Ser Asn

580 585 590

Pro Asn Lys Val Tyr Ser Pro Phe Lys Asn Met Ser Asn Thr Ile Asn

595 600 605

Ser Ile Glu Thr Gly Ile Thr Ser Thr Tyr Ile Phe Tyr Gln Trp Leu

610 615 620

Arg Ser Ile Val Lys Asp Phe Ser Asp Glu Thr Gly Lys Ile Asp Val

625 630 635 640

Ile Asp Lys Ser Ser Asp Thr Leu Ala Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro

645 650 655

Leu Leu Asn Ile Gly Asn Asp Ile Arg His Gly Asp Phe Val Gly Ala

660 665 670

Ile Glu Leu Ala Gly Ile Thr Ala Leu Leu Glu Tyr Val Pro Glu Phe

675 680 685

Thr Ile Pro Ile Leu Val Gly Leu Glu Val Ile Gly Gly Glu Leu Ala

690 695 700

Arg Glu Gln Val Glu Ala Ile Val Asn Asn Ala Leu Asp Lys Arg Asp

705 710 715 720

Gln Lys Trp Ala Glu Val Tyr Asn Ile Thr Lys Ala Gln Trp Trp Gly

725 730 735

Thr Ile His Leu Gln Ile Asn Thr Arg Leu Ala His Thr Tyr Lys Ala

740 745 750

Leu Ser Arg Gln Ala Asn Ala Ile Lys Met Asn Met Glu Phe Gln Leu

755 760 765

Ala Asn Tyr Lys Gly Asn Ile Asp Asp Lys Ala Lys Ile Lys Asn Ala

770 775 780

Ile Ser Glu Thr Glu Ile Leu Leu Asn Lys Ser Val Glu Gln Ala Met

785 790 795 800

Lys Asn Thr Glu Lys Phe Met Ile Lys Leu Ser Asn Ser Tyr Leu Thr

805 810 815

Lys Glu Met Ile Pro Lys Val Gln Asp Asn Leu Lys Asn Phe Asp Leu

820 825 830

Glu Thr Lys Lys Thr Leu Asp Lys Phe Ile Lys Glu Lys Glu Asp Ile

835 840 845

Leu Gly Thr Asn Leu Ser Ser Ser Leu Arg Arg Lys Val Ser Ile Arg

850 855 860

Leu Asn Lys Asn Ile Ala Phe Asp Ile Asn Asp Ile Pro Phe Ser Glu

865 870 875 880

Phe Asp Asp Leu Ile Asn Gln Tyr Lys Asn Glu Ile Glu Asp Tyr Glu

885 890 895

Val Leu Asn Leu Gly Ala Glu Asp Gly Lys Ile Lys Asp Leu Ser Gly

900 905 910

Thr Thr Ser Asp Ile Asn Ile Gly Ser Asp Ile Glu Leu Ala Asp Gly

915 920 925

Arg Glu Asn Lys Ala Ile Lys Ile Lys Gly Ser Glu Asn Ser Thr Ile

930 935 940

Lys Ile Ala Met Asn Lys Tyr Leu Arg Phe Ser Ala Thr Asp Asn Phe

945 950 955 960

Ser Ile Ser Phe Trp Ile Lys His Pro Lys Pro Thr Asn Leu Leu Asn

965 970 975

Asn Gly Ile Glu Tyr Thr Leu Val Glu Asn Phe Asn Gln Arg Gly Trp

980 985 990

Lys Ile Ser Ile Gln Asp Ser Lys Leu Ile Trp Tyr Leu Arg Asp His

995 1000 1005

Asn Asn Ser Ile Lys Ile Val Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Phe Asn

1010 1015 1020

Gly Trp Asn Leu Ile Thr Ile Thr Asn Asn Arg Ser Lys Gly Ser

1025 1030 1035

Ile Val Tyr Val Asn Gly Ser Lys Ile Glu Glu Lys Asp Ile Ser

1040 1045 1050

Ser Ile Trp Asn Thr Glu Val Asp Asp Pro Ile Ile Phe Arg Leu

1055 1060 1065

Lys Asn Asn Arg Asp Thr Gln Ala Phe Thr Leu Leu Asp Gln Phe

1070 1075 1080

Ser Ile Tyr Arg Lys Glu Leu Asn Gln Asn Glu Val Val Lys Leu

1085 1090 1095

Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asn Ser Asn Tyr Ile Arg Asp Ile Trp Gly

1100 1105 1110

Asn Pro Leu Gln Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Gln Thr Gln Asp

1115 1120 1125

Lys Pro Gly Lys Gly Leu Ile Arg Glu Tyr Trp Ser Ser Phe Gly

1130 1135 1140

Tyr Asp Tyr Val Ile Leu Ser Asp Ser Lys Thr Ile Thr Phe Pro

1145 1150 1155

Asn Asn Ile Arg Tyr Gly Ala Leu Tyr Asn Gly Ser Lys Val Leu

1160 1165 1170

Ile Lys Asn Ser Lys Lys Leu Asp Gly Leu Val Arg Asn Lys Asp

1175 1180 1185

Phe Ile Gln Leu Glu Ile Asp Gly Tyr Asn Met Gly Ile Ser Ala

1190 1195 1200

Asp Arg Phe Asn Glu Asp Thr Asn Tyr Ile Gly Thr Thr Tyr Gly

1205 1210 1215

Thr Thr His Asp Leu Thr Thr Asp Phe Glu Ile Ile Gln Arg Gln

1220 1225 1230

Glu Lys Tyr Arg Asn Tyr Cys Gln Leu Lys Thr Pro Tyr Asn Ile

1235 1240 1245

Phe His Lys Ser Gly Leu Met Ser Thr Glu Thr Ser Lys Pro Thr

1250 1255 1260

Phe His Asp Tyr Arg Asp Trp Val Tyr Ser Ser Ala Trp Tyr Phe

1265 1270 1275

Gln Asn Tyr Glu Asn Leu Asn Leu Arg Lys His Thr Lys Thr Asn

1280 1285 1290

Trp Tyr Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Asp Glu Asp

1295 1300 1305

<210> 12

<211> 1315

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium tetani

<400> 12

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser

50 55 60

Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr

65 70 75 80

Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn

85 90 95

Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile

100 105 110

Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro

130 135 140

Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe

145 150 155 160

Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu

165 170 175

Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser

180 185 190

Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn

195 200 205

Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe

210 215 220

Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys

245 250 255

Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn

290 295 300

Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn

340 345 350

Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn

355 360 365

Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys

370 375 380

Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe

385 390 395 400

Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met

405 410 415

Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val

420 425 430

Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile

435 440 445

Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly

450 455 460

Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr

485 490 495

Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile

500 505 510

Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg

515 520 525

Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser

530 535 540

Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile

545 550 555 560

Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile

565 570 575

Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile

580 585 590

Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln

595 600 605

Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr

610 615 620

Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser

625 630 635 640

Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly

645 650 655

Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu

660 665 670

Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu

675 680 685

Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile

690 695 700

Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys

705 710 715 720

Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys

725 730 735

Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile

740 745 750

Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys

755 760 765

Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu

770 775 780

Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser

785 790 795 800

Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln

805 810 815

Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile

820 825 830

Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu

835 840 845

Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser

850 855 860

Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile

865 870 875 880

Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile

885 890 895

Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala

900 905 910

Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn

915 920 925

Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn

930 935 940

Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

945 950 955 960

Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile

965 970 975

Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser

980 985 990

Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala

995 1000 1005

Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe

1010 1015 1020

Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn

1025 1030 1035

Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met

1040 1045 1050

Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn

1055 1060 1065

Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr

1070 1075 1080

Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro

1085 1090 1095

Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe

1100 1105 1110

Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr

1115 1120 1125

Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys

1130 1135 1140

Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr

1145 1150 1155

Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu

1160 1165 1170

Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser

1175 1180 1185

Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe

1205 1210 1215

Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly

1220 1225 1230

Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu

1235 1240 1245

Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala

1250 1255 1260

Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp

1265 1270 1275

Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His

1280 1285 1290

Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr

1295 1300 1305

Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp

1310 1315

<210> 13

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 13

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 14

<211> 3888

<212> ДНК

<213> Clostridium botulinum

<400> 14

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaagca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 15

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 15

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 16

<211> 1251

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 16

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Arg Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Cys Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Arg Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Phe Glu Asp Asn Arg Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn

1190 1195 1200

Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val

1205 1210 1215

Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn

1220 1225 1230

Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp

1235 1240 1245

Gln Glu Lys

1250

<210> 17

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 17

Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met

1 5 10

<210> 18

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 18

Asn Ile Ile Asn Thr Ser

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 19

Asn Ile Val Asn Thr Ser

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 20

Asn Ile Val Asn Thr Ser

1 5

<210> 21

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 21

Asn Ile Thr Asn Ala Ser

1 5

<210> 22

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 22

Asn Ile Ile Asn Thr Ser

1 5

<210> 23

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 23

Asn Ile Ile Asn Thr Ser

1 5

<210> 24

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 24

Asn Ile Ile Asn Thr Ser

1 5

<210> 25

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 25

Asn Ile Thr Asn Thr Ser

1 5

<210> 26

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 26

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 27

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 27

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 28

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 28

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 29

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 29

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 30

Asp Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 31

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 31

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 32

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 32

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<210> 33

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 33

Glu Ile Leu Asn Asn Ile

1 5

<---

Группа изобретений относится к области фармации и медицины, а именно к лечению кожных заболеваний клостридиальными нейротоксинами. Способ лечения кожного заболевания, включающий внутрикожное введение пациенту ботулинического нейротоксина в терапевтически эффективном количестве, где после введения ботулинический нейротоксин вызывает секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи, где кожное заболевание представляет собой заболевание, связанное с пониженным уровнем одного или нескольких сальных липидов в эпидермальном слое кожи пациента по сравнению с уровнем одного или больше сальных липидов у субъекта, который не имеет указанного кожного заболевания. Нетерапевтическое применение ботулинического нейротоксина в количестве, эффективном для косметической обработки кожи, где ботулинический нейротоксин вызывает секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает: жирную кислоту в концентрации менее чем 50% об./об., сложный восковой эфир в концентрации менее чем 20% об./об., сквален в концентрации менее чем 10% об./об.; и/или холестерин в концентрации менее чем 4% об./об. Нетерапевтическое применение ботулинического нейротоксина в количестве, эффективном для стимуляции омоложения кожи субъекта, где ботулинический нейротоксин вызывает секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает: жирную кислоту в концентрации менее чем 50% об./об., сложный восковой эфир в концентрации менее чем 20% об./об., сквален в концентрации менее чем 10% об./об.; и/или холестерин в концентрации менее чем 4% об./об. Заявленная группа изобретений обеспечивает повышение уровней важных защитных кожных сальных липидов в кожном сале эпидермиса и улучшение качества кожного сала, в результате чего кожное сало содержит более высокий относительный процент требуемых липидов при внутрикожном введении клостридиального нейротоксина. 3 н. и 72 з.п. ф-лы, 17 ил., 17 табл., 16 пр.

1. Способ лечения кожного заболевания, включающий внутрикожное введение пациенту ботулинического нейротоксина в терапевтически эффективном количестве, где после введения ботулинический нейротоксин вызывает секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи,

где кожное заболевание представляет собой заболевание, связанное с пониженным уровнем одного или нескольких сальных липидов в эпидермальном слое кожи пациента по сравнению с уровнем одного или больше сальных липидов у субъекта, который не имеет указанного кожного заболевания.

2. Способ по п. 1, где после введения ботулинического нейротоксина:

- не вызывается никакого повышения уровня кожного сала на коже пациента относительно референсного стандарта; и предпочтительно не вызывается никакого снижения уровня кожного сала на коже пациента относительно референсного стандарта;

- где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже субъекта, которому не вводили ботулинический нейротоксин, или где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже пациента перед введением ботулинического нейротоксина.

3. Способ по п. 1 или 2, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, имеющему более низкий уровень указанного одного или больше сальных липидов на эпидермальном слое, чем уровень указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не имеет кожного заболевания.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где кожное заболевание вызвано сниженным уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не имеет кожного заболевания.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, кожа которого подверглась воздействию агента, вызывающего снижение уровня указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не подвергся воздействию такого агента.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанный агент является химическим соединением, выбранным из металла, химического соединения мыла, ароматизатора, консерванта, ботанического химиката и парафенилендиамина.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает:

- жирную кислоту в концентрации менее чем 50% об./об.;

- сложный восковой эфир в концентрации менее чем 20% об./об.;

- сквален в концентрации менее чем 10% об./об.; и/или

- холестерин в концентрации менее чем 4% об./об.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где кожным заболеванием является одно или более состояний, выбранных из акне, атопического дерматита, синдрома Нетертона, псориаза, обезвоженной кожи, например, сухой или потрескавшейся кожи, актинического кератоза, розовых угрей, карбункула, экземы, целлюлита, дерматита, рака кожи и фолликулярного кератоза.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где кожным заболеванием является одно или более состояний, выбранных из псориаза, экземы и дерматита.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где кожным заболеванием является одно или более, выбранных из атопического дерматита, псориаза, ксероза, обезвоженной кожи, например, сухой или потрескавшейся кожи, экземы, например, атопического дерматита, болезни Гоше 2-го типа, синдрома Шегрена-Ларссона, ихтиоза, например, ламеллярного ихтиоза, Х-сцепленного ихтиоза, буллезной ихтиозиформной эритродермии, дефицита незаменимых СЖК, возрастной сухости кожи и гипогидротической эктодермальной дисплазии.

11. Способ по п. 10, где кожным заболеванием является одно или более, выбранных из ксероза, псориаза, атопического дерматита и ихтиоза; например, ксероза, псориаза или ихтиоза.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где ботулинический нейротоксин вводят в нелицевую область кожи пациента.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где ботулинический нейротоксин вводят в руку(и) пациента, ногу, например, ноги, шею, кожу волосистой части головы и/или спину, например, верхнюю часть спины.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где пациент не имеет жирной кожи до и/или после введения ботулинического нейротоксина.

15. Способ по любому из пп. 1-14, где пациент имеет кожное сало на уровне менее чем или равном 180 мг/см² кожи на лбу, носогубной борозде и/или носу.

16. Способ по любому из пп. 1-15, где после введения пациенту ботулинический нейротоксин вызывает удерживание тахикининового пептида в дерме кожи.

17. Способ по п. 16, где указанный тахикининовый пептид является веществом P, например, SEQ ID NO.: 17.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где указанный ботулинический нейротоксин является нейротоксином BoNT/A.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где указанный ботулинический нейротоксин является химерным нейротоксином.

20. Способ по п. 19, где химерный нейротоксин выбран из группы, состоящей из BoNT/DC и BoNT/X.

21. Способ по п. 19, где химерный нейротоксин включает домен LH_N из первого нейротоксина, ковалентно связанный с доменом H_C из второго нейротоксина, предпочтительно:

где указанный первый и второй нейротоксины являются разными,

где C-концевой аминокислотный остаток указанного домена LH_N соответствует первому аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном первом нейротоксине, и

где N-концевой аминокислотный остаток указанного домена H_C соответствует второму аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном втором нейротоксине.

22. Способ по п. 21, где указанным первым нейротоксином является BoNT/A, и где указанным вторым нейротоксином является BoNT/B.

23. Способ по любому из пп. 1-22, где внутрикожное введение включает введение дозы ботулинического нейротоксина в пределах от приблизительно 0,00025 нг до 3 нг в участок введения.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где внутрикожное введение включает внутрикожную инъекцию с использованием иглы калибра 30G, предпочтительно, где иглу калибра 30G вводят в дерму кожи под углом приблизительно 5°-15° относительно плоской поверхности кожи.

25. Способ по любому из пп. 1-24, где эпидермальный слой является одним или более, выбранными из базального слоя, шиповатого слоя, зернистого слоя или рогового слоя.

26. Способ по любому из пп. 1-25, где эпидермальный слой является роговым слоем.

27. Нетерапевтическое применение ботулинического нейротоксина в количестве, эффективном для косметической обработки кожи, где ботулинический нейротоксин вызывает секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает:

- жирную кислоту в концентрации менее чем 50% об./об.;

- сложный восковой эфир в концентрации менее чем 20% об./об.;

- сквален в концентрации менее чем 10% об./об.; и/или

- холестерин в концентрации менее чем 4% об./об.

28. Применение по п. 27, где после введения ботулинического нейротоксина:

- не вызывается никакого повышения уровня кожного сала на коже пациента относительно референсного стандарта; и предпочтительно не вызывается никакого снижения уровня кожного сала на коже пациента относительно референсного стандарта;

- где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже субъекта, которому не вводили ботулинический нейротоксин, или где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже пациента перед введением ботулинического нейротоксина.

29. Применение по п. 27 или 28, где ботулинический нейротоксин вводят путем внутрикожного введения.

30. Применение по любому из пп. 27-29, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, кожа которого подверглась воздействию агента, вызывающего снижение уровня указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не подвергся воздействию такого агента.

31. Применение по любому из пп. 27-30, где указанный агент является химическим соединением, выбранным из металла, химического соединения мыла, ароматизатора, консерванта, ботанического химиката и парафенилендиамина.

32. Применение по любому из пп. 30-31, где кожное заболевание является заболеванием, связанным с нарушением уровня сального липида, где сальный липид присутствует в эпидермальном слое на более низком уровне, чем в эпидермальном слое пациента, который не имеет такого кожного заболевания.

33. Применение по любому из пп. 30-32, где кожным заболеванием является одно или более состояний, выбранных из акне, атопического дерматита, синдрома Нетертона, псориаза, обезвоженной кожи, например, сухой или потрескавшейся кожи, актинического кератоза, розовых угрей, карбункула, экземы, целлюлита, дерматита, рака кожи и фолликулярного кератоза.

34. Применение по любому из пп. 30-33, где кожным заболеванием является одно или более состояний, выбранных из псориаза, экземы и дерматита.

35. Применение по любому из пп. 30-34, где кожным заболеванием является одно или более, выбранных из атопического дерматита, псориаза, ксероза, обезвоженной кожи, например, сухой или потрескавшейся кожи, экземы, например, атопического дерматита, болезни Гоше 2-го типа, синдрома Шегрена-Ларссона, ихтиоза, например, ламеллярного ихтиоза, Х-сцепленного ихтиоза, буллезной ихтиозиформной эритродермии, дефицита незаменимых СЖК, возрастной сухости кожи и гипогидротической эктодермальной дисплазии.

36. Применение по п. 35, где кожным заболеванием является одно или более, выбранных из ксероза, псориаза, атопического дерматита и ихтиоза; например, ксероза, псориаза или ихтиоза.

37. Применение по любому из пп. 27-36, где ботулинический нейротоксин вводят в нелицевую область кожи пациента.

38. Применение по любому из пп. 27-37, где ботулинический нейротоксин вводят в руку(и) пациента, ногу, например, ноги, шею, кожу волосистой части головы и/или спину, например, верхнюю часть спины.

39. Применение по любому из пп. 27-38, где пациент не имеет жирной кожи до и/или после введения ботулинического нейротоксина.

40. Применение по любому из пп. 27-39, где пациент имеет кожное сало на уровне менее чем или равном 180 мг/см² кожи на лбу, носогубной борозде и/или носу.

41. Применение по любому из пп. 27-40, где после введения пациенту ботулинический нейротоксин вызывает удерживание тахикининового пептида в дерме кожи.

42. Применение по п. 41, где указанный тахикининовый пептид является веществом P, например, SEQ ID NO: 17.

43. Применение по любому из пп. 27-42, где указанный ботулинический нейротоксин является нейротоксином BoNT/A.

44. Применение по любому из пп. 27-43, где указанный ботулинический нейротоксин является химерным нейротоксином.

45. Применение по п. 44, где химерный нейротоксин выбран из группы, состоящей из BoNT/DC и BoNT/X.

46. Применение по п. 44, где химерный нейротоксин включает домен LH_N из первого нейротоксина, ковалентно связанный с доменом H_C из второго нейротоксина, предпочтительно:

где указанный первый и второй нейротоксины являются разными,

где C-концевой аминокислотный остаток указанного домена LH_N соответствует первому аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном первом нейротоксине, и

где N-концевой аминокислотный остаток указанного домена H_C соответствует второму аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном втором нейротоксине.

47. Применение по п. 46, где указанным первым нейротоксином является BoNT/A, и где указанным вторым нейротоксином является BoNT/B.

48. Применение по любому из пп. 27-47, где внутрикожное введение включает введение дозы ботулинического нейротоксина в пределах от приблизительно 0,00025 нг до 3 нг в участок введения.

49. Применение по любому из пп. 27-48, где внутрикожное введение включает внутрикожную инъекцию с использованием иглы калибра 30G, предпочтительно, где иглу калибра 30G вводят в дерму кожи под углом приблизительно 5°-15° относительно плоской поверхности кожи.

50. Применение по любому из пп. 27-49, где эпидермальный слой является одним или более, выбранными из базального слоя, шиповатого слоя, зернистого слоя или рогового слоя.

51. Применение по любому из пп. 27-50, где эпидермальный слой является роговым слоем.

52. Нетерапевтическое применение ботулинического нейротоксина в количестве, эффективном для стимуляции омоложения кожи субъекта, где ботулинический нейротоксин вызывает секрецию одного или больше сальных липидов, выбранных из сквалена, жирной кислоты, холестерина и сложного воскового эфира, в эпидермальном слое кожи, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, имеющему кожное сало, которое включает:

- жирную кислоту в концентрации менее чем 50% об./об.;

- сложный восковой эфир в концентрации менее чем 20% об./об.;

- сквален в концентрации менее чем 10% об./об.; и/или

- холестерин в концентрации менее чем 4% об./об.

53. Применение по п. 52, где после введения ботулинического нейротоксина:

- не вызывается никакого повышения уровня кожного сала на коже пациента относительно референсного стандарта; и предпочтительно не вызывается никакого снижения уровня кожного сала на коже пациента относительно референсного стандарта;

- где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже субъекта, которому не вводили ботулинический нейротоксин, или где референсный стандарт соответствует уровню кожного сала на коже пациента перед введением ботулинического нейротоксина.

54. Применение по п. 52, где ботулинический нейротоксин вводят путем внутрикожного введения.

55. Применение по любому из пп. 52-54, где ботулинический нейротоксин вводят пациенту, кожа которого подверглась воздействию агента, вызывающего снижение уровня указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое пациента по сравнению с уровнем указанного одного или больше сальных липидов в эпидермальном слое субъекта, который не подвергся воздействию такого агента.

56. Применение по любому из пп. 52-55, где указанный агент является химическим соединением, выбранным из металла, химического соединения мыла, ароматизатора, консерванта, ботанического химиката и парафенилендиамина.

57. Применение по любому из пп. 55-56, где кожным заболеванием является одно или более состояний, выбранных из акне, атопического дерматита, синдрома Нетертона, псориаза, обезвоженной кожи, например, сухой или потрескавшейся кожи, актинического кератоза, розовых угрей, карбункула, экземы, целлюлита, дерматита, рака кожи и фолликулярного кератоза.

58. Применение по любому из пп. 55-57, где кожным заболеванием является одно или более состояний, выбранных из псориаза, экземы и дерматита.

59. Применение по любому из пп. 55-58, где кожным заболеванием является одно или более, выбранных из атопического дерматита, псориаза, ксероза, обезвоженной кожи, например, сухой или потрескавшейся кожи, экземы, например, атопического дерматита, болезни Гоше 2-го типа, синдрома Шегрена-Ларссона, ихтиоза, например, ламеллярного ихтиоза, Х-сцепленного ихтиоза, буллезной ихтиозиформной эритродермии, дефицита незаменимых СЖК, возрастной сухости кожи и гипогидротической эктодермальной дисплазии.

60. Применение по п. 59, где кожным заболеванием является одно или более, выбранных из ксероза, псориаза, атопического дерматита и ихтиоза; например, ксероза, псориаза или ихтиоза.

61. Применение по любому из пп. 52-60, где ботулинический нейротоксин вводят в нелицевую область кожи пациента.

62. Применение по любому из пп. 52-61, где ботулинический нейротоксин вводят в руку(и) пациента, ногу, например, ноги, шею, кожу волосистой части головы и/или спину, например, верхнюю часть спины.

63. Применение по любому из пп. 52-62, где пациент не имеет жирной кожи до и/или после введения ботулинического нейротоксина.

64. Применение по любому из пп. 52-63, где пациент имеет кожное сало на уровне менее чем или равном 180 мг/см² кожи на лбу, носогубной борозде и/или носу.

65. Применение по любому из пп. 52-64, где после введения пациенту ботулинический нейротоксин вызывает удерживание тахикининового пептида в дерме кожи.

66. Применение по п. 65, где указанный тахикининовый пептид является веществом P, например, SEQ ID NO.: 17.

67. Применение по любому из пп. 52-66, где указанный ботулинический нейротоксин является нейротоксином BoNT/A.

68. Применение по любому из пп. 52-67, где указанный ботулинический нейротоксин является химерным нейротоксином.

69. Применение по п. 68, где химерный нейротоксин выбран из группы, состоящей из BoNT/DC и BoNT/X.

70. Применение по п. 68, где химерный нейротоксин включает домен LH_N из первого нейротоксина, ковалентно связанный с доменом H_C из второго нейротоксина, предпочтительно:

где указанный первый и второй нейротоксины являются разными,

где C-концевой аминокислотный остаток указанного домена LH_N соответствует первому аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном первом нейротоксине, и

где N-концевой аминокислотный остаток указанного домена H_C соответствует второму аминокислотному остатку спирали 3₁₀, разделяющей домены LH_N и H_C в указанном втором нейротоксине.

71. Применение по п. 70, где указанным первым нейротоксином является BoNT/A, и где указанным вторым нейротоксином является BoNT/B.

72. Применение по любому из пп. 52-71, где внутрикожное введение включает введение дозы ботулинического нейротоксина в пределах от приблизительно 0,00025 нг до 3 нг в участок введения.

73. Применение по любому из пп. 52-72, где внутрикожное введение включает внутрикожную инъекцию с использованием иглы калибра 30G, предпочтительно, где иглу калибра 30G вводят в дерму кожи под углом приблизительно 5°-15° относительно плоской поверхности кожи.

74. Применение по любому из пп. 52-73, где эпидермальный слой является одним или более, выбранными из базального слоя, шиповатого слоя, зернистого слоя или рогового слоя.

75. Применение по любому из пп. 52-74, где эпидермальный слой является роговым слоем.

название	год	авторы	номер документа
НЕ ТОКСИЧЕСКИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ КЛОСТРИДИАЛЬНОГО НЕЙРОТОКСИНА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ	2020	Фонфриа Сьюбирос, Элена Левандовска, Агнешка	RU2839368C1
ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНЫМ НЕЙРОТОКСИНАМ	2020	Ойлер, Джордж Э. Гертц, Барри	RU2824389C2
КЛЕТКИ, ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНОМУ НЕЙРОТОКСИНУ	2020	Ойлер, Джордж Э. Гертц, Барри	RU2831112C2
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ И КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕЙРОТОКСИНА БОТУЛИНА СЕРОТИПА E	2019	Пон, Лоран	RU2800604C2
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СПАСТИЧНОСТИ КОНЕЧНОСТЕЙ	2021	Григоре, Николае Раффл, Кэти Пико, Филипп	RU2841585C1
ГИБРИДНЫЕ НЕЙРОТОКСИНЫ	2017	Фонфриа Сьюбирос, Элена Берджин, Дэвид	RU2782382C2
НОВЫЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРЕМОРА	2020	Ксикос Янос Пульте Ирена Хирземенцель Райнхард Альтхаус Михель Наласковски Кристиане Симпсон Дэвид Джаббари Бахман Джог Мандар Ли Джек	RU2826569C2
СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН	2017	Дун, Минь Тао, Лян	RU2789302C2
СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ	2018	Руммель, Андреас	RU2719164C1
СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН	2016	Дун Минь Пэн Лишэн Тао Лян	RU2746736C2

HAN, S.B
et al
Protective Effect of Botulinum Toxin Type A Against Atopic Dermatitis-Like Skin Lesions in NC/Nga Mice
Dermatologic Surgery, 2017, 43, S312-S321
ШИРОКОПОЛОСНАЯ ПЛОСКАЯ АНТЕННА	2004	Руднев Евгений Анатольевич Хромых Евгений Алексеевич Чаплыгин Александр Александрович Шульженко Сергей Николаевич	RU2272340C1
BRENNAN C., Botulinum Toxin Type-A (BoNT-A) Injections of the Corrugator Muscles for Aesthetics and Depression? // Plast Surg Nurs
Токарный резец	1924	Г. Клопшток	SU2016A1

ЛЕЧЕНИЕ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2025 года по МПК A61K38/48 A61K8/64 A61K8/66 A61P17/00 A61Q19/08

Описание патента на изобретение RU2840027C1

Похожие патенты RU2840027C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 840 027 C1

Реферат патента 2025 года ЛЕЧЕНИЕ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Формула изобретения RU 2 840 027 C1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2025 года RU2840027C1

RU 2 840 027 C1