СПОСОБ ОЦЕНКИ ВИРУЛЕНТНЫХ СВОЙСТВ S-ФОРМ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии и может быть использовано в ветеринарной диагностике научно-исследовательских и производственных лабораториях.

Известно определение вирулентности штаммов бруцелл на лабораторных животных (см. Мельниченко В. И. "Ускоренные методы идентификации бруцелл и проверки их вирулентных и иммуногенных свойств. Автореф. дисс.... к.в.н., М. , 1989, 22 с.). Способ основан на воспроизведении специфической септицемии у белых мышей линии С 57 В L /6, защитные функции которых блокированы циклофосфаном. Для этих целей используют мышей весом 14-16 г. Циклофосфан вводят в дозе 200 мг на 1 кг массы животного. Через 24 часа белых мышей заражают внутрибрюшинно взвесью изучаемой культуры в дозах: 1•10⁴, 1•10⁵, l•10⁶, 1•10⁷, 1•10⁸ микробных тел. Каждую дозу культуры испытывают на 10 белых мышах. Контролем служат белые мыши - зараженные, но не получившие циклофосфан. Результаты опыта учитывают в течение 14 суток. Показателем вирулентности служат сроки гибели мышей, количество погибших животных и доза бруцелл, от которой погибают все животные.

Однако данный способ не позволяет установить истинную причину гибели животных и производить дифференцированную оценку изменений во внутренних органах животных, как погибших, так и оставшихся живыми.

Известна внутрикожная проба исследуемой культуры на морских свинках (см. Коротич О. С., Голота Я.А. Определение вирулентных свойств возбудителя бруцеллеза.//Доповиди Украинской академии сельскогосподарских наук. Киев, 1958. Вып. 2. С. 62-64). Способ основан на том, что возбудитель бруцеллеза, независимо от его типовой принадлежности обладает способностью вызывать гнойно-некротические поражения кожи у морских свинок на месте его внутрикожного введения. Для этого густую взвесь бруцелл в дозе 0,1 милилитр вводят морским свинкам, внутрикожно в область живота. По характеру местной реакции, развивающейся на 5 7 сутки, судят о вирулентности культуры. При высокой вирулентности на месте инъекции образуется разлитой отек и инфильтрация, сопровождающаяся значительным выделением гноя и некрозом. При умеренной - развивается абцесс, при низкой отек, а при авирулентной культуре никаких изменений в тканях кожи не обнаруживается.

Однако данный способ отражает только токсичность бруцелл, но не характеризует их инвазивность, а также не позволяет выявить истинную причину возникающих изменений в тканях кожи.

Близким по технической сущности к заявляемому является способ определения вирулентности культур по минимальной заражающей дозе, которая соответствует наименьшему количеству бруцелл, вызывающему генерализованную форму инфекции к 30 суткам после заражения (см. Студенцов К.М. Бруцеллез животных. Научные и практические основы борьбы. Алма-Ата, "Кайнар", 1975. - С. 37-45). Для определения вирулентности используют 48-часовую культуру бруцелл, выращенную на обычно применяемых агаровых средах. При определении вирулентности культуры применяют несколько заражающих доз: 5, 10, 20, 50, 100, 1000 и т.д. микробных тел. Для каждой дозы берут не менее трех морских свинок. Заражают животных путем введения подкожно, в паховую область одного милилитра взвеси бруцелл в вышеуказанных дозах. Через 30 суток после заражения производят контрольный убой опытных животных с последующим бактериологическим высевом из взятых от них органов на элективные питательные среды. Если бруцеллезная культура вызвала генерализованную форму течения инфекции в минимальных заражающих дозах (10-20 микробных тел), то такая культура относится к вирулентной. Изучение патогенности бруцелл проводится только на морских свинках путем макро- и микроскопического осмотра органов тех животных, которые были в опытах определения вирулентности. При макроскопическом осмотре обращают внимание на размеры лимфатических узлов, селезенки, печени, а также на специфические поражения (некроз, специфические серовато-матовые точечные узелки, мелкие гнойнички, абсцессы, бугристая поверхность селезенки с неровными краями и измененной окраской). Обращается внимание на характер изменений в месте введения бруцелл.

Бактериологический способ допускает ошибку в определении вирулентности так, как полевые штаммы бруцелл плохо адаптируются к условиям исскуственных питательных сред, теряя при этом свою жизнеспособность (20% и более). И общая визуальная оценка макроскопического состояния органов не позволяет сделать объективного заключения о вирулентности исследуемой культуры и специфичности патологии.

Важную роль в объективности поставленного диагноза и прогнозировании эпизоотического и инфекционного процессов при бруцеллезе играет степень вирулентности культур бруцелл, циркулирующих в данных условиях. Многочисленные результаты лабораторных исследований, проведенные нами в предыдущие годы, свидетельствуют о том, что культуры бруцелл, обладают различной вирулентностью. Вместе с тем в начальных стадиях трансформации у типичных культур происходит изменение биохимических свойств, как внутри видов, так и биоваров, что затрудняет проводить их дифференциацию обычными общепринятыми методами исследований.

Задачей изобретения является повышение информативности, объективности и точности способа путем проведения гистологического исследования с последующей микрометрией лимфатических фолликулов коркового вещества. Способ включает в себя заражение лабораторных животных (морских свинок) минимальной заражающей дозой, контрольным убоем, выделением культуры бруцелл, гистологическим исследованием и дополнительным проведением микрометрии лимфатических фолликулов коркового вещества. При оценке вирулентности считают, что до 90 - авирулентный, до 138 - слабовирулентный, 140 и выше микрометров - вирулентный штамм бруцелл.

В организме лабораторных животных культуры бруцелл способны приживаться и вызывать ответную морфологически выраженную реакцию структур иммунокомпетентных органов, которую можно определить при помощи микрометрического метода. Учет реакции проводят по размеру фолликулов коркового вещества регионарных лимфатических узлов, выраженную в математических параметрах.

Пример 1.

Первой группе морских свинок, согласно методике, изложенной в книге Вершиловой П.А. Бруцеллез. М., 1961. С. 80, вводят подкожно заведомо известную высоковирулентную культуру штамма Brucella abortus 544, в дозе 10-100 микробных тел. Разведение культуры производят следующим образом: из основной милиардной суспензии культуры бруцелл в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности, делают десятикратные разведения, до получения необходимого количества микробных тел. Контроль за количеством бруцелл производят путем высева из пробирки, содержащей разведенную культуру, соответствующую 100 микробным телам, по 0,1 милилитру на три чашки Петри с агаром. Через 4-6 суток инкубирования в термостате при температуре 37^oС, подсчитывают число выросших колоний, которое соответствует числу живых бруцелл. Через 30 суток после введения исследуемой культуры, опытных животных подвергают контрольному убою с отбором регионарных лимфатических узлов для гистологического исследования и микрометрии. Для получения сравнительных данных с прототипом, согласно методике, описанной в книге Студенцова К.М. Бруцеллез животных. Научные практические основы борьбы. Алма-Ата. "Кайнар", 1975. С. 37-45, проводят бактериологическое исследование, с целью определения вирулентности культур. Отобранный для гистологического исследования материал фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина, с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. Окрашивание гистологических срезов проводят гематоксилинэозином. Микрометрические измерения лимфатических фолликулов производятся с использованием винтового окуляр микрометра "MOB-15-х". Размер лимфатических фолликулов складывается из суммы размеров коркового вещества и центра размножения.

В результате проведенных микрометрических измерений получены следующие размеры лимфатических фолликулов:
Свинка 157: 110,150,100,130,160,160,130,150,130,140 микрометров.

Свинка 158: 140,100, 110, 200,100,130,160,140,180,120 микрометров.

Свинка 159: 140, 200,130, 220, 200,140,160,140,120,180 микрометров.

Свинка 160: 140,160, 180, 100, 90, 120, 120, 180, 100, 120 микрометров.

Свинка 161: 100, 80, 110, 110, 140, 100, 80, 100, 100, 80 микрометров.

Свинка 162: 120, 180, 170, 180, 190, 220, 180, 120, 140, 200 микрометров.

Вычисление биометрических величин проводится по методике ускоренного способа количественного сравнения морфологических признаков (С.Б. Стефанов, Н.С. Кухаренко, 1988).

1. Вычисление средней арифметической величины производится по формуле:
М=X₁+X₂+_.....+Х_n/n;
где М - средняя арифметическая величина;
Х - показатели (вариант);
n - число измерений.

В первой опытной группе средняя арифметическая величина равна: 140.

2. Вычисление амплитуды (а), которая равна разности между максимальным и минимальным значениями вариант в исследуемых рядах:
А = 220 - 80 = 140.

3. Вычисление среднеквадратичной ошибки средней арифметической величины вариационного ряда производится по формуле:
m = A•J.

Значение коэффициента J находим в таблице Р.Б. Стрелкова, который равен 0,02781.

m = 140•0,02781 = 3,8.

Средняя арифметическая величина с ее среднеквадратичной ошибкой равна:
М + m = 140 + 3,8 микрометров.

Из таблицы видно, что у большинства подопытных животных наблюдалось генерализованное течение инфекции.

Пример 2.

Аналогично методике, описанной в примере 1, второй группе морских свинок, подкожно вводят заведомо известный слабовирулентный штамм Вrucella abortus 19. В результате микрометрических измерений, были получены следующие результаты:
Свинка 170: 98, 77, 113, 113, 122, 137, 118, 135, 132, 122 микрометров.

Свинка 171: 122, 122, 77, 118, 78, 137, 118, 113, 123, 112 микрометров.

Свинка 172: 138, 132, 122, 117, 118, 133, 98, 78, 118, 81 микрометров.

Свинка 174: 108, 107, 107, 107, 87, 84, 78, 76, 82, 83 микрометров.

Свинка 175: 85, 98, 78, 95, 81, 99, 107, 106, 107, 80 микрометров.

Свинка 176: 85, 87, 81, 97, 99, 77, 75, 80, 76, 82 микрометров.

Среднюю арифметическую величину вычисляем по формуле, изложенной в примере 1 и она равна 102.

Амплитуда равна: 138 - 76 = 62.

Среднеквадратическая ошибка: m = 62•0,02781 = 1,7.

Средняя арифметическая величина с ее среднеквадратической ошибкой второй опытной группы равна: M + m = 102 + 1,7.

Пример 3.

Аналогично методике, описанной в первом примере, третью группу свинок, подкожно заражают полевым штаммом Brucella rangiferi 33 с неизвестными вирулентными свойствами. При микрометрических исследованиях получены следующие результаты:
Свинка 183: 160, 160, 170, 150, 140, 150, 130, 130, 140, 200 микрометров.

Свинка 184: 200, 120, 160, 120, 190, 120, 100, 160, 160, 120 микрометров.

Свинка 185: 140, 180, 120, 180, 160, 200, 200, 240, 140, 170 микрометров.

Свинка 186: 180, 130, 150, 160, 110, 140, 80, 100, 100, 180 микрометров.

Свинка 187: 140, 150, 150, 120, 80, 140, 200, 130, 160, 120 микрометров.

Свинка 188: 180, 150, 120, 120, 150, 170, 80, 100, 100, 130 микрометров.

Средняя арифметическая величина равна: 144.

Амплитуда равна: 240 - 80 = 160.

Среднеквадратическая ошибка: m = 160•0,02781 = 4,4.

Средняя арифметическая величина с ее среднеквадратической ошибкой третьей опытной группы равна: М + m = 144 + 4,4
Из представленных в таблице результатов следует, что обработанные данные предложенным способом соответствуют с данными, описанными в первом примере, и подтверждают точность предложенного способа, по сравнению с прототипом.

Пример 4.

Согласно методике, изложенной в первом примере, четвертую группу свинок заражают полевым штаммом Brucella rangiferi 204 с неизвестными вирулентными свойствами. При микрометрических исследованиях получены следующие результаты:
Свинка 177: 120, 140, 120, 130, 140, 160, 120, 160, 160, 100 микрометров.

Свинка 178: 120, 140, 100, 160, 220, 200, 220, 130, 100, 160 микрометров.

Свинка 179: 200, 180, 120,180,160,120,160,170,160,100 микрометров.

Средняя арифметическая величина равна: 153.

Амплитуда равна: 220 - 100 = 120.

Среднеквадратическая ошибка: m = 120•0,04545 = 5,4.

Средняя арифметическая величина с ее среднеквадратической ошибкой четвертой опытной группы равна: М + m = 153 + 5,4.

Из представленных в таблице результатов следует, что обработанные данные предложенным способом соответствуют данным, приведенным в первом примере, и подтверждают точность предложенного способа по сравнению с прототипом.

Пример 5.

Согласно методике, изложенной в первом примере, пятую группу свинок заражают полевым штаммом Brucella rangiferi 181 с неизвестными вирулентными свойствами. При микрометрических исследованиях получены следующие результаты:
Свинка 139: 180, 200, 140, 160, 220, 120, 120, 160, 160, 160 микрометров.

Свинка 140: 140, 160, 160, 120, 180, 170, 180, 80, 100, 140 микрометров.

Свинка 141: 230, 100, 200, 180, 120, 200, 100, 120, 140, 200 микрометров.

Средняя арифметическая величина равна: 155.

Амплитуда равна: 230 - 80 = 150.

Среднеквадратическая ошибка: m = 150•0,04545 = 6,8.

Средняя арифметическая величина с ее среднеквадратической ошибкой пятой опытной группы равна: М + m = 155 + 6,8.

Из представленных в таблице результатов следует, что обработанные данные предложенным способом соответствуют данным, приведенным в первом примере, и подтверждают точность предложенного способа по сравнению с прототипом.

Пример 6.

Аналогично выше изложенным примерам, проводили микрометрические измерения лимфатических фолликулов коркового вещества у контрольных животных, которым вводился изотонический раствор хлорида натрия, в объеме 1 милилитр. В результате проведенных исследований были получены следующие результаты:
Свинка 173: 65, 62, 74, 82, 67, 87, 87, 84, 89, 90 микрометров.

Свинка 181: 65, 76, 84, 79, 66, 72, 87, 77, 61, 77 микрометров.

Свинка 182: 86, 74, 62, 83, 80, 71, 79, 72, 81, 70 микрометров.

Средняя арифметическая величина равна: 76,3.

Амплитуда равна: 90 - 61 = 29.

Среднеквадратическая ошибка: m =29•0,04545 = 1,3.

Средняя арифметическая величина с ее среднеквадратической ошибкой шестой контрольной группы равна: М + m = 76,3 + 1,3.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что предлагаемое изобретение повышает точность и информативность способа оценки вирулентности S-форм бруцелл по сравнению с известными способами.

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии. После заражения подопытного животного вирулентным штаммом бруцелл, контрольным убоем, проведения гистологического исследования, отбирают регионарные лимфатические узлы для последующей микрометрии лимфатических фолликулов коркового слоя. При оценке вирулентности считают, что до 90 - авирулентный, до 138 - слабовирулентный, 140 и выше микрометров - высоковирулентный штамм бруцелл. Изобретение обеспечивает повышение точности и информативности оценки вирулентности S-форм бруцелл. 1 табл.

Способ оценки вирулентных свойств S-форм бруцелл, включающий заражение лабораторных животных минимальной заражающей дозой с последующим контрольным убоем и исследованием изменений в структуре иммунокомпетентных органов, отличающийся тем, что проводят гистологическое исследование и микрометрию лимфатических фолликулов коркового вещества: до 90 мкм - авирулентный, до 138 -слабовирулентный, 140 и выше - высоковирулентный штамм бруцелл.