СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ, ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ И НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способу получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК) и набору для диагностики болезни, и может быть использовано в научных, производственных лабораториях и предприятиях биологической промышленности.

Известны способы получения специфического антигена ВГБК и специфической сыворотки для практического применения в реакции гемагглютинации (РГА), реакции задержки гемагглютинации (РЗГА), реакции преципитации в агаровом геле (Kiepkerch, Diss. Hannover, 1990-65 S; Villares G.L.А. Rev. Sci. tech. Off int Еpir, 1991, 10 (2), 471 480; Ohlinger V.F. et al Fierarzfl Umschau. 1989
Вb. 44, 5 S 284 294; Soike D. et al Mh. Vet Med. 1989 Bd. 41, 11 - S 376 378).

Имеющиеся отрывочные литературные данные реферативного характера не позволяют судить о технологии получения сыворотки против ВГБК и использования ее для лечения, профилактики и изготовления набора для диагностики этой болезни.

В нашей стране подобных исследований не обнаружено.

Целью предполагаемого изобретения является получение высокоактивной специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики и изготовление набора для диагностики ВГБК.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что специфическую сыворотку получают от кроликов массой не менее 2,5 кг, вакцинированных одно- или двукратно с интервалом в 14 дней коммерческой вакциной против ВГБК. Спустя 14 дней после первой вакцинации, животных заражают вирулентным вирусом ГБК или ревакцинируют. Затем обескровливают и получают сыворотку с активностью в РЗГА от 1:256 до 1:4096, в РДСК 1:32 1:1024.

Набор для диагностики ВГБК содержит емкости со специфической и нормальной сыворотками, специфическим и нормальным антигенами и эритроцитами человека. Набор используют для выявления антигена в РГА и РДСК, антител в РЗГА и РДСК.

Для получения высокоактивной специфической сыворотки по первой схеме используют клинически здоровых кроликов массой не менее 2,5 кг любой породы, полученных из благополучных хозяйств по инфекционным и инвазионным болезням кроликов. Животных вакцинируют согласно наставлению коммерческой инактивированной вакциной. Спустя 14 дней, кроликов заражают вирулентным вирусом ГБК штамм "Воронежский 87" (регистрационный 1652 в коллекции ВГНКИ) в дозе 1000 ЛД 50/см³ и через 10 дней проводят тотальное обескровливание.

По второй схеме кроликов иммунизируют согласно наставлению коммерческой инактивированной вакциной двукратно с интервалом в 14 дней. Через 14 дней после повторной вакцинации обескровливают. Кровь от животных берут с соблюдением правил асептики. Флаконы с кровью помещают на 30 40 минут в термостат при температуре 37^oC, затем в холодильник при температуре 6^oC. Через 12 часов сыворотку сливают и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут. Сыворотку отбирают и инактивируют в водяной бане при температуре 60^oC в течение 2-х часов и хранят при температуре не менее 20^oC или фасуют в ампулы или флаконы и подвергают лиофилизации. Активность специфической сыворотки против ВГБК представлена в таблице 1.

Данные таблицы 1 показывают, что предложенные обе схемы позволяют получать высокоактивную специфическую сыворотку против ВГБК. По третьей схеме получают сыворотку против ВГБК от 1:64 до 1:256.

Согласно первой схеме, можно в производственных условиях биофабрик при испытании эффективности коммерческих серий вакцин получать дополнительно сыворотку без затрат. Это позволяет снизить себестоимость коммерческих препаратов за счет использования 100% опытных животных (выжившие после контрольного заражения вирулентным вирусом ГБК и не заболевшие животные при получении антигена).

Вторая схема получения сыворотки позволяет получить специфическую сыворотку в условиях хозяйства и биофабрик без затрат на обеспечение безопасности работ по выносу вирулентного возбудителя.

Полученную специфическую сыворотку против ВГБК проверяют на кроликах, свободных от антител к вирусу ГБК, на профилактическое и лечебное действие.

Для оценки профилактического действия специфической леофилизированной сыворотки готовят среднюю пробу из 5 ампул, ресуспендируют каждую в 5 см³ стерильного физиологического раствора рН 7,2. Из 3-х флаконов нативной сыворотки берут по 5 см³ и объединяют. Из общей смеси каждой серии сыворотку вводят 20 кроликам по 0,5 см³, подкожно, однократно по 5 голов на серию. Для контроля берут 3 кролика. Через 24 часа после введения специфической сыворотки всех животных заражают вирулентным вирусом ГБК в дозе 1000 ЛД 50/см³. Наблюдение за животными ведут в течение 20 суток. Через 30 48 часов кролики в контрольной группе погибают с характерными клиническими и патологоанатомическими изменениями для ВГБК. Наличие вируса подтверждают в РГА. Кролики, которым перед заражением вводили специфическую сыворотку, остаются живыми и здоровыми (таблица 2).

Из данных таблицы 2 видно, что однократное подкожное введение специфической нативной или лиофилизированной сыворотки в дозе 0,5 см³ защищает кроликов от вирулентного вируса ГБК.

Также подтверждено лечебное действие специфической сыворотки против ВГБК. Для этого берут 23 кролика массой не менее 2,5 кг, свободных от антител к вирусу ГБК, заражают вирулентным вирусом ГБК штамм "Воронежский 87" в дозе 1000 ЛД 50/см³. Через 20 часов, после развития клинических признаков ВГБК (угнетение, отказ от корма, взъерошенность и т.д.), 10 кроликам вводят лиофилизированную специфическую сыворотку серии 1 и 2 ( предварительно разведенную 1: 5 cтерильным физраствором) по 0,5 см³ подкожно однократно. Другим 10 кроликам вводят по 0,5 см³ подкожно однократно нативную сыворотку серии 1 и 2. На каждую серию берут по 5 кроликов. Для контроля берут 3 кролика.

Результаты представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 показывают, что однократное подкожное введение нативной или лиофилизированной специфической сыворотки против ВГБК в дозе 0,5 см³ излечивает животных. Специфическую сыворотку вводят через 20 часов после заражения вирулентным вирусом ГБК, штамм "В-87". Лечебный эффект специфической сыворотки составляет от 80 до 100 процентов.

Таким образом, установлено профилактическое и лечебное действие специфической сыворотки против ВГБК лиофилизированных серий, хранившихся в течение года и 5 лет при температуре 6 ±2^oC, и нативных хранившейся при температуре минус 40 ± 2^oC в течение 5 лет после изготовления.

Для диагностики ВГБК предлагается набор компонентов, который используют в реакциях РГА, РЗГА, РДСК. Набор состоит из емкостей: нормальная и специфическая сыворотка, нормальный и специфический антиген, а также эритроциты человека О (I) группы.

Компонентный состав набора для диагностики ВГБК представлен в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, специфическая и нормальная сыворотки, специфический и нормальный антигены, эритроциты человека по объему в наборе составляют от 1 до 5 см³, общего белка в специфической сыворотке от 5 до 8 кг/см³, в нормальной сыворотке от 3 до 5 мг/см³, в специфическом и нормальном антигене от 5 до 10 мг/см³, в эритроцитах человека от 2 до 4 мг/см³.

Предлагаемый состав компонентов в наборе для диагностики ВГБК позволяет выявлять антиген и антитела в указанных реакциях, поставить диагноз на ВГБК в течение суток.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Использование: вирусология. Сущность изобретения: для получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов, включающей подкожное вакцинирование кроликов коммерческой вакциной с последующей иммунизацией через 14 дней коммерческой вакциной или вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, штамм ВГИКИ 1652. Набор для диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий емкости, содержащие: инактивированный вирус геморрагической болезни кроликов ВГИКИ 1652, сыворотку, полученную, как описано выше, нормальный антиген, нормальную сыворотку и эритроциты человека. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

1 1. Способ получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий введение иммунизирующего препарата с последующим забором крови и отделением сыворотки, отличающийся тем, что за 14 дней до введения иммунизирующего препарата кроликов дополнительно вакцинируют подкожно коммерческой вакциной против вирусной геморрагической болезни кроликов, а в качестве иммунизирующего препарата используют коммерческую вакцину против вирусной геморрагической болезни кроликов или вирулентный вирус геморрагической болезни кроликов штамм ВГНКИ 1652.2 2. Набор для диагностики вирусной гемморагической болезни кроликов, включающий емкости, содержащие инактивированный вирус геморрагической болезни кроликов ВГНКИ 1652, сыворотку, полученную по п.1, нормальный антиген, нормальную сыворотку и эритроциты человека.