СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ Российский патент 1996 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК), и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ изготовления лиофилизированной тканевой инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов (Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов тканевой инактивированной лиофилизированной, утвержденная директором ВНИИВВиМ 02.01.91).

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов. Также подана заявка N 5043431 от 26.05.92, авторы Шевченко А.А. и другие.

В качестве вирусного сырья используют 20%-ную суспензию печени кроликов, павших после заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов на забуференном физрастворе (рН 7,2). Полученную суспензию выдерживают при 20^оС в течение 3 ч, от клеточного детрита освобождаются центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин (общее количество белка не более 5 мг/мл). Недостаток сливают в реактор и инактивируют 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазатрициклодекан- ом из расчета 1 г вещества на 1000 мл вирусного сырья в течение 48 ч при температуре 27^оС при периодическом перемешивании. Затем сырье осветляют добавлением 1 ч. хлороформа на 5 ч. сырья, выдерживают 10 ч при температуре 20^оС. Для сохранения нативных свойств в качестве стабилизирующей защитной среды используют стабилизатор, который включает: лактозу ТУ 6-09-2293-75 50,0 г, пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76 50,0 г, калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75 1,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493-65 5,2 г, на 1 л дистиллированной волы рН 7,2 ГОСТ 6709-72.

Затем 1 ч. стабилизатора смешивают с 2 ч. инактивированного материала, тщательно смешивают и фасуют при помощи дозатора (АГ-5) в стерильные флаконы или ампулы по 2,0 мл и проводят лиофилизацию при вакууме 80 мкм. Для этого замораживают материал при минус 45^оС в течение 10 ч, выдерживают при температуре от минус 45 до 0^оС в течение 22 ч. Затем доводят температуру до 20^оС в течение 3 ч и досушивают 3 ч. Весь цикл лиофилизации составляет 28 ч. Укупорка флаконов или запайка ампул проводятся под вакуумом.

Такая инактивированная тканевая вакцина против ВГБК не вызывает поствакциональных осложнений, иммунитет формируется на 3и сутки при внутримышечном введении (0,5 мл) продолжительностью 12 месяцев. Вакцина стабильна при длительном хранении.

Однако при изготовлении указанной вакцины требуется в 2-43 раза больше кроликов, для инактивации используется химический инактиватор (1,8,3,6-диэндо- метилен-1,3,6,8-тетраазатрициклодекан), который нейтрализации не поддается, инактивация проводится в течение длительного времени (2-3 сут.), при осветлении применяют хлороформ, который не безвреден для работающих. Вакцина применяется только внутримышечно в объеме 0,5 мл.

Предлагаемый способ изготовления вакцины устраняет перечисленные недостатки.

Задача изобретения изготовление высокоактивной инактивированной вакцины против ВГБК, стабильной при хранении.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что используется 25-30% -ная суспензия печени кроликов, павших от ВГБК, на забуференном растворе (рН 7,2). Проводят двукратное экстрагирование вируса в течение 20-48 ч при температуре 6± 2^оС при периодическом перемешивании и фильтрование через стерильный ватно-марлевый фильтр. Инактивацию вирусного сырья проводят при температуре 60^оС в течение 5-6 ч.

Стабилизацию материала осуществляют внесением 5%-ного лактозы и 1%-ной желатины в соотношении 1:1 материала и стабилизатора.

Лиофилизируют по ранее предложенному режиму.

Для изготовления вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов массой 2,5 кг и выше, заражают их вирусом ГБК (регистрационный номер 1652 в коллекции ВГНКИ) с инфекционной активностью 10^3,0 ЛД 50/мл. Через 24-72 кролики погибают, от них берут печень, замораживают, пропускают через мясорубку, фарш размалывают в гомогенизаторе. Полученный материал доводят физраствором рН 7,2 до 30%-ной суспензии, экстрагируют вирус в течение 20 ч при 6^оС, декантируют надосадок, а к осадку добавляют физраствор 1:2 и повторно экстрагируют в течение 20 ч при периодическом перемешивании.

От клеточного и тканевого детрита освобождаются путем фильтрования через стерильный ватно-марлевый фильтр. Результаты представлены в табл.1.

Из табл. 1 видно, что использование 30%-ной суспензии печени, двукратное экстрагирование вируса, освобождение от клеточного детрита фильтрованием через ватно-марлевый фильтр позволяют увеличить выход вирусного сырья в 2 раза при изготовлении вакцины по предлагаемому способу по сравнению с прототипом. Отфильтрованный материал сливают в емкость и инактивируют в водяной бане при температуре 60^оС в течение 5 ч при периодическом перемешивании. Результаты представлены в табл.2.

Из табл.2 видно, что наилучшей температурой для инактивации вируса является 60^оС, активность при этом снижается только на порядок. Такой режим инактивации при 60^оС в течение 5 ч позволяет полностью обеспечить патогенность вируса и сохранить иммуногенные свойства.

Для сохранения исходных свойств в качестве стабилизирующей защитной среды используют смесь 5%-ной лактозы и 1%-ной желатины. Затем инактивированный материал смешивают со стабилизирующей средой в соотношении 1:1, тщательно перемешивают и с помощью дозатора (АГ-5) фасуют по 2,0 мл в стерильные ампулы, замораживают и лиофилизируют по принятому режиму. Результаты представлены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что использование в качестве стабилизирующей защитной среды 5%-ной лактозы и 1%-ной желатины, смешанных с материалом в соотношении 1: 1, позволяет сохранять исходные свойства вакцины в течение 3-6 месяцев хранения. Применение по предложенному способу различными методами введения (внутримышечно, подкожно, внутрикожно) в дозах 0,20-0,50 мл не вызывает у животных поствакцинальных осложнений, иммунитет формируется на 3 сут, и защита после контрольного заражения вирулентным вирусом составляет 90-100%
Результаты по сравнительной характеристике вакцин против ВГБК представлены в табл. 4.

Таким образом, предлагаемое двукратное экстрагирование вируса, освобождение от клеточного детрита позволяют повысить выход сырья в 2 раза, инактивирование вируса при температуре 60^оС в течение 5 ч позволяет подавить вирулентность и сохранить иммуногенные свойства.

Использование в качестве защитной среды 5%-ной лактозы и 1%-ной желатины сохраняет биологические свойства лиофилизированного препарата и стабильность при хранении.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Область применения: биотехнология. Сущность способа заключается в том, что используется 25 - 30%-ная суспензия печени кроликов, павших от вирусной геморрагической болезни кроликов, на забуференном растворе (pH 7,2). Проводят двукратное экстрагирование вируса в течение 20 - 48 ч при температуре 6 ± 2^oС при периодическом перемешивании и фильтрование через стерильный ватно-марлевый фильтр. Инактивацию вирусного сырья проводят при температуре 60^oС в течение 5 ч. Стабилизацию материала осуществляют внесением 5%-ной лактозы и 1%-ной желатины в соотношении 1 : 1 материала и стабилизатора, после чего лиофилизируют. 4 табл.

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ, включающий приготовление суспензии печени кроликов, павших после заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни, ее инактивацию, лиофилизацию, отличающийся тем, что суспензию готовят 25 - 30%-ной перед инактивацией суспензию дважды экстрагируют в течение 20 - 48 ч при 6^oС, инактивацию проводят при 60^oС в течение 5 ч, после чего суспензию стабилизируют равным количеством смеси 5%-ной лактозы и 1%-ной желатины на забуференном физиологическом растворе рН 7,2.