Настоящее изобретение относится к клостридиальным нейротоксинам и их терапевтическому и косметическому применению.
Бактерии рода Clostridia продуцируют сильнодействующие и специфические белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые они попадают. Примеры таких клостридиальных токсинов включают нейротоксины, продуцируемые C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипами A-G, и X (см. WO 2018/009903 A2), а также токсины, продуцируемые C. baratii и C. butyricum.
Среди клостридиальных нейротоксинов находятся одни из самых сильных известных токсинов. Например, нейротоксины ботулина имеют значения средней летальной дозы (LD50) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг в зависимости от серотипа. И столбнячный и ботулотоксины действуют, ингибируя функцию пораженных нейронов, в частности высвобождение нейромедиаторов. В то время как ботулотоксин действует на нервно-мышечные соединения и подавляет холинергическую передачу в периферической нервной системе, столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.
В природе клостридиальные нейротоксины синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который посттрансляционно модифицируется в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. Расщепление происходит в определенном сайте расщепления, часто называемом сайтом активации, который расположен между цистеиновыми остатками, которые обеспечивают межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит N-концевой компонент транслокации (HN домен) и C-концевой таргетирующий компонент (HC домен). Сайт расщепления расположен между L-цепью и компонентами домена транслокации. После связывания HC домена с его таргетным нейроном и интернализации связанного токсина в клетку через эндосому, HN домен транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль, и L-цепь выполняет функцию протеазы (также известной как не цитотоксическая протеаза).
Не цитотоксические протеазы действуют через протеолитическое расщепляющие внутриклеточные транспортные белки, известный как SNARE белки (например, SNAP-25, VAMP или Syntaxin) - см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE получен из термина Растворимый Рецептор Присоединения NSF, где NSF означает N-этилмалеимид-Чувствительнй Фактор. Белки SNARE являются неотъемлемой частью слияния внутриклеточных везикул и, следовательно, секреции молекул посредством транспорта везикул из клетки. Функция протеазы заключается в активности цинк-зависимой эндопептидазы и проявляет высокую субстратную специфичность для белков SNARE. Соответственно, после доставки в желаемую клетку-мишень, не цитотоксическая протеаза способна ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. L-цепные протеазы клостридиальных нейротоксинов представляют собой не цитотоксические протеазы, которые расщепляют белки SNARE.
Ботулинические нейротоксины хорошо известны своей способностью вызывать паралич вялых мышц. Указанные миорелаксирующие свойства приводят к использованию ботулинических нейротоксинов (таких как BoNT/A) в различных медицинских и косметических процедурах, включая лечение межбровных морщин или гиперкинетических мимических морщин, головной боли, гемифациального спазма, гиперактивности мочевого пузыря, гипергидроза, носогубных складок, цервикальной дистонии, блефароспазма и спастичности.
Однако BoNT/A ассоциируется с длительным эффектом (например, >6 месяцев), что невыгодно в определенных терапевтических или косметических ситуациях. Таким образом, остается потребность в альтернативном терапевтическом препарате, обладающем фармакодинамическими свойствами, отличными от BoNT/A.
Настоящее изобретение решает одну или несколько из вышеупомянутых проблем.
Авторы настоящего изобретения первыми определили фармакодинамические свойства BoNT/E (например, BoNT/E, лишенного каких-либо комплексообразующих белков, которые присутствуют в естественном BoNT/E) при введении человеку. Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что BoNT/E имеет фармакодинамические свойства, отличные от BoNT/A, включая короткое время для достижения максимального ингибирования высвобождения нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени и короткую продолжительность эффекта (например, <150 дней после введения).
Хотя BoNT/E был протестирован в системах in vitro и на моделях животных, не относящихся к человеку (например, на мышах), предыдущие исследования, проведенные с существующим в природе закомплексованным BoNT/E, не подходят для прогнозирования фармакодинамических свойств незакомплексованного (например, рекомбинантного) BoNT/E, поскольку известно, что эти разные формы BoNT ведут себя по-разному in vivo. Например, закомплексованные и незакомплексованные формы BoNT демонстрируют значительно отличающийся ответ клетки-хозяина в нервных клетках человека.
На основании открытий авторов настоящего изобретения можно определить подходящее клиническое применение BoNT/E для достижения терапевтического эффекта у человека.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение представляет ботулинический нейротоксин серотипа E (BoNT/E) для применения в лечении расстройства. Связанные с этим аспекты включают способ лечения расстройства и применение BoNT/E в производстве лекарственного средства для лечения расстройства, где BoNT/E вводят субъекту-человеку.
В одном аспекте представлен ботулинический нейротоксин серотипа E (BoNT/E) для применения в лечении расстройства, BoNT/E вводят субъекту-человеку, и представлено максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.
В другом аспекте представлен способ лечения расстройства, где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижается до >25% ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.
В другом аспекте представлен косметический способ, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.
В еще одном аспекте представлено применение BoNT/E в производстве лекарственного средства для лечения расстройства, где BoNT/E вводят субъекту-человеку и это дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.
BoNT/E предпочтительно имеет не закомплексованную форму (т.е. не содержит комплексообразующие белки, которые присутствуют в существующих в природе BoNT/E). Примеры таких комплексообразующих белков включают нейротоксин-ассоциированные белки (NAP) и не токсический не гемагглютининовый компонент (NTNH).
Одним из преимуществ BoNT/E в незакомплексованной форме является то, что общая масса белкового содержимого предоставляет самим нейротоксином (BoNT/E). Таким образом, введение, например, 5 нг BoNT/E в незакомплексованной форме обычно соответствует введению 5 нг BoNT/E нейротоксина. Наоборот, введение, например 5 нг BoNT/E в закомплексованной форме (предпочтительно, где общая масса белкового содержания определяется абсорбцией при A280, или, например, анализом Брэдфорда) будет включать комплексообразующие белки и даст пониженное (т.е. менее 5 нг) введение BoNT/E.
BoNT/E в не закомплексованной форме (как описано выше) обычно содержит менее 50 пикограммов (пг) комплексного белка на 100 нанограммов (нг) BoNT/E белка; например, менее 20 пг комплексного белка на 100 нг BoNT/E белка. В одном варианте осуществления, BoNT/E в не закомплексованной форме содержит менее 10 пг комплексного белка на 100 нг BoNT/E белка, например, менее 5 пг комплексного белка на 100 нг BoNT/E белка.
BoNT/E по настоящему изобретению предпочтительно является рекомбинантным BoNT/E (и поэтому не содержит комплексные белки).
Термин «лечить» или «лечение» в настоящем описании охватывает профилактическое лечение (например, для предотвращения начала заболевания), а также корректирующее лечение (лечение субъекта, уже страдающего заболеванием). Предпочтительно «лечить» или «лечение» в настоящем описании означает корректирующее лечение. Термин «лечить» или «лечение» включает лечение как заболевания, так и его симптома. В некоторых вариантах осуществления, «лечить» или «лечение» относится к симптому заболевания.
Поэтому BoNT/E может вводиться субъекту-человеку в терапевтически эффективном количестве или профилактически эффективном количестве.
«Терапевтически эффективным количеством» является любое количество BoNT/E, которое при введении отдельно или в комбинации субъекту-человеку для лечения заболевания (или его симптома) является достаточным для осуществления такого лечения заболевания или его симптома.
«Профилактически эффективным количеством» является любое количество BoNT/E, которое при введении отдельно или в комбинации субъекту-человеку ингибирует или задерживает начало или рецидив заболевания (или его симптома). В некоторых вариантах осуществления, профилактически эффективное количество полностью предотвращает начало или рецидив заболевания. «Ингибирование» начала означает либо уменьшение вероятности возникновения заболевания (или его симптомов), либо полное предотвращение начала.
Термин «ингибирование высвобождения нейромедиатора из ткани» может означать ингибирование высвобождения нейромедиатора из нерва в указанной ткани.
Настоящее изобретение дополнительно представляет косметический способ, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку.
BoNT/E может быть введен субъекту-человеку любым способом, подходящим для достижения желаемого терапевтического эффекта. В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят парентерально. Такое введение может осуществляться посредством локальной инъекции. В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят подкожной инъекцией, внутрикожной инъекцией и/или внутримышечной инъекцией. Предпочтительно, BoNT/E вводят внутримышечно, например, внутримышечной инъекцией.
Общая доза BoNT/E, вводимая субъекту-человеку, обычно составляет не менее 0,03 нг и обычно не более 50 нг. Например, в некоторых вариантах осуществления, общая вводимая доза BoNT/E составляет приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 нг.
Термин «общая доза» означает абсолютное количество (выраженное в граммах или нанограммах) BoNT/E, вводимое пациенту за схему лечения. Например, ссылка на общую дозу BoNT/E в 5 нг означает, что 5 нг BoNT/E вводят пациенту-человеку и завершают схему лечения для этого пациента.
Общая доза может быть введена посредством одной или нескольких стадий введения, составляющих часть одной и той же схемы лечения. Например, общая доза 5 нг может быть введена первым введением 2 нг BoNT/E и вторым введением 3 нг BoNT/E.
Предпочтительно, чтобы общая доза вводилась за одну стадию введения.
Общая доза введенного BoNT/E обычно составляет менее 50 нг, например, менее 40, 30, 20 или 10 нг.
Одно из преимуществ по настоящему изобретению состоит в том, что оно обеспечивает быстрое начало действия (например, ингибирование высвобождения нейромедиатора). Это очень желательно по многим клиническим и косметическим показаниям. Отдельное преимущество по настоящему изобретению состоит в том, что по существу предотвращается локальная диффузия BoNT/E в соседние мышцы (т.е. не наблюдается заметного эффекта).
Таким образом, согласно настоящему изобретению BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает, по меньшей мере, 15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 1 день или меньше, предпочтительно, менее чем за 15 часов, после введения. Например, BoNT/E вводят и он (например, в такой дозе) обеспечивает, по меньшей мере, 20% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 1 день или меньше, предпочтительно меньше чем через 15 часов после введения.
В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, или >80% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения. Например, BoNT/E предпочтительно вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения. BoNT/E может вводиться (например, в дозе, которая) обеспечивает >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14-49 день после введения.
В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-95% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13, ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8 или ≤7 дней после введения. Например, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13, ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8 или ≤7 дней после введения.
В одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-95% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤6 дней после введения. Например, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤6 дней после введения.
В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят субъекту-человеку (например, в дозе, которая) обеспечивает, по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения, предпочтительно, ≤6 дней. Например, BoNT/E вводят субъекту-человеку (например, в дозе, которая) обеспечивает, по меньшей мере, 50% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения, предпочтительно, ≤6 дней.
В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение 15 дней или менее, предпочтительно, в течение 10 дней или менее, более предпочтительно, в течение 7 дней или менее после введения.
Другим преимуществом по настоящему изобретению является то, что оно также обеспечивает быстрое отклонение (т.е. после максимального ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени) относительно действия BoNT/A. Это крайне желательно для многих клинических показаний.
Согласно настоящему изобретению, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 (предпочтительно, ≤12 или ≤10) дней после введения; и
снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >21 - <100 дней после введения.
Например, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >21 - <80 дней после введения.
В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >40 - <100 дней после введения.
Например, BoNT/E вводят субъекту-человеку (например, в дозе, которая) обеспечивает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 (предпочтительно, ≤12 или ≤10) дней после введения; и
снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >40 - <80 дней после введения.
Ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени (предпочтительно, из ткани-мишени) может оцениваться обычными методиками, известными специалисту в данной области техники. В одном варианте осуществления “% ингибирования секреции нейромедиатора” в настоящем документе соответствует % ингибирования мышечного потенциала действия (например, электрический вызванный ответ мышцы, CMAP). Ингибирование мышечного потенциала действия может быть оценено с применением стандартных методов. Например, потенциал действия стимулированной мышцы может быть измерен до и после введения BoNT/E с применением электродов для определения % ингибирования. Например, электроды могут применяться в электрофизиологических исследованиях для измерения потенциала действия (вызванного из-за секреции нейромедиатора) в ткани, и определения % ингибирования потенциала действия (соответствующего % ингибирования выделения нейромедиатора).
Таким образом, в одном варианте осуществления, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени измеряется с помощью электрофизиологии. Например, % ингибирования потенциала действия (измеренный электрофизиологией) может быть измерен, предоставляя значение % ингибирования секреции нейромедиатора.
Ключевым преимуществом использования электрофизиологии для измерения % ингибирования секреции нейромедиатора является то, что может быть использован стандартизированный подход с предоставлением объективных результатов. Это контрастирует с субъективными способами измерения % ингибирования секреции нейромедиатора, такими как определение % ингибирования на основе ручной/человеческой (например, практикующим врачом) оценки ответа на лечение, например ручной оценки уровня мышечной спастичности или морщин на лице, после лечения. Результаты таких субъективных способов часто отличаются высокой степенью изменчивости и, следовательно, не обладают точностью и надежностью объективных способов.
“% Ингибирования секреции нейромедиатора” может соответствовать % ингибирования, измеренному в поверхностной ткани, которая особенно доступна для электрофизиологических исследований, например, мышца короткий разгибатель пальца (EDB). Путем измерения % ингибирования секреции нейромедиатора в такой поверхностной ткани могут быть получены более точные/надежные показания (по сравнению с измерением в менее поверхностной ткани), которые могут быть успешно экстраполированы на % ингибирования секреции нейромедиатора в альтернативной ткани (таргетированной для терапевтических или косметических целей).
Оценка указанного «% ингибирования секреции нейромедиатора» продемонстрирована ссылкой на прилагаемые Примеры, Материалы и Методы, и может быть оценена с использованием методологии, описанной в настоящем документе (например, фармакодинамической модели, описанная в настоящем документе).
В одном варианте осуществления нейромедиатором является ацетилхолин.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что BoNT/E может вводиться (например, в дозе, которая) обеспечивает быстрое наступление ингибирования секреции нейромедиатора, и последующее постепенное (по существу линейное) восстановление секреции нейромедиатора (после максимального ингибировании). Такое постепенное восстановление предпочтительно может быть дозозависимым, и было продемонстрировано авторами настоящего изобретения для доз в интервале от 0,04 нг до приблизительно 4,0 нг.
Таким образом, настоящее изобретение преимущественно представляет общую дозу BoNT/E, которая обеспечивает прогнозируемое, по существу линейное снижение «% ингибирования секреции нейромедиатора» (после максимального ингибирования) у субъекта-человека, так что ответ субъекта на лечение может быть спрогнозирован вплоть до 100 дней после введения (см. фигуру 12). Например, если BoNT/E подавляет симптом расстройства, можно спрогнозировать, в какой момент времени симптом может начать повторяться, вместе с прогнозированием серьезности повторяющегося симптома в данный момент времени.
Таким образом, в одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе), обеспечивающей по существу линейное снижение «% ингибирования секреции нейромедиатора» после максимального ингибирования.
Термин “по существу линейное” означает, что профиль (график) значений “% ингибирования секреции нейромедиатора” может соответствовать линейной кривой (Microsoft Excel 2010, Microsoft Corporation), имеющей величину достоверности аппроксимации >0,8. В одном варианте осуществления, указанная величина достоверности аппроксимации составляет >0,85, >0,9 или >0,95. Предпочтительно, указанная величина достоверности аппроксимации может быть >0,9. Более предпочтительно, указанная величина достоверности аппроксимации может быть >0,95.
В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает по существу линейное снижение в “% ингибирование секреции нейромедиатора” после максимального ингибирования, где указанное по существу линейное снижение происходит в течение 10-56, 10-42 и/или 10-21 дней после введения.
Предпочтительно, Указанный профиль в течение 10-56, 10-42 и/или 10-21 дней после введения представляет “смещение” BoNT/E эффекта (ингибирование секреции нейромедиатора) после максимального ингибирования секреции нейромедиатора.
В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13, ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8, ≤7 или ≤6 дней (предпочтительно, ≤6 дней) после введения, и последующее снижение % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 1-10% в день.
Указанное максимальное ингибирование (% ингибирования секреции нейромедиатора) может составлять ≥40%, ≥60%, ≥75% или ≥80% (например, ≥85%). Предпочтительно, указанное максимальное ингибирование составляет >80%.
В одном варианте осуществления, указанное максимальное ингибирование (% ингибирования секреции нейромедиатора) составляет ≥95%.
% Ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени обычно снижается на примерно 2-10% в день после максимального ингибирования.
Например, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 1-4%, примерно 4-6%, примерно6-8% или примерно 8-10% в день в течение каждого дня после максимального ингибирования. Предпочтительно, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 1-4% в течение каждого дня после максимального ингибирования
% Ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени обычно снижается на примерно 1-4% каждый день от дня 10-21, от дня 6-42, от дня 10-42, от дня 10-49 и/или от дня 10-56 после введения.
Для удобства, снижение % ингибирования секреции нейромедиатора может быть рассчитано как среднее снижение в рассматриваемый период времени, например от дня 10-24, от дня 6-42, от дня 10-42, от дня 10-49 и/или от дня 10-56 после введения.
% Ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени может снижаться на примерно 1-30% в неделю в течение каждой недели после максимального ингибирования. Например, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 1-28%, 2-28%, примерно 2-22%, примерно 4-16%, примерно 9-18%, примерно 14-16% или примерно 9-12% в неделю в течение каждой недели после максимального ингибирования.
В одном варианте осуществления, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 9-17% каждую неделю от недели 1-3, недели 1-6 и/или от недели 2-6 после введения.
Для удобства, снижение % ингибирования секреции нейромедиатора может быть рассчитано как среднее снижение в рассматриваемый период времени, например от недели 1-6, от недели 2-6, и/или недели 1-3 после введения.
Указанное максимальное ингибирование (% ингибирования секреции нейромедиатора) может составлять ≥40%, ≥60%, ≥75% или ≥80% (например, ≥85%). Предпочтительно, указанное максимальное ингибирование составляет >80%.
В одном варианте осуществления, указанное максимальное ингибирование (% ингибирование секреции нейромедиатора) составляет ≥95%.
% Ингибирования секреции нейромедиатора может иметь плато после указанного по существу линейного снижения “% ингибирования секреции нейромедиатора”.
В одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает от примерно 10%-40% (предпочтительно, примерно 15%-40%) ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >49 до <100 дней, или от >49 до <90 дней после введения. В одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает от примерно 10%-40% (предпочтительно, примерно 15%-40%) ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >42 до <100 дней, или от >42 до <90 дней после введения.
При применении, общая вводимая доза BoNT/E составляет обычно менее 10 нг, например, в диапазоне от 0,04 до 5 нг. В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,5-5 нг (например, 0,9 нг или 3,6 нг). В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,1-0,5 нг (например, 0,2 нг). В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 1-5 нг (например, 3,6 нг). В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,5-2 нг (например, 0,9 нг).
В одном варианте осуществления BoNT/E вводят в дозе 0,5-5 нг (например, 0,9 нг или 3,6 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 85% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 7 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 80% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 14 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 70% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 21 день после введения; и/или
по меньшей мере, 50% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 28 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 35 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 30% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 42 дня после введения; и/или
по меньшей мере, 25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 49 дней после введения.
Например, BoNT/E вводят в дозе 0,5-5 нг (например, 0,9 нг или 3,6 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 56 дней после введения; и/или
≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 63 дня после введения.
В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,1 -0,5 нг (например, 0,2 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 65% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 7 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 65% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 14 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 50% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 21 день после введения; и/или
по меньшей мере, 30% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 28 дней после введения; и/или
по меньшей мере, 30% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 35 дней после введения; и/или
≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 42 дня после введения.
В одном варианте осуществления BoNT/E вводят в дозе 1-5 нг (например, 3,6 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 85% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от примерно >3 до ≤13 дней после введения; и/или
примерно 80%-90% (предпочтительно, примерно 84%-86%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или
примерно 70%-80% (предпочтительно, примерно 74%-76%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или
примерно 55%-65% (предпочтительно, примерно 60%-64%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или
примерно 50%-60% (предпочтительно, примерно 54%-56%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >27 до <29 дней после введения; и/или
примерно 35%-45% (предпочтительно, примерно 43%-44%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >34 до <36 дней после введения; и/или
примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 34%-36%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >41 до <43 дней после введения; и/или
примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 29%-31%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >48 до <50 дней после введения; и/или
примерно 10%-20% (предпочтительно, примерно 15%-17%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >55 до <57 дней после введения; и/или
примерно 7%-17% (предпочтительно, примерно 13%-15%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >62 до <64 дней после введения; и/или
≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >75 дней после введения.
В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,5-2 нг (например, 0,9 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 85% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >3 до ≤13 дней после введения; и/или
примерно 70%-80% (предпочтительно, примерно 77%-79%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или
примерно 65%-75% (предпочтительно, примерно 71%-73%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или
примерно 60%-70% (предпочтительно, примерно 65%-67%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или
примерно 55%-65% (предпочтительно, примерно 58%-60%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >27 до <29 дней после введения; и/или
примерно 45%-55% (предпочтительно, примерно 50%-52%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >34 до <36 дней после введения; и/или
примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 34%-37%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >41 до <43 дней после введения; и/или
примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 33%-35% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >48 до <50 дней после введения; и/или
примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 35%-37%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >55 до <57 дней после введения; и/или
примерно 20%-30% (предпочтительно, примерно 22%-27%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >62 до <64 дней после введения; и/или
≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >75 дней (например, >85 дней) после введения.
В одном варианте осуществления BoNT/E вводят в дозе 0,1-0,5 нг (например, 0,2 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 70% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >3 до ≤13 дней после введения; и/или
примерно 47%-57% (предпочтительно, примерно 52-54%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или
примерно 45%-55% (предпочтительно, примерно 50%-52%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или
примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 29%-31%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или
примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 31%-33%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >27 до <29 дней после введения; и/или
примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 30%-33%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >34 до <36 дней после введения; и/или
примерно 1%-10% (предпочтительно, примерно 4%-6%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >41 до <43 дней после введения; и/или
≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >48 дней после введения.
В некоторых вариантах осуществления, предпочтительно, чтобы общая введенная доза BoNT/E составляла <0,2 нг, например 0,04-0,15 нг (или 0,01-0,04 нг). Преимущественно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение меньших доз BoNT/E (<0,2 нг) дает, по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени. Такие меньшие дозы связаны с хорошим максимальным ингибированием секреции нейромедиатора (например, по меньшей мере, 40% или 50% ингибированием), намного более короткой длительностью эффекта и/или связаны с подобным временем до максимального эффекта. Этот последний момент является неожиданным и прямо контрастирует с BoNT, содержащими комплексные белки (например, BoNT/A, содержащими комплексные белки), в которых время до достижения максимального ингибирования намного короче при введении более высокой дозы (например, дозы ≥0,2 нг). Например, авторы данного изобретения обнаружили, что всего лишь 0,04 нг (40 пг) BoNT-E (например, рекомбинантного BoNT-E) обеспечивает ту же амплитуду эффекта (в течение дней 1-7 после введения) в дозах 20 Ед BoNT-A (Dysport®) - см. Пример 4. А именно, 20 Ед Dysport=108 пг нейротоксина (5,35-5,38 пг нейротоксина/Ед, обычно, 5,35 пг нейротоксина/Ед). Это особенно удивительно для авторов настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,04-0,15 нг (например, 0,04 нг), которая обеспечивает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >3 до ≤13 дней после введения; и/или
примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 33-35%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или
примерно 7%-17% (предпочтительно, примерно 12%-14%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или
примерно 15%-25% (предпочтительно, примерно 21%-23%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или
≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >48 дней после введения.
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является мышца. Примеры таких мышц включают затылочно-лобную, носовую, круговую мышцу рта, угловую мышцу, подкожную мышцу шеи, грудинно-подъязычную, переднюю зубчатую мышцу, прямую мышцу живота, внешнюю косую мышцу, растяжение широкой фасции, плечевые лучи, подвздошную мышцу, большую поясничную мышцу, грудную мышцу, длинную мышцу, приводящую мышцу, тонкую мышцу, широкую латеральную мышцу бедра, прямую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, сухожилие четырехглавой мышцы бедра, коленную чашечку, икроножную мышцу, камбаловидную мышцу, большеберцовую кость, длинную малоберцовую мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, связку надколенника, подвздошно-большеберцовый тракт, мышцы возвышения мизинца, мышцы возвышения большого пальца кисти, локтевые сгибатели, сгибатель пальцев кисти поверхностный, длинную ладонную мышцу, лучевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, плечевую мышцу, двуглавую мышцу плеча, трицепс плеча, большую грудную мышцу, дельтовидную мышцу, трапецию, грудинно-ключично-сосцевидную мышцу, жевательную мышцу, круговую мышцу глаза, височную мышцу, сухожильный шлем, большую круглую мышцу, разгибатель пальцев, разгибатель запястья, локтевую мышцу, длинный разгибатель большого пальца, подошвенную мышцу, сухожилие пяточной кости, камбаловидную мышцу, большую приводящую мышцу, большую ягодичную мышцу, среднюю ягодичную мышцу, широчайшую мышцу спины.
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько тканей, выбранных из сморщивателя брови, разгибателя плеча, двуглавой мышцы плеча, плечевой мышцы и/или плечелучевой мышцы, разгибателя пальцев или их комбинации.
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из лучевого сгибателя запястья, локтевого сгибателя запястья, глубокого сгибателя пальцев, поверхностного сгибателя пальцев, длинного сгибателя большого пальца руки, большой приводящей мышцы, плечевой мышцы, плечелучевой мышцы, двуглавой мышцы плеча, круглого пронатора, трехглавой мышцы плеча, большой грудной мышцы, подлопаточной мышцы, широчайшей мышцы спины или их комбинации (предпочтительно, если BoNT/E предназначен для лечения спастичности верхних конечностей).
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из лучевого сгибателя запястья, локтевого сгибателя запястья или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из сгибателя пальцев кисти глубокого, сгибателя пальцев кисти поверхностного, длинного сгибателя большого пальца кисти, длинной мышцы, приводящей большой палец кисти, или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из плечевой мышцы, плечелучевой мышцы, двуглавой мышцы плеча, круглого пронатора или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из трехглавой мышцы плеча, большой грудной мышцы, подлопаточной мышцы, широчайшей мышцы спины или их комбинации.
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из камбаловидной мышцы, икроножной мышцы (например, медиальной головки или боковой головки), задней большеберцовой мышцы, длинного сгибателя пальцев, короткого сгибателя пальцев, длинного сгибателя большого пальца, короткого сгибателя большого пальца или их комбинации (например, если BoNT/E предназначен для лечения спастичности нижних конечностей).
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является камбаловидная мышца. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является икроножная мышца (например, медиальная головка или боковая головка). В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является задняя большеберцовая мышца, длинный сгибатель пальцев, короткий сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца, короткий сгибатель большого пальца или их комбинации.
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, мышцы гордецов, круговой мышцы глаз, лобной мышцы или их комбинации (предпочтительно, если BoNT/E предназначен для применения в лечении морщин в верхней части лица).
В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является сморщиватель брови, и одна или несколько, выбранных из мышцы гордецов, круговой мышцы глаз, лобной мышцы или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является мышца гордецов, и одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, круговой мышцы глаз, лобной мышцы или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является круговая мышца глаз, и одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, мышцы гордецов, лобной мышцы или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является лобная мышца, и одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, мышцы гордецов, круговой мышцы глаз или их комбинации.
В одном варианте осуществления клеткой-мишенью является двигательный нейрон или рецепторный нейрон. Предпочтительно, клеткой-мишенью является двигательный нейрон.
Клеткой-мишенью (используется здесь как синоним термина «нерв») может быть подмышечный нерв, диафрагмальный нерв, спинномозговой ганглий, нерв спинного мозга, цепь симпатических ганглиев, срамной нерв, общий ладонный пальцевый нерв, локтевой нерв, глубокой ветвью локтевого нерва, седалищный нерв, малоберцовый нерв, большеберцовый нерв, подкожный нерв, межкостный нерв, поверхностный малоберцовый нерв, промежуточный дорсальный кожный нерв, медиальный подошвенный нерв, медиальный дорсальный кожный нерв, глубокий малоберцовый нерв, мышечные ветви большеберцового нерва, поднаколенниковая ветвь подкожного нерва, общий малоберцовый нерв, мышечная ветвь бедренного нерва, передние кожные ветви бедренного нерва, мышечные ветви седалищного нерва, бедренный нерв, подвздошно-паховый нерв, нерв терминальной нити, подвздошно-подчревный нерв, запирательный нерв, лучевой нерв, подреберный нерв, межреберный нерв, дорсальная ветвь межреберного нерва, медиальная кожная ветвь межреберного нерва, мышечный нерв, дельтовидный нерв, блуждающий нерв, нерв плечевого сплетения, надключичный нерв, лицевой нерв, ушно-височный нерв или их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления, клеткой-мишенью является малоберцовый нерв.
BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей (или состоящей из) SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей (или состоящей из) последовательности, которая кодон-оптимизирована для экспрессии в гетерологичной системе экспрессии (например, SEQ ID NO: 1), такой как клетка-хозяин E. coli.
BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении содержит (или состоит из) полипептидной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении содержит (или состоит из) полипептидной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 2.
BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2, при условии, что полипептидная последовательность включает одну или несколько (например, одну или несколько, две или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько, семь или несколько или восемь; предпочтительно, все восемь) из следующих аминокислот (где нумерация аминокислотных положений начинается с N-концевого метионинового аминокислотного остатка и заканчивается C-концевым аминокислотным остатком белка BoNT/E):
глицин в положении 177; серин в положении 198; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; аспарагин в положении 1195.
В одном варианте осуществления, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2, при условии, что полипептидная последовательность включает одну или несколько (например, одну или несколько, две или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько, семь или несколько или восемь; предпочтительно, все восемь) из следующих аминокислот (где нумерация аминокислотных положений начинается с N-концевого метионинового аминокислотного остатка и заканчивается C-концевым аминокислотным остатком белка BoNT/E):
глицин в положении 177; серин в положении 198; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; аспарагин в положении 1195.
Указанные аминокислоты могут быть замещениями (например, мутациями) относительно полипептидной последовательности BoNT/E дикого типа (такой как SEQ ID NO.: 3). Например:
глицин в положении 177 может быть замещение аргинина на глицин (R177G);
серин в положении 198 может быть C198S замещением;
аланин в положении 340 может быть R340A замещением;
лейцин в положении 773 может быть I173L замещением;
лейцин в положении 963 может быть F963L замещением;
глутамин в положении 964 может быть E964Q замещением;
аланин в положении 967 может быть R967A замещением; и/или
аспарагин в положении 1195 может быть вставкой (например, вставкой между G1194 и N1195 последовательности BoNT/E дикого типа, такой как полипептидная последовательность SEQ ID NO. 3).
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глицин в положении 177; серин в положении 198; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; и аспарагин в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глицин в положении 177; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; и аспарагин в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глицин в положении 177, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) серин в положении 198, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; и аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) аланин в положении 340, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) лейцин в положении 773, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) лейцин в положении 963, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глутамин в положении 964, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) аланин в положении 967, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аспарагина в положении 1195.
В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) аспарагин в положении 1195, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967.
В одном варианте осуществления, присутствие указанных одной или нескольких аминокислот, как описано выше, дает BoNT/E белок, имеющий улучшенную растворимость по сравнению с BoNT/E белком, не имеющим указанные аминокислоты. Указанная улучшенная растворимость повышает выход белка в гетерологичных системах экспрессии, таких как система экспрессии E. coli.
В одном варианте осуществления, присутствие указанных одной или нескольких аминокислот, как описано выше, дает BoNT/E белок, имеющий улучшенную эффективность по сравнению с BoNT/E белком, не имеющим указанные аминокислоты. Указанная улучшенная эффективность может, предпочтительно, улучшить in vivo эффективность (более предпочтительно, улучшить in vivo эффективность у субъекта-человека).
В одном варианте осуществления BoNT/E является таким, как описан в (или кодирован нуклеотидной последовательностью, описанной в) WO 2014/068317 A1, который включен в настоящий документ в качестве ссылки.
BoNT/E образуется из двух полипептидных цепей, тяжелой цепи (H-цепи), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепи (L-цепи), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит C-концевой таргетный компонент (рецептор-связывающий домен или HC домен) и N-концевой компонент транслокации (HN домен). BoNT/E, который содержит и H-цепь (HC домен и HN домен) и L-цепь называют в настоящем документе голотоксин.
В одном варианте осуществления, BoNT/E для применения в настоящем изобретении является голотоксин.
Типовая эталонная последовательность L-цепи включает аминокислотные остатки 1-422 из BoNT/E. Однако эта эталонная последовательность должна считаться направляющей, поскольку незначительные вариации могут возникать согласно суб-серотипам. В качестве примера, в US 2007/0166332 (включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью) указана слегка отличающаяся последовательность аминокислотных остатков M1-R422 для L-цепи BoNT/E.
Примеры эталонной последовательности для HC домена BoNT/E включают аминокислотные остатки R846-K1252.
L-цепь BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть следующей (SEQ ID NO.: 4):
H-цепь BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть следующей (SEQ ID NO.: 5):
HC домен BoNT/E содержит два отдельных структурных признака, которые названы HCC и HCN домены. Полагают, что аминокислотные остатки, вовлеченные в связывание рецептора, преимущественно расположены в HCC домене. Пример эталонной последовательности HCN домена BoNT/E включает аминокислотные остатки 846-1085.
Вышеуказанные положения последовательности могут незначительно варьироваться в соответствии с подтипом, и дополнительные примеры подходящих (эталонных) HCN доменов BoNT/E включают аминокислотные остатки 848-1085.
BoNT/E может быть продуцирован C. botulinum или C. butyricum, предпочтительно, C. botulinum. В одном варианте осуществления, BoNT/E продуцируется в не клостридийной клетке. Альтернативно (предпочтительно), BoNT/E может продуцироваться в рекомбинантной форме (например, в Escherichia coli). Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E для применения по изобретению продуцируется в гетерологичной системе экспрессии, такой как E. coli. В одном варианте осуществления, клеткой E. coli является E. coli BLR (DE3).
Более подробно BoNT/E, продуцированный в гетерологичной системе экспрессии (такой как E. coli), описан в WO 2014/068317 A1, который включен в настоящий документ в качестве ссылки.
Композиция BoNT/E по настоящему изобретению, предпочтительно, по существу не содержит трипсинпротеазу (применяемую для активации одноцепочечного полипептида), таким образом, предотвращая нежелательное неспецифическое расщепление BoNT/E белка.
Композиция BoNT/E по настоящему изобретению такова, что содержание белка в композиции обеспечивается фактическим нейротоксином (BoNT/E). Таким образом, введение, скажем, 4 нг композиции BoNT/E соответствует введению 4 нг нейротоксина BoNT/E.
В одном варианте осуществления, где композиция BoNT/E (как описано выше) по существу не содержит трипсин, композиция содержит менее 100 пикограммов (пг) трипсина на 100 нанограммов (нг) белка BoNT/E; например, менее 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E. В одном варианте осуществления, композиция (как описана выше) содержит менее 10 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E, или менее 7 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E, или менее 5 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E. В предпочтительном варианте осуществления, композиция (как описана выше) содержит менее 10 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E, или менее 7 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E.
Таким образом, в одном варианте осуществления, фраза “по существу не содержит трипсин” означает менее 100 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка; например, менее 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка, предпочтительно, менее 10 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка или менее 7 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка.
Способы определения концентрации трипсина в композиции известны в данной области техники (например, описаны в WO 2014/068317). В качестве примера, концентрация трипсина в композиции по изобретению может быть определена с использованием сэндвич-ELISA (иммуноферментного анализа).
Известно, что BoNT/E расщепляет синаптосомально-ассоциированный белок 25 кДа (SNAP-25).
В некоторых вариантах осуществления BoNT/E может быть модифицирован BoNT/E или его производным, включая, но не ограничиваясь ими, такие, которые описаны ниже. Модифицированный BoNT/E или производное могут содержать одну или несколько аминокислот, которые были модифицированы по сравнению с нативной (не модифицированной) формой BoNT/E, или может содержать одну или несколько вставленных аминокислот, которые не присутствуют в нативной (не модифицированной) форме BoNT/E. В качестве примера, модифицированный BoNT/E может иметь модифицированные аминокислотные последовательности в одном или нескольких доменах относительно нативной (не модифицированной) последовательности BoNT/E. Такие модификации могут модифицировать функциональные аспекты BoNT/E, например, биологическую активность или жизнестойкость. Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E является модифицированный BoNT/E или производное BoNT/E.
Модифицированный BoNT/E может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (такой как модифицированный HC домен), где указанная модифицированная тяжелая цепь связывается с нервными клетками-мишенями с более высокой или низкой аффинностью, чем нативный (не модифицированный) BoNT/E. Такие модификации в HC домене могут включать модифицирующие остатки в сайте связывания ганглиозида HC домена или в сайте связывания белка (SV2 или синаптотагмина), которые изменяют связывание с рецептором ганглиозида и/или рецептором белка нервной клетки-мишени. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2006/027207 и WO 2006/114308, оба которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью.
Модифицированный BoNT/E может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности легкой цепи, например модификации в связывании субстрата или каталитическом домене, которые могут изменять или модифицировать специфичность белка SNARE модифицированной L-цепи. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2010/120766 и US 2011/0318385, оба которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью.
Модифицированный BoNT/E может содержать одну или несколько модификаций, которые повышают или снижают биологическую активность и/или биологическую жизнестойкость модифицированного BoNT/E. Например, модифицированный BoNT/E может содержать мотив на основе лейцина или тирозина, где указанный мотив повышает или снижает биологическую активность и/или биологическую жизнестойкость модифицированного BoNT/E. Подходящие мотивы на основе лейцина включают xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL и xExxxLM (где x является любой аминокислотой). Подходящие мотивы на основе тирозина включают Y-x-x-Hy (где Hy является гидрофобной аминокислотой). Примеры модифицированных клостридиальных нейротоксинов, включающих мотивы на основе лейцина или тирозина, описаны в WO 2002/08268, который включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью.
Термин “BoNT/E” в одном варианте осуществления охватывает гибридный и химерный BoNT/E. Гибридный BoNT/E содержит, по меньшей мере, часть легкой цепи из одного клостридиального нейротоксина или его подтипа, и, по меньшей мере, часть тяжелой цепи из другого клостридиального нейротоксина или подтипа клостридиального нейротоксина, где, по меньшей мере, один из подтипов является подтипом BoNT/E. В одном варианте осуществления, гибридный BoNT/E может содержать всю легкую цепь легкой цепи из одного подтипа клостридиального нейротоксина, и тяжелую цепь из другого подтипа клостридиального нейротоксина, где, по меньшей мере, одним из подтипов является подтип BoNT/E. В другом варианте осуществления, химерный клостридиальный нейротоксин может содержать часть (например, связывающий домен) тяжелой цепи одного подтипа клостридиального нейротоксина, и другую часть тяжелой цепи из другого подтипа клостридиального нейротоксина, где, по меньшей мере, одним из подтипов является подтип BoNT/E. Аналогично или альтернативно, терапевтический элемент может содержать части легкой цепи из разных подтипов BoNT/E. Такие гибридные или химерные BoNT/E полипептиды применяют, например, в качестве средства доставки их терапевтического преимущества пациентам, которые иммунологически резистентны к данному подтипу клостридиального нейротоксина, пациентам, которые могут иметь концентрацию рецепторов данного связывающего домена тяжелой цепи клостридиального нейротоксина меньше средней, или пациентам, которые могут иметь резистентный к протеазе вариант мембранного или везикулярного субстрата токсина (например, SNAP-25, VAMP и синтаксина). Гибридные и химерные клостридиальные нейротоксины описаны в US 8,071,110, публикация которого включена в настоящий документ в качестве ссылки полностью. Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E по изобретению является гибридным BoNT/E или химерным BoNT/E.
Настоящее изобретение также охватывает BoNT/E, имеющий не нативный сайт расщепления протеазой. В таких BoNT/E полипептидах, нативный сайт расщепления протеазой (также известный как сайт активации, как описано выше) модифицирован или замещен сайтом расщепления протеазой, которые не является нативным для BoNT/E (т.е. экзогенным сайтом расщепления). Такой сайт потребует экзогенную протеазу для расщепления, что позволяет улучшить контроль времени и расположения событий расщепления. Не нативные сайты расщепления протеазой, которые могут применяться в BoNT/E, включают:
Дополнительные сайты расщепления протеазой включают последовательности распознавания, которые расщепляются не цитотоксической протеазой, например легкой цепью клостридиального нейротоксина. Они включают последовательности распознавания белка SNARE (например, SNAP-25, синтаксина, VAMP), которые расщепляются не цитотоксическими протеазами, такими как легкая цепь клостридиального нейротоксина. Клостридиальные нейротоксины, содержащие не нативные сайты расщепления протеазой, описаны в US 7,132,259, EP 1206554-B2 и US 2007/0166332, все которые включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью. Также термин сайт расщепления протеазой включает интеин, который является саморасщепляющейся последовательностью. Реакция самосплайсинга является контролируемой, например, через изменение концентрации присутствующего восстанавливающего агента.
Настоящее изобретение также охватывает BoNT/E, содержащий “деструктивный сайт расщепления”. В указанных BoNT/E полипептидах, не нативный сайт расщепления протеазой включен в BoNT/E в месте, выбранном так, что расщепления на указанном сайте будет снижать активность, или инактивировать, BoNT/E. Деструктивный сайт расщепления протеазой может быть подвержен расщеплению локальной протеазой, в случае, если BoNT/E, после введения, мигрирует в не целевую локацию. Подходящие не нативные сайты расщепления протеазой включают такие, которые описаны выше. Клостридиальные нейротоксины, содержащие деструктивный сайт расщепления, описаны в WO 2010/094905 и WO 2002/044199, оба которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью.
В одном варианте осуществления, BoNT/E содержит нативный сайт расщепления.
В одном варианте осуществления, BoNT/E не содержит E3 мотив распознавания лигазы.
BoNT/E, особенно его компонент легкой цепи, может быть ПЭГилирован - это может помочь повысить стабильность, например, длительность действия компонента легкой цепи. ПЭГилирование, предпочтительно, включает добавление ПЭГ к N-концу компонента легкой цепи. В качестве примера, N-конец легкой цепи может быть продлен одним или несколькими аминокислотными (например, цистеиновым) остатками, которые могут быть одинаковыми или разными. Один или несколько из указанных аминокислотных остатков могут иметь свои собственные молекулы ПЭГ (например, ковалентно присоединенные), присоединенные к нему. Пример этой технологии описан в WO2007/104567, который включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью.
BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть получен с применением технологий рекомбинантной нуклеиновой кислоты.
BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть получен способом, включающим экспрессирование нуклеиновой кислоты, кодирующей BoNT/E, в подходящей клетке-хозяине, лизирование клетки-хозяина с получением гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный BoNT/E, и выделение одноцепочечного BoNT/E. Перед применением в настоящем изобретении, одноцепочечный BoNT/E, предпочтительно, протеолитически перерабатывают в соответствующий активный двухцепочечный BoNT/E посредством контакта одноцепочечного BoNT/E с протеазой, которая гидролизует пептидную связь в петле активации BoNT/E с получением двухцепочечного BoNT/E (например, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены вместе дисульфидной связью).
Предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет гетерологичную (например, не-клостридиальную) систему экспрессии. Предпочтительно, клеткой-хозяином является E. coli.
BoNT/E для применения в настоящем изобретении, предпочтительно, имеет двухцепочечную форму.
BoNT/E может применяться в настоящем изобретении как часть фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать BoNT/E и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль. Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E может быть введен в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом, адъювантом и/или солью.
BoNT/E может быть составлен для парентерального, непрерывного вливания или местного применения. В одном варианте осуществления, BoNT/E составлен для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, внутрикожная инъекция и/или внутримышечная инъекция. Предпочтительно, BoNT/E составлен для парентерального введения, например, более предпочтительно, для внутримышечного введения (например, инъекцией).
Композиции, подходящие для инъекций, могут быть в форме растворов, суспензий или эмульсий, или сухих порошков, которые растворяют или суспендируют в подходящем носителе перед применением.
В случае, когда BoNT/E предназначен для местной доставки, BoNT/E может быть составлен в виде крема (например, для местного применения) или для подкожной инъекции.
Средства местной доставки могут включать аэрозоль или другой спей (например, небулайзер).
Жидкие дозированные формы обычно готовят с использованием BoNT/E и апирогенного стерильного носителя. BoNT/E, в зависимости от используемого носителя и концентрации, может быть растворен или суспендирован в носителе. При приготовлении растворов, BoNT/E можно растворять в носителе, при необходимости раствор делают изотоническим путем добавления хлорида натрия и стерилизуют фильтрованием через стерильный фильтр с использованием асептических методов перед заполнением подходящих стерильных флаконов или ампул и запечатыванием. Альтернативно, если стабильность раствора является достаточной, раствор в герметичных контейнерах можно стерилизовать в автоклаве. Преимущественно, добавки, такие как буферные, солюбилизирующие, стабилизирующие, консервирующие или бактерицидные, суспендирующие или эмульгирующие агенты и/или местные анестетики, могут быть растворены в носителе.
Сухие порошки, которые растворяют или суспендируют в подходящем носителе перед использованием, могут быть приготовлены заполнением предварительно стерилизованных ингредиентов в стерильном контейнере с использованием асептической методики в стерильной зоне. Альтернативно, ингредиенты могут быть растворены в подходящих контейнерах с использованием асептических методик в стерильной зоне. Затем продукт сушат вымораживанием, и контейнеры асептически герметично закрывают.
Парентеральные суспензии, подходящие для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции, готовят по существу таким же образом, за исключением того, что стерильные компоненты суспендируют в стерильном носителе, а не растворяют, и стерилизация не может быть выполнена фильтрацией. Компоненты могут быть выделены в стерильном состоянии или, альтернативно, они могут быть стерилизованы после выделения, например, гамма-облучением.
Преимущественно суспендирующий агент, например поливинилпирролидон, включают в композицию(и) для облегчения равномерного распределения компонентов.
Введение в соответствии с настоящим изобретением может давать преимущества множества технологий доставки, включая инкапсулирование микрочастиц, вирусные системы доставки или аэрозольную бомбардировку под высоким давлением. BoNT/E может быть введен пациенту интратекальной или эпидуральной инъекцией в позвоночный столб на уровне спинного сегмента, участвующего в иннервации пораженного органа.
Диапазоны доз для введения BoNT/E таковы, что они обеспечивают желаемый терапевтический эффект (например, описанный выше). Дозировки также могут быть основаны на единицах CBA, как описано в примерах.
В одном варианте осуществления расстройством по настоящему изобретению является одно или несколько из: состояния, связанного с косоглазием, блефароспазма, косоглазия, дистонии (например, спазматической дистонии, оромандибулярной дистонии, очаговой дистонии, поздней дистонии, дистонии мышц гортани, дистонии конечностей, шейной дистонии), кривошеи (например, спастической кривошеи), косметологического (косметического) применения, где полезно временное поражение клеток/мышц (через подавление или инактивацию SNARE), нервно-мышечного расстройства или состояния подвижности глаз (например, сопутствующего косоглазия, вертикального косоглазия, паралича наружной прямой мышцы, нистагма, дистироидной миопатии), писчего спазма, блефароспазма, бруксизма, болезни Вильсона, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности из-за хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушению контроля над мочевым пузырем, анимуса, спазма спины, ушиба или разрыва мышц, головных болей напряжения, синдрома подъемника таза, расщелины позвоночника, поздней дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, очаговой спастичности, спазматического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей (например, спастичности нижних конечностей или спастичности верхних конечностей), тиков, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерной секреции желудочно-кишечного тракта, мышечной боли (например, боли при мышечных спазмах), головной боли (например, головной боли напряжения), межбровных складок, морщин кожи (например, морщин в верхней части лица, таких как глабеллярные морщины, морщины в углах глаз и/или лобные морщины), рака, расстройств матки, мочеполовых расстройств, урогенитально-неврологических расстройств, хронического нейрогенного воспаления и расстройства гладкой мускулатуры.
В одном варианте осуществления, расстройством является спастичность нижних конечностей. Предпочтительно, спастичностью нижних конечностей страдает субъект в возрасте старше 18 лет.
В одном варианте осуществления, расстройством является спастичность верхних конечностей. Предпочтительно, спастичностью верхних конечностей страдает субъект в возрасте старше 18 лет.
Настоящее изобретение также включает косметический способ с применением BoNT/E. Например, косметический способ может быть предназначен для лечения морщин в верхней части лица (таких как глабеллярные морщины, морщины в углах глаз и лобные морщины).
В одном варианте осуществления, косметический способ предназначен для лечения глабеллярных морщин, и одной или нескольких, выбранных из морщин в углах глаз и лобных морщин. В одном варианте осуществления, косметический способ предназначен для лечения морщин в углах глаз, и одной или нескольких, выбранных из глабеллярных морщин и лобных морщин. В одном варианте осуществления, косметический способ предназначен для лечения лобных морщин, и одной или нескольких, выбранных из глабеллярных морщин и морщин в углах глаз.
Косметический способ по изобретению может включать введение (эффективного количества) BoNT/E для лечения глабеллярных морщин, морщин в углах глаз и/или лобных морщин, при этом BoNT/E вводят в участок для лечения указанных глабеллярных морщин, морщин в углах глаз и/или лобных морщин одновременно или последовательно, так что лечатся (предпочтительно, одновременно лечатся) каждая из указанных глабеллярных морщин, морщин в углах глаз и/или лобных морщин.
Предпочтительно, косметический способ предназначен для лечения глабеллярных морщин. Глабеллярные морщины могут быть умеренные или тяжелые (например, по мнению врача).
Варианты осуществления, связанные с применением BoNT/E, предназначены для равного применения к способам лечения и косметологии, описанных здесь, и наоборот.
В одном варианте осуществления, субъектом-человеком является мужчина.
ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Для определения доли идентичности может применяться любой из множества способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничения, глобальные способы, локальные способы и гибридные способы, такие как, например, способы сегментного подхода. Протоколы для определения доли идентичности являются обычными процедурами в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Глобальные способы выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание, складывая оценки отдельных пар остатков и применяя штрафы за гэпы. Неограничивающие способы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996). Локальные способы выравнивают последовательности через идентификацию одного или нескольких консервативных мотивов, общих для всех входящих последовательностей. Неограничивающие способы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); выборку Гиббса, см., например, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van WaIIe et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).
Таким образом, доля идентичности последовательности определяется обычными способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math.Bio. 48: 603-16, 1986 и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Коротко, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации оценок выравнивания с применением штрафа за открытие гэпа 10, штрафа за продление гэпа и матрицу замен "blosum 62" от Henikoff and Henikoff (там же) как показано ниже (аминокислоты обозначаются стандартными однобуквенными кодами).
«Доля идентичности последовательности» между двумя или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности может быть рассчитан как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, умноженное на 100. При расчете % идентичности последовательности также можно принимать во внимание количество гэпов и длину каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или нескольких последовательностей. Сравнение последовательностей и определение доли идентичности между двумя или несколькими последовательностями может быть проведено с использованием определенных математических алгоритмов, таких как BLAST, которые знакомы специалисту в данной области техники.
ОЦЕНКИ ВЫРАВНИВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИДЕНТИЧНОСТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Долю идентичности затем рассчитывают как:
По существу гомологичные полипептиды характеризуются наличием одного или нескольких аминокислотных замещений, делеций или добавлений. Эти изменения предпочтительно являются незначительными, то есть консервативными аминокислотными замещениями (см. ниже) и другими замещениями, которые существенно не влияют на фолдинг или активность полипептида; малыми делециями, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; и малыми удлинениями на амино- или карбоксильном конце, такими как аминоконцевой метиониновый остаток, малый линкерный пептид вплоть до примерно до 20-25 остатков, или аффинная метка.
КОНСЕРВАТИВНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕЩЕНИЯ
Помимо 20 стандартных аминокислот, нестандартные аминокислоты (такие как 4-гилроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) могут быть замещены на аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению. Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодированы генетическим кодом, и не существующих в природе аминокислот может быть замещено на полипептидные аминокислотные остатки. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки.
Не встречающиеся в природе аминокислотные остатки включают, без ограничения, транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области техники известно несколько способов включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки. Например, может использоваться система in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области техники. Транскрипция и трансляция плазмид, содержащих нонсенс-мутации, осуществляется в бесклеточной системе, содержащей экстракт E. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). Во втором способе, трансляцию проводят в ооцитах Xenopus микроинъекцией мутированной иРНК и химически аминоацетилированной суппрессорной тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В третьем способе, клетки E. coli культивируют в отсутствие существующей в природе аминокислоты, которую необходимо заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желаемых не встречающейся в природе аминокислот (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Не существующая в природе аминокислота включается в полипептид вместо своего природного аналога. См., Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Существующие в природе аминокислотные остатки могут быть превращены в не существующие в природе виды химической модификацией in vitro. Химическая модификация может быть объединена с сайт-напрвленный мутагенезом для дальнейшего расширения диапазона замещений (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не существующих в природе аминокислот и ненатуральных аминокислот может быть замещено аминокислотными остатками полипептидов по настоящему изобретению.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с методиками, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Сайты биологического взаимодействия также могут быть определены физическим анализом структуры, определяемым такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего сайта. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть выведена из анализа гомологий с родственными компонентами (например, компонентами транслокации или протеазы) полипептидов по настоящему изобретению.
Множество аминокислотных замещений может быть проведено и протестировано с применением известных способов мутагенеза и скрининга, таких, как описаны у Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Коротко, эти авторы раскрывают способы одновременной рандомизации двух или нескольких положений в полипептиде, выбора функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замещений в каждом положении. Другие способы, которые могут применяться, включают фаговый дисплей (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США № 5,223,409; Huse, публикация WIPO WO 92/06204) и мутагенез, целенаправленно воздействующий на область (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Множество аминокислотных замещений может быть проведено и протестировано с применением известных способов мутагенеза и скрининга, таких, как описаны у Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Коротко, эти авторы раскрывают способы одновременной рандомизации двух или нескольких положений в полипептиде, выбора функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замещений в каждом положении. Другие способы, которые могут применяться, включают фаговый дисплей (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США № 5,223,409; Huse, публикация WIPO WO 92/06204) и мутагенез, целенаправленно воздействующий на область (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые являются общепринятыми для специалистов в области техники, к которой принадлежит настоящее описание. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) представляют специалистам в данной области техники общий словарь терминов, применяемых в настоящем описании.
Настоящее описание не ограничивается типовыми способами и материалами, описанными в настоящем документе, и любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться на практике или при тестировании вариантов осуществления этого описания. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записываются слева направо в ориентации от 5' до 3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от амино до карбокси, соответственно.
Заголовки, представленные в настоящем документе, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления этого описания.
В настоящем описании аминокислоты упоминаются с использованием названия аминокислоты, трехбуквенного сокращения или однобуквенного сокращения. Используемый здесь термин «белок» включает белки, полипептиды и пептиды. Используемый здесь термин «аминокислотная последовательность» синонимичен термину «полипептид» и/или термину «белок». В некоторых случаях, термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент». Термины «белок» и «полипептид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В настоящем описании и формуле изобретения могут использоваться обычные однобуквенные и трехбуквенные коды для аминокислотных остатков. Трехбуквенный код для аминокислот определен в соответствии с IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Также понятно, что полипептид может кодироваться более чем одной нуклеотидной последовательностью из-за вырожденности генетического кода.
В описании могут встречаться и другие определения терминов. Прежде чем типовые варианты осуществления будут описаны более подробно, следует понимать, что это описание не ограничивается конкретными описанными вариантами осуществления и как таковое может варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего описания будет определяться только прилагаемой формулой изобретения.
Если представлен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, вплоть до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не диктует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона также конкретно описывается. Каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне охвачен этим описанием. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться или исключаться из диапазона, и каждый диапазон, в котором любое, ни одно или оба ограничения включены в меньшие диапазоны, также охватывается настоящим описанием, с учетом любого специально исключенного ограничения в заявленный диапазон. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в это описание.
Следует отметить, что используемые здесь и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на «ботулинический нейротоксин» включает множество таких кандидатных агентов, а ссылка на «ботулинический нейротоксин» включает ссылку на один или несколько ботулинических нейротоксинов и их эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и так далее.
Обсуждаемые здесь публикации предназначены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что такие публикации составляют известный уровень техники по отношению к прилагаемой формуле изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Варианты осуществления изобретения теперь будут описаны, только в качестве примера, со ссылкой на следующие чертежи и примеры.
На фигуре 1 показано (A) расположение мышцы короткого разгибателя пальца и (B) представление записанного потенциала действия.
На фигуре 2 показана методика увеличения дозы BoNT/E и результаты.
На фигуре 3 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 12 недель после введения разных доз rBoNT/E по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 4 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения разных доз Dysport® по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 5 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения разных доз rBoNT/E по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 6 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения разных доз rBoNT/E по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 7 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения разных доз Dysport® по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 8 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения 0,04 нг rBoNT/E или 20 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 9 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения 0,04 нг rBoNT/E или 20 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 10 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения 0,2 нг rBoNT/E или 40 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 11 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения 0,2 нг rBoNT/E или 40 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).
На фигуре 12 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 10-21 дней после введения 0,04 нг rBoNT/E (среднее +/- с.о.с). Линейную кривую сопоставляют со значениями CMAP (Microsoft Excel), которая имеет величину достоверности аппроксимации 0,9642, и наклон y=3,5531x+9,9523. Значения CMAP соответствуют тем, которые показаны для этой дозы на фигуре 3.
На фигуре 13 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 10-42 дней после введения 0,9 нг rBoNT/E (среднее +/- с.о.с). Линейную кривую сопоставляют со значениями CMAP (Microsoft Excel), которая имеет величину достоверности аппроксимации 0,9926, и наклон y=1,6167x - 4,8227. Значения CMAP соответствуют тем, которые показаны для этой дозы на фигуре 3.
На фигуре 14 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 10-56 дней после введения 3,6 нг rBoNT/E (среднее +/- с.о.с). Линейную кривую сопоставляют со значениями CMAP (Microsoft Excel), которая имеет величину достоверности аппроксимации 0,9736, и наклон y=1,7325x - 9,3108. Значения CMAP соответствуют тем, которые показаны для этой дозы на фигуре 3.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Если исходный Met аминокислотный остаток или соответствующих исходный кодон указан в любой из следующих SEQ ID NOs, указанный остаток/кодон может быть необязательным.
SEQ ID NO: 1 (Нуклеотидная последовательность BoNT/E)
1 atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat
61 attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg
121 ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca
181 ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag
241 gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga
301 gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca
361 gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc
421 caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact
481 aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcacgg ttttggatca
541 atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa tagtatgaat
601 gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga
661 ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta
721 ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta
781 aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc tgattataaa
841 aaaatagcgt ctaaacttag caaagtacaa gtatctaatc cactacttaa tccttataaa
901 gatgtttttg aagcaaagta tggattagat aaagatgcta gcggaattta ttcggtaaat
961 ataaacaaat ttaatgatat ttttaaaaaa ttatacagct ttacggaatt tgatttagca
1021 actaaatttc aagttaaatg taggcaaact tatattggac agtataaata cttcaaactt
1081 tcaaacttgt taaatgattc tatttataat atatcagaag gctataatat aaataattta
1141 aaggtaaatt ttagaggaca gaatgcaaat ttaaatccta gaattattac accaattaca
1201 ggtagaggac tagtaaaaaa aatcattaga ttttgtaaaa atattgtttc tgtaaaaggc
1261 ataaggaaat caatatgtat cgaaataaat aatggtgagt tattttttgt ggcttccgag
1321 aatagttata atgatgataa tataaatact cctaaagaaa ttgacgatac agtaacttca
1381 aataataatt atgaaaatga tttagatcag gttattttaa attttaatag tgaatcagca
1441 cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa
1501 tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt
1561 ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca
1621 attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt
1681 aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta
1741 gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct
1801 atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat
1861 tttaaagatg cacttgaatt attaggagca ggtattttat tagaatttga acccgagctt
1921 ttaattccta caattttagt attcacgata aaatcttttt taggttcatc tgataataaa
1981 aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa
2041 gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga
2101 aaagaacaaa tgtatcaagc tttacaaaat caagtaaatg caattaaaac aataatagaa
2161 tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt
2221 aagcaaatag aaaatgaact taatcaaaag gtttctatag caatgaataa tatagacagg
2281 ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaattaa taaatgaagt aaaaattaat
2341 aaattaagag aatatgatga gaatgtcaaa acgtatttat tgaattatat tatacaacat
2401 ggatcaatct tgggagagag tcagcaagaa ctaaattcta tggtaactga taccctaaat
2461 aatagtattc cttttaagct ttcttcttat acagatgata aaattttaat ttcatatttt
2521 aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat
2581 aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa
2641 tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata
2701 tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg
2761 gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata
2821 aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt
2881 tggacattgc aagataatgc aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca
2941 aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta
3001 ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta
3061 ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga
3121 tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa
3181 actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg
3241 ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg
3301 agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt agctaataga
3361 ttatatagtg gaataaaagt taaaatacaa agagttaata atagtagtac taacgataat
3421 cttgttagaa agaatgatca ggtatatatt aattttgtag ccagcaaaac tcacttattt
3481 ccattatatg ctgatacagc taccacaaat aaagagaaaa caataaaaat atcatcatct
3541 ggcaatagat ttaatcaagt agtagttatg aattcagtag gaaataattg tacaatgaat
3601 tttaaaaata ataatggaaa taatattggg ttgttaggtt tcaaggcaga tactgtagtt
3661 gctagtactt ggtattatac acatatgaga gatcatacaa acagcaatgg atgtttttgg
3721 aactttattt ctgaagaaca tggatggcaa gaaaaataa
SEQ ID NO: 2 (Полипептидная последовательность BoNT/E)
PKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPE
RNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGI
LLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFET
NSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSL
HGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLL
ADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSF
TEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLN
PRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINT
PKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSD
IEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKP
VQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDA
LELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVY
SFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDI
KQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYII
QHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMR
YKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKN
FSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQK
LAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNIL
FKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYL
LNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKND
QVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNN
NGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
SEQ ID NO:3 (BoNT/E - UniProt Q00496)
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTS
LKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTP
DNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGS
IAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPL
ITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYK
DVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKL
SNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKG
IRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESA
PGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSS
IDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADIS
IVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNK
NKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIE
SKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKIN
KLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYF
NKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNI
SQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEII
WTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNL
GNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYL
LYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDN
LVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNF
KNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
SEQ ID NO: 4 (Полипептидная последовательность L-Цепи BoNT/E)
PKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPE
RNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGI
LLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFET
NSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSL
HGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLL
ADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSF
TEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLN
PRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIR
SEQ ID NO: 5 (Полипептидная последовательность H-Цепи BoNT/E)
KSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINT
PKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSD
IEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKP
VQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDA
LELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVY
SFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDI
KQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYII
QHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMR
YKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKN
FSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQK
LAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNIL
FKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYL
LNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKND
QVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNN
NGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
ПРИМЕРЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Фармакодинамическая модель
Фармакодинамическая модель применяет мышцу Короткий разгибатель пальца (EDB) (Фигура 1A). EDB является поверхностной мышцей стопы, доступной для электрофизиологических исследований. Она участвует в разгибании 2-4-го пальцев стопы, и ее слабость не мешает ходьбе.
Мышцу EDB ранее применяли для определения действия BoNT/A, как опубликовано у Hamjian and Walker (1994), Muscle Nerve, 17(12): 1385-92. С тех пор эта модель широко применяется для:
- количественной оценки наступления и степени расслабления мышц человека и длительности действия после инъекции BoNT (Sloop et al (1996), Neurology, 46(5), 1382-6);
- сравнения разных подтипов BoNT (например, BoNT/B к BoNT/A) (Sloop et al (1997), Neurology, 49(1), 189-94);
- проверки эффективности составов BoNT/A (Park and Ahn (2013), J Clin Neurol, 9(3), 157-164).
Способ включает стимуляцию инъецированного EDB и регистрацию его потенциала действия (фигура 1B). BoNT/E или BoNT/A вводят введением под контролем УЗИ, и поверхностные электроды используют для стимуляции и регистрации потенциалов действия.
Фигура 2 суммирует методику повышения дозы, которая основана на обзоре данных безопасности (слепые) и фармакодинамики (анонимные) из предыдущей когорты.
Дизайн исследования и лечение
Фаза 1, осуществляют метод произвольного выбора в условиях двойной анонимности с контролем по плацебо (клиническое исследование с участием людей).
Каждый субъект получает одну внутримышечную дозу rBoNT-E или плацебо (произвольное распределение 3:1) в правую мышцу EDB.
Используют когорты субъектов, где каждой следующей когорте инъецируют более высокую дозу rBoNT-E, чем предыдущей. Все субъекты в каждой когорте получают одинаковую дозу rBoNT-E или плацебо.
Участвуют максимум восемь когорт:
- исходные когорты: четыре субъекта на когорту (три - rBoNT-E, один - плацебо).
- последующие когорты: после достижения ~50% ингибирования CMAP от исходного значения в течение трех последовательных моментов времени у, по меньшей мере, трех субъектов, инъецированных BoNT-E, когорты удваивают до восьми субъектов.
Когортам вводят последовательно, в порядке возрастания дозы:
- дозы повышают до достижения максимального ингибировании CMAP (≥85% снижения от исходного уровня) в течение трех последовательных моментов времени у, по меньшей мере, четырех из шести трех субъектов, инъецированных BoNT-E на когорту, в двух последовательных когортах.
- применяемые дозы: 0,1 единицы клеточного анализа (Ед CBA; 0,04 нг),0,5 Ед CBA (0,2 нг), 2,25 Ед CBA (0,9 нг) и 9,0 Ед CBA (3,6 нг).
Критерии включения:
- здоровые мужчины (18-55 лет) с индексом массы тела 18-30 кг/м2.
- общая амплитуда EDB CMAP ≥5 мВ при стимулировании перонеального нерва для электрофизиологической проверки (при скрининге и до инъекции).
- добровольное согласие следовать протоколу исследования и оставаться в клинике в течение требуемого периода времени.
Критерии исключения:
- предыдущее лечение BoNT ≤6 месяцев до включения в исследование.
- анамнез гиперчувствиельности к компонентам состава rBoNT-E.
- медицинское состояние, которое подвергает пациента риску при воздействии BoNT.
- применение агентов нейромышечной передачи.
Клеточный анализ
Биологическую активность rBoNT/E определяют клеточным анализом (CBA) и выражают в % относительно эффективности определенного эталонного стандарта. Такой CBA имитирует in vivo механизм действия BoNT/E, т.е. связывание с рецепторами, приводящее к интернализации токсина и расщеплению синаптосомально-ассоциированного белка 25 (SNAP25) легкой цепи домена эндопептидазы. CBA применяет Neuro-2A, клеточную линию нейробластомы мышей, сконструированную для экспрессирования репортера, который применяет полноразмерный SNAP-25, фланкированный флуорофорами, голубым флуоресцентным белком и желтым флуоресцентным белком (YFP). При инкубировании сконструированных клеток с BoNT/E, токсин связывается и интернализуется через рецептор-опосредованный эндоцитоз, что приводит к выделению легкой цепи BoNT/E в цитозоль. Легкая цепь эндопептидазы расщепляет SNAP-25 в репортере, что приводит к выделению C-концевого фрагмента репортера в цитозоль, который содержит остатки SNAP-25 и YFP. Фрагмент быстро разлагается, что приводит к потере YFP флуоресценции. Биоактивность рекомбинантного BoNT/E определяется только, если токсин попадает в клетки через связывание рецептора H-цепи BoNT/E, интернализацию и транслокацию; таким образом, in vitro CBA имитирует природную биологию клетки BoNT/E. CBA единицы, соответствующие количествам BoNT/E, представлены в следующих примерах.
1 CBA единица может быть определена как количество BoNT/E, требуемое для расщепления 1 нМ субстрата (SNAP-25) за 1 минуту.
ПРИМЕР 1
Введение BoNT/E
Фигура 3 показывает, что плацебо варьируется около 100% CMAP исходного значения, и показывает четкий дозозависимый эффект для BoNT/E. Две более высокие дозы показали одинаковый фармакодинамический (ФД) профиль с достижением максимального ингибирования (более 90%), и длительность действия приблизительно 50 дней (15% отсечка ингибирования) или 30 дней (50% отсечка ингибирования).
Введение Dysport ®
Фигура 4 снова показывает, что плацебо варьируется около 100% CMAP исходного значения, и 60-70% ингибирование достигается для доз 40 и 70 Ед Dysport® (BoNT/A). Ингибирование достигает плато на несколько недель без восстановления (возврат к 15% ингибированию) к концу 26-недельного периода наблюдения.
ПРИМЕР 2
Анализ вплоть до 26 недель после введения
Сравнение Фигур 4 и 5 показывает, что исследованные диапазоны доз rBoNT-E показали быстрое наступление эффекта, больший пиковый эффект и меньшую продолжительность эффекта.
ПРИМЕР 3
Наступление действия
Время наступления действия (определенное как первый момент времени, в который регистрируют 15% ингибирование CMAP) для BoNT/E было быстрым и сопоставимым у всех субъектов и при всех исследованных уровнях доз rBoNT-E. Наступление также было обнаружено в промежуток времени от 1 дня (дня введения BoNT/E) до 2 дня, в отличие от 1 дня - 7 дня для Dysport®. Результаты представлены на Фигурах 6 и 7, и значения суммированы в таблицах ниже.
Таблица 1 показывает данные для rBoNT/E.
(0,04 нг)
n=6
(0,2 нг)
n=6
(0,9 нг)
n=6
(3,6 нг)
n=6
[1-2]
[1-2]
[1-2]
[1-2]
[7-10]
[2-14]
[3-10]
[5-10]
[43,7-61,6]
[45,1-87,8]
[77,6-100]
[91,6-98,7]
[21-21]
[24-49]
[42-77]
[42-63]
[19-20]
[22-48]
[41-76]
[40-62]
rBoNT/E ассоциируется с быстрым наступлением действия в период от 1 дня (дня введения) до 2 дня. Время до максимального эффекта было записано между 2 днем и 14 днем (самое позднее). rBoNT/E также ассоциируется с короткой длительностью действия около 50 для двух самых высоких тестированных доз.
Таблица 2 показывает данные для Dysport®.
(n=6)
(n=6)
(n=6)
[1-7]
[1-4]
[1-6]
[21-133]
[5-56]
[6-24]
[36,4-70,6]
[58,4-92,1]
[57,1-77,9]
аингибирование СМАР не восстановилось на 15% от исходного уровня к концу 6-месячного периода наблюдения
Dysport® демонстрирует более позднее наступление действия в период от 1 дня до 7 дня для исследованного диапазона доз, и длительность действие свыше 26-недель после введения.
ПРИМЕР 4
Сравнение 40 пг rBoNT/E и 20 Ед Dysport ®
Фигуры 8 и 9 показывают, что 40 пг rBoNT-E дает такую же амплитуду действия, как и 20 Ед Dysport®. То есть, 20 Ед Dysport=108 пг нейротоксина (5,38 пг нейротоксина/Ед).
Сравнение ФД свойств представлено в таблице ниже.
Таблица 3 показывает сравнительные данные для rBoNT/E и Dysport®.
*примерно 40 дней для 2/6 субъектов, >26 недель для 4/6 субъектов
ПРИМЕР 5
Сравнение 200 пг rBoNT/E и 40 Ед Dysport ®
Фигуры 10 и 11 показывают, что 200 пг rBoNT-E дает такую же амплитуду действия, как и 40 Ед Dysport®. Сравнение ФД свойств представлено в таблице ниже.
Таблица 4 показывает сравнительные данные для rBoNT/E и Dysport®.
В заключение, BoNT/E демонстрирует:
- хороший общий профиль безопасности для однократных внутримышечных доз rBoNT-E вплоть до 3,6 нг у здоровых добровольцев (нормальные мышцы);
- отсутствие локальной диффузии в соседние мышцы (AH и ADQ);
- быстрое наступление действия независимо от исследованной дозы;
- дозозависимую амплитуду эффекта с максимальным эффектом, достигаемым от 0,9 нг;
- достижение максимального эффекта в течение приблизительно одной недели; и
- аналогичный ФД профиль для двух наивысших тестированных доз, связанный с длительность эффекта приблизительно 50 дней.
Наоборот, ингибирование CMAP все еще наблюдалось в конце 26-недельного (6 месяцев) периода регистрации для Dysport®.
Что касается амплитуды максимального эффекта:
- 20 Ед Dysport сравнивают с 0,04 нг rBoNT-E; и
- 40-70 Ед Dysport сравнивают с 0,2 нг rBoNT-E
ПРИМЕР 6
Лечение морщин верхней части лица
Представлен субъект с выраженными глабеллярными морщинами (3 степень выраженности согласно Шкале морщин лица (FWS), где 0=отсутствие и 3=выраженные). Дозу, по меньшей мере, 0,1 нг (на место инъекции) rBoNT/E вводят внутримышечно в пять мест (последовательно, так что каждая мышца инъецируется практически в одно и то же время): одна инъекция в мышцу гордецов, и две в каждую мышцу, сморщивающую бровь.
Степень выраженности глабеллярных морщин у субъекта оценивают через 7 дней (после введения) с помощью FWS, и определяют 0 степень (таким образом, показано, что rBoNT/E быстро начинает действовать для лечения морщин в верхней части лица).
Степень выраженности глабеллярных морщин у субъекта оценивают через 35 дней (после введения) с помощью FWS и устанавливают 2 степень (среднюю).
Степень выраженности глабеллярных морщин у субъекта оценивают через 56 дней (после введения) с помощью FWS и устанавливают 3 степень (выраженную) (таким образом, показано, что rBoNT/E имеет короткую продолжительность эффекта для лечения морщин в верхней части лица).
Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем по настоящему изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области биохимии и биотехнологии или родственных областях, входят в объем следующей формулы изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Ipsen Biopharm Limited
<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ И КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕЙРОТОКСИНА
БОТУЛИНА СЕРОТИПА E
<130> P60164WO
<150> GB1815844.4
<151> 2018-09-28
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3759
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 1
atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat
60
attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg
120
ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca
180
ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag
240
gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga
300
gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca
360
gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc
420
caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact
480
aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcacgg ttttggatca
540
atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa tagtatgaat
600
gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga
660
ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta
720
ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta
780
aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc tgattataaa
840
aaaatagcgt ctaaacttag caaagtacaa gtatctaatc cactacttaa tccttataaa
900
gatgtttttg aagcaaagta tggattagat aaagatgcta gcggaattta ttcggtaaat
960
ataaacaaat ttaatgatat ttttaaaaaa ttatacagct ttacggaatt tgatttagca
1020
actaaatttc aagttaaatg taggcaaact tatattggac agtataaata cttcaaactt
1080
tcaaacttgt taaatgattc tatttataat atatcagaag gctataatat aaataattta
1140
aaggtaaatt ttagaggaca gaatgcaaat ttaaatccta gaattattac accaattaca
1200
ggtagaggac tagtaaaaaa aatcattaga ttttgtaaaa atattgtttc tgtaaaaggc
1260
ataaggaaat caatatgtat cgaaataaat aatggtgagt tattttttgt ggcttccgag
1320
aatagttata atgatgataa tataaatact cctaaagaaa ttgacgatac agtaacttca
1380
aataataatt atgaaaatga tttagatcag gttattttaa attttaatag tgaatcagca
1440
cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa
1500
tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt
1560
ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca
1620
attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt
1680
aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta
1740
gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct
1800
atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat
1860
tttaaagatg cacttgaatt attaggagca ggtattttat tagaatttga acccgagctt
1920
ttaattccta caattttagt attcacgata aaatcttttt taggttcatc tgataataaa
1980
aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa
2040
gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga
2100
aaagaacaaa tgtatcaagc tttacaaaat caagtaaatg caattaaaac aataatagaa
2160
tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt
2220
aagcaaatag aaaatgaact taatcaaaag gtttctatag caatgaataa tatagacagg
2280
ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaattaa taaatgaagt aaaaattaat
2340
aaattaagag aatatgatga gaatgtcaaa acgtatttat tgaattatat tatacaacat
2400
ggatcaatct tgggagagag tcagcaagaa ctaaattcta tggtaactga taccctaaat
2460
aatagtattc cttttaagct ttcttcttat acagatgata aaattttaat ttcatatttt
2520
aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat
2580
aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa
2640
tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata
2700
tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg
2760
gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata
2820
aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt
2880
tggacattgc aagataatgc aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca
2940
aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta
3000
ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta
3060
ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga
3120
tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa
3180
actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg
3240
ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg
3300
agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt agctaataga
3360
ttatatagtg gaataaaagt taaaatacaa agagttaata atagtagtac taacgataat
3420
cttgttagaa agaatgatca ggtatatatt aattttgtag ccagcaaaac tcacttattt
3480
ccattatatg ctgatacagc taccacaaat aaagagaaaa caataaaaat atcatcatct
3540
ggcaatagat ttaatcaagt agtagttatg aattcagtag gaaataattg tacaatgaat
3600
tttaaaaata ataatggaaa taatattggg ttgttaggtt tcaaggcaga tactgtagtt
3660
gctagtactt ggtattatac acatatgaga gatcatacaa acagcaatgg atgtttttgg
3720
aactttattt ctgaagaaca tggatggcaa gaaaaataa
3759
<210> 2
<211> 1251
<212> БЕЛОК
<213> Clostridium botulinum
<400> 2
Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg Thr
1 5 10 15
Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser Phe
20 25 30
Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile Gly
35 40 45
Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly Asp
50 55 60
Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys Asp
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn Asn
85 90 95
Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro Tyr
100 105 110
Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp Ala
115 120 125
Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu Leu
130 135 140
Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His Gly
165 170 175
Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe Arg
180 185 190
Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu Thr
195 200 205
Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys
210 215 220
Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu Ile
225 230 235 240
Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr Thr
260 265 270
Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys Val
275 280 285
Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu Ala
290 295 300
Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn Ile
305 310 315 320
Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu Phe
325 330 335
Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile Gly
340 345 350
Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile Tyr
355 360 365
Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe Arg
370 375 380
Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr Gly
385 390 395 400
Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val Ser
405 410 415
Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly Glu
420 425 430
Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile Asn
435 440 445
Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr Glu
450 455 460
Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala Pro
465 470 475 480
Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala Tyr
485 490 495
Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His Asp
500 505 510
Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val Pro
515 520 525
Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala Leu
530 535 540
Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile Asn
545 550 555 560
Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile Gln
565 570 575
Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr Val
580 585 590
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu Ala
595 600 605
Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala Leu
610 615 620
Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu Leu
625 630 635 640
Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser Ser
645 650 655
Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys Glu
660 665 670
Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn Trp
675 680 685
Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met Tyr
690 695 700
Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu Ser
705 710 715 720
Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn Lys
725 730 735
Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser Ile
740 745 750
Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser Tyr
755 760 765
Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu Tyr
770 775 780
Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His Gly
785 790 795 800
Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr Asp
805 810 815
Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Asp
820 825 830
Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys Ser
835 840 845
Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr
850 855 860
Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr
865 870 875 880
Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu
885 890 895
Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys
900 905 910
Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys
915 920 925
Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp
930 935 940
Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp
945 950 955 960
Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr
965 970 975
Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val
980 985 990
Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly
995 1000 1005
Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His
1010 1015 1020
Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr
1025 1030 1035
Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu Leu
1040 1045 1050
Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr
1055 1060 1065
Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys
1070 1075 1080
Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp
1085 1090 1095
Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser Thr
1100 1105 1110
Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys Ile
1115 1120 1125
Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys
1130 1135 1140
Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His Leu
1145 1150 1155
Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr
1160 1165 1170
Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val
1175 1180 1185
Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn
1190 1195 1200
Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val
1205 1210 1215
Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn
1220 1225 1230
Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp
1235 1240 1245
Gln Glu Lys
1250
<210> 3
<211> 1251
<212> БЕЛОК
<213> Clostridium botulinum
<400> 3
Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg
1 5 10 15
Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser
20 25 30
Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile
35 40 45
Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly
50 55 60
Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys
65 70 75 80
Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn
85 90 95
Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro
100 105 110
Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp
115 120 125
Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu
130 135 140
Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His
165 170 175
Arg Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe
180 185 190
Arg Phe Asn Asp Asn Cys Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala
210 215 220
Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu
225 230 235 240
Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr
260 265 270
Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys
275 280 285
Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu
290 295 300
Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn
305 310 315 320
Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu
325 330 335
Phe Asp Leu Arg Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile
340 345 350
Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile
355 360 365
Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe
370 375 380
Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr
385 390 395 400
Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val
405 410 415
Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly
420 425 430
Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile
435 440 445
Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr
450 455 460
Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala
465 470 475 480
Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala
485 490 495
Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His
500 505 510
Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val
515 520 525
Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala
530 535 540
Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile
545 550 555 560
Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile
565 570 575
Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr
580 585 590
Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu
595 600 605
Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala
610 615 620
Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu
625 630 635 640
Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser
645 650 655
Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys
660 665 670
Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn
675 680 685
Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met
690 695 700
Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu
705 710 715 720
Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn
725 730 735
Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser
740 745 750
Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser
755 760 765
Tyr Leu Met Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu
770 775 780
Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His
785 790 795 800
Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr
805 810 815
Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp
820 825 830
Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys
835 840 845
Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp
850 855 860
Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys
865 870 875 880
Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser
885 890 895
Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr
900 905 910
Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn
915 920 925
Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg
930 935 940
Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile
945 950 955 960
Trp Thr Phe Glu Asp Asn Arg Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn
965 970 975
Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe
980 985 990
Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn
995 1000 1005
Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile
1010 1015 1020
His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr
1025 1030 1035
Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu
1040 1045 1050
Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn
1055 1060 1065
Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp
1070 1075 1080
Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile
1085 1090 1095
Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser
1100 1105 1110
Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys
1115 1120 1125
Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg
1130 1135 1140
Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His
1145 1150 1155
Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys
1160 1165 1170
Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val
1175 1180 1185
Val Met Asn Ser Val Gly Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn
1190 1195 1200
Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val
1205 1210 1215
Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn
1220 1225 1230
Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp
1235 1240 1245
Gln Glu Lys
1250
<210> 4
<211> 421
<212> БЕЛОК
<213> Clostridium botulinum
<400> 4
Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg Thr
1 5 10 15
Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser Phe
20 25 30
Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile Gly
35 40 45
Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly Asp
50 55 60
Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys Asp
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn Asn
85 90 95
Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro Tyr
100 105 110
Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp Ala
115 120 125
Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu Leu
130 135 140
Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His Gly
165 170 175
Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe Arg
180 185 190
Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu Thr
195 200 205
Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys
210 215 220
Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu Ile
225 230 235 240
Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr Thr
260 265 270
Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys Val
275 280 285
Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu Ala
290 295 300
Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn Ile
305 310 315 320
Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu Phe
325 330 335
Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile Gly
340 345 350
Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile Tyr
355 360 365
Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe Arg
370 375 380
Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr Gly
385 390 395 400
Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val Ser
405 410 415
Val Lys Gly Ile Arg
420
<210> 5
<211> 830
<212> БЕЛОК
<213> Clostridium botulinum
<400> 5
Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly Glu Leu Phe Phe Val Ala
1 5 10 15
Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile
20 25 30
Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Gln
35 40 45
Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala Pro Gly Leu Ser Asp Glu
50 55 60
Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His Asp Val Asn Glu Leu Asn
85 90 95
Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Asn Asn
100 105 110
Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala Leu Leu Glu Gln Pro Lys
115 120 125
Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile Asn Asn Val Asn Lys Pro
130 135 140
Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile Gln Gln Val Leu Val Asp
145 150 155 160
Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp
165 170 175
Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn
180 185 190
Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala Leu Glu Leu Leu Gly Ala
195 200 205
Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu
210 215 220
Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser Ser Asp Asn Lys Asn Lys
225 230 235 240
Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys Glu Arg Asp Glu Lys Trp
245 250 255
Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn Trp Met Thr Lys Ile Asn
260 265 270
Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn
275 280 285
Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr
290 295 300
Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn Lys Tyr Asp Ile Lys Gln
305 310 315 320
Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser Ile Ala Met Asn Asn Ile
325 330 335
Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile
340 345 350
Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Asp Glu Asn Val Lys
355 360 365
Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His Gly Ser Ile Leu Gly Glu
370 375 380
Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr Asp Thr Leu Asn Asn Ser
385 390 395 400
Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Asp Lys Ile Leu Ile Ser
405 410 415
Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys Ser Ser Ser Val Leu Asn
420 425 430
Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asp Ser
435 440 445
Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Asn
450 455 460
Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu Val Asn Ile Ser Gln
465 470 475 480
Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Ile Ser
485 490 495
Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys Ile Val Asn Val Asn
500 505 510
Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp Asn Asn Ser Gly Trp
515 520 525
Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn
530 535 540
Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr Gly Asn Ala Asn Gly
545 550 555 560
Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asp
565 570 575
Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Gln
580 585 590
Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu
595 600 605
Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr
610 615 620
Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu
625 630 635 640
Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn
645 650 655
Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro
660 665 670
Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn
675 680 685
Ile Arg Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys
690 695 700
Val Lys Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val
705 710 715 720
Arg Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His
725 730 735
Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr
740 745 750
Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val Met
755 760 765
Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly
770 775 780
Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val Val Ala Ser
785 790 795 800
Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn Ser Asn Gly Cys
805 810 815
Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp Gln Glu Lys
820 825 830
<---
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН | 2017 |
|
RU2789302C2 |
ГИБРИДНЫЕ НЕЙРОТОКСИНЫ | 2017 |
|
RU2782382C2 |
ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНЫМ НЕЙРОТОКСИНАМ | 2020 |
|
RU2824389C2 |
НОВЫЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРЕМОРА | 2020 |
|
RU2826569C2 |
СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН | 2016 |
|
RU2746736C2 |
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИММУНОТЕРАПИИ | 2014 |
|
RU2729118C2 |
БИОГИБРИД БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА | 2019 |
|
RU2816855C2 |
КОМПЛЕКС, ПРЕПАРАТ И ПРИМЕНЕНИЕ БОТУЛОТОКСИНА ТИПА А CLOSTRIDIUM BOTULINUM | 2020 |
|
RU2783511C1 |
СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ | 2018 |
|
RU2719164C1 |
СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ | 2019 |
|
RU2727402C1 |
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способы лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), а также косметические способы для подавления морщин в верхней части лица, где способы включают введение BoNT/E субъекту-человеку в дозе от 0,04 до 4 нг, где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки. Изобретения позволяют достигнуть максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения BoNT/E и снижают до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения BoNT/E, что приводит к эффективному лечению расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E. 6 н. и 25 з.п. ф-лы, 14 ил., 4 табл., 6 пр.
1. Способ лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения,
где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,
где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.
2. Способ лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения,
где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,
где ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается по существу линейно после указанного максимального ингибирования секреции нейромедиатора,
где указанное по существу линейное снижение происходит в течение 10-56 дней, 10-42 дней и/или 10-21 дней после введения,
где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.
3. Способ лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения,
где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,
где % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается в среднем на 1-8% в день после указанного максимального ингибирования секреции нейромедиатора,
где указанное снижение % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени происходит в течение 10-24 дней, 6-42 дней, 10-42 дней, 10-49 дней и/или 10-56 дней после введения,
где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.
4. Косметический способ для подавления морщин в верхней части лица, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения, где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,
где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.
5. Косметический способ для подавления морщин в верхней части лица, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения,
где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,
где ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается по существу линейно после указанного максимального ингибирования секреции нейромедиатора,
где указанное по существу линейное снижение происходит в течение 10-56 дней, 10-42 дней и/или 10-21 дней после введения,
где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.
6. Косметический способ для подавления морщин в верхней части лица, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения,
где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,
где % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается в среднем на 1-8% в день после указанного максимального ингибирования секреции нейромедиатора,
где указанное снижение % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени происходит в течение 10-24 дней, 6-42 дней, 10-42 дней, 10-49 дней и/или 10-56 дней после введения,
где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.
7. Способ по любому из пп. 1-3 или косметический способ по любому из пп. 4-6, где общая введенная доза BoNT/E составляет менее чем 0,2 нг.
8. Способ по любому из пп. 1-3 или 7 или косметический способ по любому из пп. 4-6 или 7, где общая введенная доза BoNT/E составляет 0,01 – 0,04 нг.
9. Способ по любому из пп. 1-3 или 7, 8 или косметический способ по любому из пп. 4-6 или 7, 8, где BoNT/E вводится и дает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение от >21 до <100 дней после введения.
10. Способ по п. 9, где BoNT/E вводится и дает:
по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение от >40 до <80 дней после введения.
11. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-10 или косметический способ по любому из пп. 4-10, где BoNT/E вводится и дает, по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤10 дней после введения.
12. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-11 или косметический способ по любому из пп. 4-11, где BoNT/E вводится и дает 15% или меньше ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение <80 дней после введения.
13. Способ или косметический способ по п. 12, где BoNT/E вводится и дает 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение <60 дней после введения.
14. Способ или косметический способ по п. 13, где BoNT/E вводится и дает 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение <30 дней после введения.
15. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-14 или косметический способ по любому из пп. 4-14, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-100 дней.
16. Способ или косметический способ по п. 15, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-60 дней.
17. Способ или косметический способ по п. 16, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-40 дней.
18. Способ или косметический способ по п. 17, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-30 дней.
19. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-18 или косметический способ по любому из пп. 4-18, где BoNT/E вводится и дает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения.
20. Способ или косметический способ по п. 19, где BoNT/E вводится и дает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤11 дней после введения.
21. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-20 или косметический способ по любому из пп. 4-20, где BoNT/E вводится и дает:
а. максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и
b. последующее снижение % ингибирования секреции нейромедиатора на 1-10% в день.
22. Способ или косметический способ по п. 21, где BoNT/E вводится и дает:
а. максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤10 дней после введения; и
b. последующее снижение % ингибирования секреции нейромедиатора на 1-3% в день от дня 10-24, от дня 6-42, от дня 10-42 и/или от дня 10-56 после введения.
23. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-22 или косметический способ по любому из пп. 4-22, где % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени измеряют с применением электрофизиологии.
24. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-23 или косметический способ по любому из пп. 4-23, где BoNT/E:
а. кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1; или
b. содержит полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
25. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-24 или косметический способ по любому из пп. 4-24, где BoNT/E содержит полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2, при условии, что полипептидная последовательность включает одну или несколько из следующих аминокислот, где нумерация положений аминокислот начинается от N-концевого метионинового аминокислотного остатка и заканчивается на C-концевом аминокислотном остатке BoNT/E белка:
глицин в положении 177; серин в положении 198; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; аспарагин в положении 1195.
26. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-25, где расстройством является одно или несколько из: состояния, связанного с косоглазием, блефароспазма, косоглазия, дистонии, кривошеи, косметологического применения, где полезно временное поражение клеток/мышц через подавление или инактивацию SNARE, нервно-мышечного расстройства или состояния подвижности глаз, писчего спазма, блефароспазма, бруксизма, болезни Вильсона, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности из-за хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушению контроля над мочевым пузырем, анимуса, спазма спины, ушиба или разрыва мышц, головных болей напряжения, синдрома подъемника таза, расщелины позвоночника, поздней дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, очаговой спастичности, спазматического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, тиков, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерной секреции желудочно-кишечного тракта, мышечной боли, головной боли, межбровных складок, морщин кожи, рака, расстройств матки, мочеполовых расстройств, урогенитально-неврологических расстройств, хронического нейрогенного воспаления и расстройства гладкой мускулатуры.
27. Способ по п. 26, где
а. дистонию выбирают из спазматической дистонии, оромандибулярной дистонии, очаговой дистонии, поздней дистонии, дистонии мышц гортани, дистонии конечностей, шейной дистонии;
b. кривошея представляет собой спастическую кривошею;
с. нервно-мышечное расстройство или состояние подвижности глаз выбирают из сопутствующего косоглазия, вертикального косоглазия, паралича наружной прямой мышцы, нистагма и дистироидной миопатии;
d. мышечная боль представляет собой боль при мышечных спазмах; и/или
е. головная боль представляет собой головную боль напряжения.
28. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-27, где расстройством является спастичность верхних конечностей.
29. Способ по п. 28, где расстройством является спастичность верхних конечностей у субъекта в возрасте более 18 лет.
30. Косметический способ по любому из пп. 4-25, где необязательно морщинами в верхней части лица являются одни или несколько, выбранных из глабеллярных морщин, морщин в углах глаз, лобных морщин или их комбинации.
31. Косметический способ по любому из пп. 4-25 или 30, где косметический способ предназначен для лечения глабеллярных морщин.
WO 2018175688 A1, 27.09.2018 | |||
WO 2015188944 A1, 17.12.2015 | |||
ГОЛОВНАЯ ЧАСТЬ УПРАВЛЯЕМОГО СНАРЯДА | 1995 |
|
RU2089834C1 |
US 2015174217 A1, 25.06.2015 | |||
WO 2014068317 A1, 08.05.2014 | |||
WO 2013068476 A1, 16.05.2013 | |||
SLAWEK J ET AL.: "Botulinum toxin type A for upper limb spasticity following stroke: an open-label study with individualised, flexible injection regimens", NEUROLOGICAL |
Авторы
Даты
2023-07-25—Публикация
2019-07-04—Подача