СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/10 A61K39/40 A61B10/00 

Изобретение относится к ветеринарии, к диагностике инфекционных болезней, а именно бруцеллеза.

Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных и человека.

В массовой диагностике этой болезни у разных видов животных используют различные серологические реакции с антигенами, полученными из типичных бруцелл, находящихся в S-форме.

При этом в качестве контроля при исследовании сывороток крови, поступающих от животных в диагностические ветеринарные лаборатории, используют отрицательные и позитивные сыворотки крови.

Позитивная бруцеллезная сыворотка, таким образом, необходима в массовой серологической диагностике бруцеллеза у разных видов животных в качестве контрольной при исследовании сывороток крови с целью выявления в РА, РСК и других реакциях антител к типичным бруцеллам, находящимся в S-форме.

Кроме того, S-бруцеллезную сыворотку применяют в бактериологической диагностике бруцеллеза при идентификации и дифференциации выделенных культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

В качестве S-бруцеллезной сыворотки используют сыворотку крови, полученную от животного, сенсибилизированного типичными бруцеллами, с высоким уровнем содержания в ней антител к ним.

В литературе известен принцип получения S-бруцеллезной диагностической сыворотки, основанный на гипериммунизации животных-доноров (кролики, крупный рогатый скот и др.) по определенной схеме, преследующей достижение высокого уровня антител (Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним / под ред. Т.С. Сайдулдина. - Алматы, 2007. - 433 с.).

Максимально высокого уровня антител в сыворотке крови можно достичь за счет многократной гипериммунизации животных-продуцентов культурами вирулентных бруцелл. Так, известен способ получения диагностической бруцеллезной агглютинирующей сыворотки, заключающийся в гипериммунизации кроликов-продуцентов живыми вирулентными клетками В.abortus 146 и B.melitensis И-297. Животным вводят подкожно трехкратно в четыре точки спины вдоль позвоночника 0,5, 0,75 и 1,0 мл смеси в равных количествах культур с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с недельным интервалом. Через две недели после завершающей инъекции антигена вводят подкожно в область внутренней верхней трети поверхности бедра 1,0 мл смеси культур в 0,85%-ном растворе натрия хлорида. Через 14 дней после окончания иммунизации кроликов тотально обескровливают. Сыворотку инактивируют нагреванием и консервируют [RU 2005781 C1, 15.01.1994].

Известен способ получения поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки, заключающийся в гипериммунизации быков-продуцентов взвесью культур бруцелл - В.abortus 544, B.melitensis 16-М и B.suis 1330, инактивированной нагреванием при температуре 60°C в течение 2 часов с последующим добавлением карболовой кислоты и выдерживанием при 37°C - 48 часов. Вначале проводят грунд-иммунизацию животных путем однократного введения 10 мл бруцеллезного антигена подкожно и через 1 месяц начинают реиммунизацию в 2-4 цикла с интервалами 20-30 суток. В течение одного цикла проводят 5 ежедневных инъекций антигена с объемами 10, 15, 20, 30, 40 мл. [Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая. ТУ-316-82 от 01.06.1982, утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР].

Недостатками обоих способов являются высокая себестоимость конечного продукта за счет длительности и трудоемкости процесса его получения, а также эпидемическая опасность, связанная с использованием в процессе производства живых вирулентных культур бруцелл. Даже использование во втором способе для гипериммунизации животных взвеси инактивированных вирулентных бруцелл не исключает эпидемическую опасность, так как предварительно осуществляется работа с живыми вирулентными бруцеллами.

Одним из актуальных моментов является использование в процессе получения сывороток вакцинных штаммов бруцелл, причем не видов melitensis и suis, а только вида abortus, обладающего наименьшей остаточной вирулентностью.

Такая принципиальная возможность для получения эффективной бруцеллезной сыворотки для использования в серологической диагностике болезни, вызываемой любыми видами бруцелл в S-форме, существует благодаря объективным доказательствам их антигенного родства.

Наиболее близким техническим результатом является способ изготовления диагностической бруцеллезной сыворотки (патент RU №2361610 C1 от 20.07.2009 «Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для роз - бенгал пробы (РБП) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки и диагностические наборы»), заключающийся в гипериммунизации животных-продуцентов подкожно в области средней трети шеи антигеном из штамма В.abortus 19 по следующей схеме: 1-й день вводят 5 мм³ антигена (75 млрд м.к.), 10-й день вводят 8 мм³ (120 млрд м.к.), 20-21-й день вводят 10 мм³ (150 млрд м.к.), на 27-28-й день проводят пробное взятие крови, а на 30-31-й день осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 37-38°C в течение 2-3 часов, а затем помещают в холодильник при 2-8°C на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку. Полученную сыворотку консервируют добавлением 4%-ной сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 54-56°C в течение 40 минут при постоянном перемешивании, а затем помещают в холодильник при температуре 2-8°C на 10 суток. Сыворотка должна быть стерильной, иметь титр в РА не ниже 1000 ME, а в РСК - не ниже 1:20. Сыворотку расфасовывают и проверяют на активность и специфичность.

Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость процесса, эпидемическая опасность, связанная с использованием живой культуры бруцелл.

Техническим результатом способа изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки является снижение трудоемкости процесса ее изготовления и эпидемической опасности.

Техническое решение достигается тем, что способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки включает гипериммунизацию животным-продуцентам подкожно бруцеллезного антигена штамма В.abortus 19, сыворотку отделяют, консервируют и расфасовывают, проверяют на стерильность, активность и специфичность, сыворотка должна иметь титр в РА не ниже 1000 ME, а РСК не ниже 1:20, однократно вводят животным-продуцентам в область подгрудка суспензию в объеме 5 мл, представляющую смесь бруцеллезного антигена (100 млрд м.к. убитой культуры штамма В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, на 18-20-й день проводят пробное крововзятие, а на 24-30-й день осуществляют двукратное взятие крови или осуществляют производственное кровопускание.

Предлагаемый способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки, позволяет снизить трудоемкость процесса изготовления сыворотки, а также максимально повысить противоэпидемическую безопасность этого процесса за счет гипериммунизации животных-продуцентов убитой культуры вакцинного штамма В.abortus 19 в сочетании с адъювантом, позволяющим стимулировать получение высоких титров антител даже при однократной гипериммунизации и брать кровь от животного-продуцента двукратно или осуществлять производственное кровопускание в течение с 24 по 30 день после гипериммунизации.

В качестве адъюванта применяли французский препарат MONTANIDE™ ISA 61 VG, производитель - фирма «SEPPIC». Готовый к использованию масляный адъювант для ветеринарных вакцин для производства эмульсий «вода в масле» содержит особое обогащенное светлое минеральное масло и высокоочищенное ПАВ, полученное из маннитола и очищенной олеиновой кислоты растительного происхождения. MONTANIDE™ ISA 61 VG не содержит компонентов животного происхождения. Рецептуры вакцин с MONTANIDE™ ISA 61 VG вызывают сильный и продолжительный иммунный ответ. По сравнению с традиционными масляными эмульсиями суспензия с MONTANIDE™ ISA 61 VG является устойчивой, стабильной и легко вводимой. Для приготовления 100 г вакцины обычно необходимо: MONTANIDE™ ISA 61 VG - 60 г и водной антигенной среды - 40 г. Стабильные эмульсии получаются путем смешивания водной среды в MONTANIDE™ ISA 61 VG, при комнатной температуре или ниже, при интенсивном перемешивании.

В качестве животных-продуцентов использовали, например, быков.

Заявленный результат достигается следующим путем: каждому здоровому быку-продуценту в возрасте 1,5-2 лет после предварительного исследования их на бруцеллез вводят однократно подкожно в области подгрудка суспензию в объеме 5 мл, представляющую собой смесь антигена (100 млрд м.к, убитой культуры штамма B.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG.

Сначала готовят антиген. Штамм В.abortus 19, используемый для приготовления антигена, по своим свойствам должен отвечать паспортным данным, описанным при изготовлении вакцины. Штамм В.abortus 19 высевают на одну из питательных сред эритритагар, среда Белобаба, МППГГА. После 3-4-суточного роста бактериальную массу шт. 19 смывают с ее поверхности фенолизированным физиологическим раствором. Полученную взвесь бруцелл доводят до концентрации 300-400 млрд микробных тел в 1,0 см³ по бруцеллезному стандарту мутности, сливают через двойной марлевый фильтр в колбы и прогревают на водяной бане при температуре 80°C в течение 60 минут, помешивая через каждые 5 минут. Затем ее проверяют на чистоту, стерильность путем засева на питательные среды (Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним / под ред. Т.С. Сайдулдина. - Алматы, 2007. - 433 с.).

Взвесь штамма В.abortus 19, используемая в качестве антигена, должна быть стерильной.

При комнатной температуре интенсивно перемешивают на магнитной мешалке взвесь убитой культуры вакцинного штамма В.abortus 19 с добавлением адъюванта MONTANIDE™ ISA 61 VG в соотношении 40 и 60% соответственно, т.е. для приготовления 100 мл суспензии необходимо 40 мл взвеси и 60 мл адъюванта. Быкам-продуцентам однократно вводят 5 мл суспензии, представляющей собой смесь антигена (100 млрд м.к. убитой культуры штамма В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG. На 18-20-й день проводят пробное крововзятие, а с 24 по 30 день, если достаточен уровень антител титр в РА не ниже 1000 ME, в РСК не ниже 1:20, осуществляют двукратное взятие крови из расчета 16-20 мл крови на 1 кг живой массы или производственное кровопускание. Сыворотку получают следующим образом: кровь от каждого быка-продуцента берут из яремной вены с соблюдением правил асептики и антисептики в отдельную стерильную емкость. После крововзятия емкость с кровью ставят в термостат при 37°C на 3-4 часа для отделения сыворотки, затем помещают в холодильник при 2-8°C на 2-е суток. Сыворотку от каждого быка-продуцента сливают отдельно в стерильные сосуды и консервируют 4%-ной сухой борной кислотой, после чего прогревают в водяной бане при температуре 50°C в течение 40 минут при постоянном перемешивании, затем ставят на 10 дней в холодильник при температуре 2-8°C.

Пробу сыворотки крови из каждой емкости подвергают проверке на стерильность путем высевов на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро и на активность в РА, РСК, РБП.

При условии стерильности и получении положительных результатов серологических реакций сыворотку смешивают в одну емкость для составления серии и расфасовывают.

Предлагаемый способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки позволяет снизить трудоемкость процесса изготовления сыворотки, а также максимально повысить противоэпидемическую безопасность этого процесса и брать кровь от каждого животного двукратно или осуществляют производственное кровопускание с 24-30 день после гипериммунизации.

Пример 1. Определение оптимальной схемы гипериммунизации животных-продуцентов для получения руцеллезной диагностической сыворотки.

В целях определения птимальной схемы гипериммунизации животных для получения бруцеллезной диагностической сыворотки для изучения были использованы схемы гипериммунизации животных (табл.1). Для этого сформировали 4 группы по 3 головы здоровых животных, предварительно исследованных на бруцеллез с отрицательными результатами и гипериммунизировали подкожным введением (п/к):

1-я группа - живой культурой В.abortus 19 в дозах 75, 120 и 150 млрд м.к. с интервалом 10 дней.

2-я группа - живой культурой бруцелл В.abortus 19 в дозах 50, 100 и 100 млрд м.к. с интервалом 10 дней.

3-я группа - однократно 5 мл суспензии - смесь антигена (50 млрд м.к убитой культуры В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG.

4-я группа - однократно 5 мл суспензии - смесь антигена (100 млрд м.к. убитой культуры В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG.

По результатам изучения оптимальной схемой гипериммунизации признана схема №4. При ее применении высокие титры антител практически не уступали таковым при использовании схемы №1 как на 20-й, так и на 30-й день после первого введения антигена. Однако при схеме №1 предусмотрено трехкратное использование больших доз живой культуры бруцелл, а при схеме №4 - лишь однократное введение 5 мл суспензии, представляющей смесь антигена (100 млрд м.к. убитой вакцинной культуры В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG.

Таблица 1. Средние титры антител у животных-продуцентов в разные сроки после их гипериммунизации по разным схемам №№ групп Гол. Схема гипериммунизации Сроки взятия крови после первого введения антигена через 10 дней через 20 дней через 30 дней средние титры средние титры средние титры РА РСК РА РСК РА РСК 1. 3 Живая культура В.abortus 19 п/к 75, 120 и 150 млрд м.к. с интервалом 10 дней 333,3 ME 1:26,6 1600 ME 1:80 1600 ME 1:160 2 3 Живая культура В.abortus 19 п/к 50, 100 и 100 млрд м.к. с интервалом 10 дней 333,3 ME 1:26,6 1600 ME 1:80 1000 ME 1:160 3 3 Однократно п/к 5 мл суспензии (смесь 50 млрд м.к. убитой культуры В.abortus 19 с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG) 200 ME 1:26,6 1600
ME 1:33,3 1333 ME 1:66,6 4 3 Однократно п/к 5 мл суспензии(смесь 100 млрд м.к. убитой культуры В.abortus 19 с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG) 266,6 ME 1:26,6 1600 ME 1:40 1600 ME 1:80

Пример 2. Изучение диагностической активности сывороток, полученных от быков-продуцентов, гипериммунизированных по разным схемам, через 6 месяцев их хранения

В сыворотках крови, полученных от быков-продуцентов, гипериммунизированных по разным схемам, определяли средние титры антител через 6 месяцев их хранения в сравнении со средними титрами антител через 30 дней после первого введения антигена (табл.2.).

Установлено, что средние титры антител у быков-продуцентов по схеме №4, предусматривающей лишь однократное введение 5 мл суспензии, представляющей смесь 100 млрд м.к. убитой вакцинной культуры В.abortus 19 с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, через 6 месяцев хранения сывороток не изменились и остались на высоком уровне (РА - 1166,7 ME и РСК 1:80). У животных, гипериммунизированных по трем остальным схемам (№№1-3), титры снизились.

Таблица 2 Средние титры антител в сыворотках крови быков-продуцентов, гипериммунизированных по разным схемам, через 30 дней после первого введения антигена и через 6 месяцев после их хранения №№ групп Гол Схема гипериммунизации Сроки взятия крови через 30 дней после первого введения антигена через 6 мес. хранения полученной сыворотки титры Титры РА РСК РА РСК 1 3 Живая культура В.abortus 19, п/к, 75, 120 и 150 млрд м.к. с интервалом 10 дней 1600 ME 1:160 666,6 ME 1:80 2 3 Живая культура В.abortus 19, п/к, 50, 100 и 100 млрд м.к. с интервалом 10 дней 1000 ME 1:160 933,3 ME 1:80 3 3 Однократно п/к 5 мл суспензии (смесь 50 млрд м.к. убитой культуры В.abortus 19 с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG) 1333 ME 1:66,6 1166,7 ME 1:60 4 3 Однократно п/к 5 мл суспензии (смесь 100 млрд м.к. убитой культуры В.abortus 19 с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61VG) 1600 ME 1:80 1166,7 ME 1:80

Таким образом, самым эффективным оказался способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки по схеме №4. Предлагаемая схема предусматривает однократное введение 5 мл суспензии, представляющей смесь 100 млрд м.к. убитой культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, позволяет решить задачу усовершенствования способа получения активной диагностической бруцеллезной сыворотки, по пути его упрощения и повышения гарантий противоэпидемической безопасности.

Литература

1. Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним. - Алматы, 2007. - 611 с.

2. Сыворотка диагностическая бруцеллезная аггютинирующая. ТУ-316-82 от 01.06.1982, утв. ГУ по производству бактериальных и вирусных препаратов МЗ СССР.

3. RU 2005781 C1, 15.01.1994. Штамм бактерий Brucella melitensis биовара I, используемый для получения поливалентной гипериммунной сыворотки к бруцеллам.

4. RU №2361610 C1, 20.07.2009 «Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки и диагностические наборы».

5. Технический бюллетень MONTANIDE™ ISA 61 VG.

Изобретение относится к области ветеринарии к диагностике инфекционных болезней, а именно бруцеллеза. Способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки включает однократное введение смеси антигена (100 млрд м.к. убитой культуры штамма В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG. На 18-20-й день проводят пробное крововзятие, а двукратное взятие крови от каждого животного-продуцента из расчета 16-20 мл крови на 1 кг живой массы или производственное кровопускание производят на 24-30-й день после гипериммунизации. Сыворотку от каждого животного-продуцента сливают отдельно в стерильные сосуды и консервируют добавлением 4%-ной сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 54-56°C в течение 40 минут при постоянном перемешивании, а затем ставят на 10 дней в холодильник при температуре 2-8°C. Затем пробу сыворотки крови подвергают проверке на стерильность, активность и специфичность. Сыворотка должна быть стерильной и иметь титр в РА не ниже 1000 МЕ, в РСК не ниже 1:20. Техническим результатом является снижение трудоемкости процесса и эпидемическая безопасность. 2 табл., 2 пр.

Способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки, включающий введение животным-продуцентам подкожно бруцеллезного антигена штамма В.abortus 19, отделене сыворотки, консервирование, расфасовку, проверку на стерильность и активность, сыворотка стерильная, имеет титр в РА не ниже 1000 ME, в РСК не ниже 1:20, отличающийся тем, что животным-продуцентам однократно вводят в области подгрудка суспензию в объеме 5 мл, представляющую собой смесь антигена (100 млрд м.к. убитой вакцинной культуры штамма В.abortus 19) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, на 18-20-й день проводят пробное крововзятие, а на 24-30-й день осуществляют двукратное взятие крови или производственное кровопускание.