СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ЖИВЫХ ВАКЦИН ИЗ RS (SR) ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2010 года по МПК A61K38/00 A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к способу усиления иммунного ответа при вакцинации животных против бруцеллеза.

Известен способ вакцинации животных против бруцеллеза путем введения вакцины из штамма Brucella abortus 82 - Наставление по применению сухой живой вакцины из штамма 82 бруцелла абортус против бруцеллеза крупного рогатого скота (Утверждено Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства от 17 октября 1985 г.).

Однако вакцина из шт.82 Brucella abortus состоит из RS (SR) клеток бруцелл (диссоциант), которая на неподготовленном (ранее не иммунном) взрослом поголовье (крупный рогатый скот), а также при пониженной резистентности и при других иммунодефицитных состояниях, может менять свои первоначальные свойства и переходить из RS формы в R, L или S-форму, что, в свою очередь, может изменить иммуногенные свойства препарата.

Из штамма 82 получен новый вакцинный штамм В.abortus 75/79, эта вакцина из штамма 75/79АВ В.abortus, по данным ряда авторов, имеет преимущество перед вакциной из штамма B.abortus82. Она не абортогенна, остаточная вирулентность в 100 раз ниже, посвакцинальные реакции исчезают через 3 месяца после иммунизации. Также штамм 75/79АВ В.abortus не мигрирует на неиммунный скот при совместном содержании.

Известно,что (см.. патент №93031429, МПК А61К 39/10 от 06.08.1993 «Способ профилактики бруцеллеза у крупного рогатого скота», авторы: Александров И.Д. и др.) животных в 20-30-суточном возрасте иммунизируют вакциной из штамма Бруцелла Абортус 82 с последующим, через 14-21 сутки, введением подкожно Т-активина в дозе 4 мкг/кг и Б-активина в дозе 6 мг, однократно в сутки, в течение трех суток, с последующим, через 12 месяцев, серологическим исследованием, и ревакцинацией той же вакциной в той же дозе серологически отрицательно реагирующих животных. Это повышает иммуногенные свойства вакцины. Однако предложенный способ трудоемкий, требует много затрат рабочей силы и времени.

Наиболее близким аналогом выбран (см. Сборник научных трудов. Туберкулез и бруцеллез сельскохозяйственных животных: методы и средства диагностики и профилактики, статья Способ повышения напряженности иммунитета при бруцеллезе, Новосибирск, 1994, с.32-36, А.П.Красиков, О.Н.Иванова).

Авторами проводились исследования иммуногенности вакцины из штамма 82 B.abortus в сочетании с иммуномодулятором ковидон. На основании бактериологических исследований установлено, что иммуномодуляторы повысили напряженность иммунитета у животных на 25% к исходным группам, привитым только вакциной. При этом в контрольных группах заразились все животные.

Однако вакцина из штамма 82 в сочетании с иммуномодулятором ковидоном создает иммунитет только у 75% иммунных животных.

Задачей изобретения является повышение напряженности иммунитета, которая достигается использованием противобруцеллезных вакцин из RS-(SR) штаммов бруцелл (например, штаммы 82 и 75/79 - АВ Brucella abortus, находящихся в RS (SR) форме) в сочетании с иммуномодулирующим средством - имунофаном, который вводят одновременно с вакциной в дозе 0,3-0,4 мл/гол.,

Иммуномодулятор имунофан в гуманитарной медицине применяют у взрослых и детей старше двух лет для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний различной этиологии. У взрослых - в качестве адъюванта при вакцинации против бактериальных и вирусных инфекций (разовая суточная доза - 50 мкг в 1 мл (О.А.Мирошник, Ю.В.Редькин (2006)).

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1.

Для проведения опытов были отобраны здоровые морские свинки весом 250-300 г и сформировано 9 групп лабораторных животных.

Животных первой группы иммунизировали противобруцеллезной вакциной из шт. 82 Brucella abortus, второй - 82 + ксимедон, третьей - 82 + полирибонат, четвертой - 82 + имунофан, пятой - вакцину из шт. 75/79-АВ Brucella abortus, шестой - 75/79 + ксимедон, седьмой - 75/79 + полирибонат, восьмой - 75/79 + имунофан. Девятая группа служила контролем (плацебо-группа). Иммуногенность определяли через 1 месяц после вакцинации.

Морским свинкам первой группы вводили подкожно с внутренней поверхности бедра (справа) суспензию 2-суточной агаровой культуры вакцинного штамма 82 в дозе 1 млрд микробных клеток, в объеме 1 см³, которую предварительно суспендировали в физиологическом растворе.

Иммуномодулятор ксимедон используется в ветеринарной практике для коррекции резистентности организма животных при первичных и вторичных иммунодефицитах; для повышения иммунобиологических свойств вакцинных препаратов и лечебной активности лекарственных средств (Наставление по применению ксимедона. Утверждено в порядке производственного опыта по применению ксимедона в качестве иммуностимулятора при вакцинации животных против инфекционных болезней, рекомендация 044-3/22, 1991).

Иммуномодулятор полирибонат применяется в ветеринарной практике для стимуляции неспецифической резистентности и повышения эффективности вакцинации (каталог «Медицинские и ветеринарные препараты». НИКТИ БАВ, 1999).

Иммуногенность у привитых морских свинок проверяли путем заражения 2-суточной агаровой вирулентной культурой штамма В.abortus 544 в дозе 100 микробных клеток (10 инфицирующих доз), в объеме 1 см³. Суспензию клеток бруцелл вводили подкожно с внутренней поверхности бедра, с противоположной стороны места введения вакцины (слева).

Через 30-35 дней после заражения морских свинок подвергли убою и бактериологическому исследованию, которое включало посевы из лимфатических узлов: заглоточных, подчелюстных, предлопаточных, паховых, пара-аортальных, а также из печени, селезенки, почек, сердца и костного мозга. Посевы проводили в одну пробирку с бульоном (МППБ) и в две пробирки с агаровой питательной средой: МППА, эритрит-агар. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37-38°С в течение 4 недель, в период которых периодически проводили учет роста бактериальных культур. При учете результатов бактериологического исследования проводили дифференциацию выросших культур (определение принадлежности к роду бруцелл) путем окраски (по Козловскому, Уайту и Вилсону) и микроскопии, постановки реакции агглютинации на стекле с гипериммунной сывороткой в разведении 1:10. Животное считалось заразившимся, если хотя бы из одного органа высевалась культура бруцелл. Результаты бактериологического исследования оценивали по количеству свинок, от которых выделены культуры (процент заразившихся животных), по количеству культур на одну заразившуюся свинку и по интенсивности обсеменения (инфицированность) организма животных, которую вычисляли по следующей формуле:

,

где х - индекс инфицированности (ИИ);

а - число выделенных культур;

в - число морских свинок в опыте;

с - число органов и лимфатических узлов, взятых для посева.

Данные оценки иммуногенности представлены в таблице 1.

Таблица 1 Показатели иммуногенности противобруцеллезных вакцин, выявленных путем экспериментального заражения животных вирулентным штаммом Brucella abortus 544 через 1 месяц после иммунизации (опыт 1) №п/п Характеристика препаратов, используемых для иммунизации Кол-во животных в опыте Заразилось, голов Выделено культур заражающего штамма (шт.544) Индекс инфицированности Иммуногенность, % 1 Вакцина из шт.82 5 1 1 2 80 2 Вакцина из шт. 82 + ксимедон 5 1 1 2 80 3 Вакцина из шт. 82 + полирибонат 5 0 0 0 100 4 Вакцина из шт. 82 + имунофан 5 0 0 0 100 5 Вакцина из шт. 75/79-АВ 5 1 4 8 80 6 Вакцина из шт. 75/79-АВ + ксимедон 5 1 4 8 80 7 Вакцина из шт. 75/79-АВ + полирибонат 5 0 0 0 100 8 Вакцина из шт. 75/79-АВ + имунофан 5 0 0 0 100 9 Контроль 5 5 33 66 0

Из таблицы 1 видно, что иммуногенность вакцин из штамма 82 и 75/79-АВ Brucella abortus через 1 месяц после вакцинации снижается на 20% и составляет 80% (группы 1 и 5).

Сочетанное применение вакцины из штамма 82 и 75/79-АВ с ксимедоном (группы 2 и 6) не повышает иммуногенность вакцинного препарата.

Применение вакцины из штамма 82 и 75/79-АВ в сочетании с полирибонатом (группы 3 и 7) и имунофаном (группы 4 и 8) повышает иммуногенные свойства вакцинных препаратов на 20% и составляет 100%.

По результатам первого опыта были отобраны иммуномодуляторы полирибонат и имунофан для определения иммуногенности через 6 месяцев.

Пример 2.

Для проведения опытов были отобраны здоровые морские свинки весом 250-300 г и сформировано 4 группы животных. Морских свинок первой группы иммунизировали вакциной из шт.82, второй - 82 + полирибонат, третьей - 82 + имунофан. Морских свинок четвертой группы иммунизировали вакциной из шт.75/79-АВ, пятой - 75/79-АВ + полирибонат, шестой - 75/79-АВ + имунофан. Седьмая группа служила контролем (плацебо-группа).

Вакцинацию животных проводили аналогично первому опыту. Заражение морских свинок и определение иммуногенности осуществляли через 6 месяцев аналогично первому опыту.

Данные оценки иммуногенности представлены в таблице 2.

Таблица 2 Показатели иммуногенности противобруцеллезных вакцин, выявленных путем экспериментального заражения животных вирулентным штаммом Brucella abortus 544 через 6 месяцев после иммунизации (опыт 2) № п/п Характеристика препаратов, используемых для иммунизации Кол-во животных в опыте Заразилось, голов Выделено культур заражающего штамма (шт.544) Индекс инфицированности Иммуногенность, % 1 Вакцина из шт.82 4 2 2 5 50 2 Вакцина из шт. 82 + полирибонат 6 2 5 8,3 66,7 3 Вакцина из шт. 82 + имунофан 5 0 0 0 100 4 Вакцина из шт. 75/79-АВ 4 2 9 22,5 50 5 Вакцина из шт. 75/79-АВ + полирибонат 5 2 4 8 60 6 Вакцина из шт. 75/79-АВ + имунофан 4 0 0 0 100 7 Вакцина из шт. 82 + ковидон (прототип) 4 1 5 12,5 75 8 Контроль 4 4 29 73 0

Из таблицы 2 видно, что иммуногенность вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ Brucella abortus через 6 месяцев после вакцинации снизилась в 2 раза и составила 50% (группы 1 и 4).

Иммуногенность вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ в сочетании с полирибонатом (группы 2 и 5) снизилась на 33,3% и 40% и составила 66,7% и 60% соответственно.

Иммуногенность вакцины из штамма 82 в сочетании с ковидоном (прототип) (группа 7) снизилась на 25% и составила 75%.

Иммуногенность вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ в сочетании с и имунофаном (группы 3 и 6) через 6 месяцев не снижалась и составила 100%.

Таким образом, применение вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ в сочетании с имунофаном (группы 3 и 6) через 6 месяцев сохраняет иммуногенность вакцинного препарата до 100% и повышает специфический противобруцеллезный иммунитет у животных в 2 раза.

Пример 3.

Отработка дозы введения имунофана максимально повышающей иммуногенность вакцины из штамма 82 Brucella abortus.

Для проведения опытов были отобраны здоровые морские свинки весом 250-300 г и сформировано 7 группы животных. Морских свинок первой группы иммунизировали вакциной из шт. 82, второй - 82 + имунофан в дозе 0,1 мл, третьей - 82 + имунофан в дозе 0,2 мл, четвертой - 82 + имунофан в дозе 0,3 мл, пятой - 82 + имунофан в дозе 0,4 мл. Шестая группа служила контролем (плацебо-группа).

Вакцинацию животных проводили аналогично первому опыту. Заражение морских свинок и определение иммуногенности осуществляли через 1 месяц также по аналогии первого опыта.

Данные оценки иммуногенности представлены в таблице 3.

Таблица 3 Показатели иммуногенности противобруцеллезных вакцин, выявленных путем экспериментального заражения животных вирулентным штаммом Brucella abortus 544 через 1 месяц после иммунизации (опыт 3) № п/п Характеристика
препаратов,
используемых для
иммунизации Кол-во животных в опыте Заразилось, голов Выделено
культур
заражающего
штамма
(шт.544) Индекс инфицированности Иммуногенность,
% 1 Вакцина из шт.82 5 1 2 4 80 2 Вакцина из шт. 82 + имунофан в дозе 0,1 мл 5 1 8 16 80 3 Вакцина из шт. 82 + имунофан в дозе 0,2 мл 5 1 4 8 80 4 Вакцина из шт. 82 + имунофан в дозе 0,3 мл 5 0 0 0 100 5 Вакцина из шт. 82 + имунофан в дозе 0,4 мл 5 0 0 0 100 6 Контроль 5 5 38 76 0

Из таблицы 3 видно, что иммуногенность вакцины из штамма 82 Brucella abortus без иммуномодулятора через 1 месяц после вакцинации снизилась на 20% и составила 80% (группа 1).

Иммуногенность вакцины из штамма 82 в сочетании с имунофаном в дозах 0,3 и 0,4 мл на голову (группы 4 и 5) через 1 месяц не снизилась и составила 100%.

Таким образом, доза имунофана 0,3-0,4 мл на голову является оптимальной для повышения иммуногенности вакцины.

Пример 4.

Отработка режима применения имунофана.

Для проведения опытов были отобраны здоровые морские свинки весом 250-300 г и сформировано 4 группы животных. Морских свинок первой группы иммунизировали вакциной из шт. 82, второй - 82 + имунофан в дозе 0,3 мл (иммуномодулятор иммунофан вводили за 7 суток до вакцинации), третьей - 82 + имунофан в дозе 0,3 мл (иммуномодулятор имунофан вводили вместе с вакциной). Четвертая группа служила контролем (плацебо-группа).

Вакцинацию животных проводили аналогично второму опыту. Заражение морских свинок и определение иммуногенности осуществляли через 6 месяцев также по аналогии второго опыта.

Данные оценки иммуногенности представлены в таблице 4.

Таблица 4 Показатели иммуногенности противобруцеллезных вакцин, выявленных путем экспериментального заражения животных вирулентным штаммом Brucella abortus 544 через 6 месяцев после иммунизации (опыт 4) № п/п Характеристика
препаратов,
используемых для
иммунизации Кол-во животных в опыте Заразилось, голов Выделено
культур
заражающего
штамма
(шт.544) Индекс инфицированности Иммуногенность,
% 1 Вакцина из шт. 82 5 2 10 20 60 2 Вакцина из шт. 82 + имунофан (имунофан вводили животным за 7 суток до вакцинации) 5 0 0 0 100 3 Вакцина из шт. 82 + имунофан (одновременное введение имунофана) 5 0 0 0 100 4 Контроль 5 5 25 50 0

Из таблицы 4 видно, что иммуногенность вакцины из штамма 82 Brucella abortus через 6 месяцев после вакцинации снизилась на 40% и составила 60% (группа 1).

Иммуногенность вакцины из штамма 82 при введении иммуномодулятора имунофана за 7 суток до вакцинации (группа 2) не снизилась и составила 100%.

Иммуногенность вакцины из штамма 82 в сочетании с одновременным введением имунофана (группа 3) через 6 месяцев не снизилась и составила 100%.

С целью сокращения трудоемкости вакцинации рекомендуем имунофан вводить одновременно с вакциной.

Способ заключается в том, что используют вакцины из штаммов 82 Brucella abortus и 75/79-АВ Brucella abortus, находящихся в RS-(SR) форме в сочетании с иммуномодулятором иммунофаном. При этом иммунофан вводят одновременно с вакциной в дозе 0,3-0,4 мл на морскую свинку. Способ повышает специфический бруцеллезный иммунитет у животных в 2 раза и через 6 месяцев сохраняет иммуногенность вакцинного препарата до 100%. 4 табл.

Способ повышения иммуногенности вакцины, заключающийся в том, что используют вакцины из штаммов 82 Brucella abortus и 75/79-АВ Brucella abortus, находящихся в RS-(SR) форме в сочетании с иммуномодулятором иммунофаном, который вводят одновременно с вакциной в дозе 0,3-0,4 мл на морскую свинку.