ДИОКСО-БИС-D-L-БЕТА-ФЕНИЛ-АЛЬФА-АЛАНИНАТО-МОЛИБДЕН, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВА ВОССТАНОВИТЕЛЯ СТРУКТУРЫ ПЕЧЕНИ ПРИ ГЕПАТОЗЕ Российский патент 1996 года по МПК C07F11/00 A61K31/195 

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к новым биологически активным соединениям, конкретно к диоксо-бис-D,Z-бета-фенил-альфа-аланинато-молибдену формулы (I)
┌└

C₆H₅-CHH-COO-OOC-CH₂-C₆H┐5┘•H₂O восстанавливающему структуру печени при гепатозе, т. е. проявляющему восстанавливающее действие на белоксинтезирующий аппарат гепатоцитов, активизирующему функцию ядра и тем самым ускоряющему репаративные процессы при гепатозе.

Наиболее близким по химическому строению к предлагаемому соединению (I) является диоксодицестеиномолибден (соединение II) формулы
┌└

SH-CH₂-COO-OOC-CH₂-SH┐┘•3H₂O обладающий антианемической активностью [1]
Однако действие на функцию печени для этого соединения не установлено.

Аналогом по биологическому действию является бисаква, моно- (метилметионинат сульфония хлорид, глицинат) меди (соединение III) формулы
-
[2] оказывающий регенеративное действие на ткани печени, пораженной токсическим гепатитом, влияющий на паренхиму печени, а также стимулирующий разрастание соединительной ткани.

Недостатком соединения (III) является высокая токсичность, кроме того, действие его не изучено на ультраструктурном уровне, хотя дана морфологическая картина. Наряду с репаративными процессами паренхимы в печени увеличивается процесс разрастания соединительно-тканых элементов, а это нежелательное побочное действие.

Целью изобретения является синтез эффективного биологически активного соединения молибдена, расширяющего спектр существующих гепатопротекторов, восстанавливающего структуру и функцию печени, активизирующего функцию деления ядра, в результате чего ускоряются репаративные процессы при гепатозе.

Цель достигается синтезом соединения (I) формулы
┌└

C₆H₅-CH₂-COO-OOC-CH₂-C₆H┐5┘•H₂O
Синтез заявляемого соединения осуществляется по методике [3] следующим образом.

Смесь 7,2 г (0,05 моль) МоО₃ и 12,6 г (0,1 моль) дигидрата щавелевой кислоты в 90 мл воды нагревают на водяной бане до полного растворения МоО₃ (8 ч). Получаемый раствор оксалатного комплекса (без отгонки воды) нагревают до 120^оС и к нему добавляют 16,5 г (0,1 моль) D,L-бета-фенил-альфа-аланина. Массу греют в течение 2 ч при температуре кипения раствора (120^оС), затем охлаждают и через двое суток отделяют выпавшие кристаллы от маточного раствора. Целевой продукт промывают этиловым эфиром и ацетоном и дважды перекристаллизовывают из водного раствора. Получают 19,4 г (82,5% выхода от теоретического) целевого продукта состава МоО₂ (C₉H₁₀NO₂)₂H₂O.

Найдено, С 45,50; Н 4,01; N 5,94; Мо 20,31
Н₂О 3,90.

Вычислено, С 45,57; Н 4,64; N 5,91; Мо 20,25; Н₂О 3,80.

Полученное соединение представляет собой синие кристаллы, хорошо растворимые в воде и практически не растворимые в эфире, ацетоне, хлороформе, гексане, ДМФА, несколько лучше в ДМСО и этаноле.

Для идентификации соединения снимали ИК-спектры в виде пасты в вазелиновом масле и в гексахлорбутадиене и в виде таблетки в CsI на приборе Specord М-80 и М-40, ЭСП на приборе Specord UV Vis молярную проводимость (электрическую) на Condactivitymeter,снимал кривые нагревания на дериватографе со скоростью нагрева 10^оС в минуту.

Анализ ИК-спектров D,L-бета-фенил-альфа-аланина (отнесение проведено по К.Накамото [4] и его соединения с молибденом (VI) (см. табл. 1) показал, что происходят изменения в положении и интенсивности полос колебаний карбоксильной и амино-группы. Исходная аминокислота, как известно, существует в цвиттерионной форме. Об этом свидетельствует наличие, колебаний характерных для NH+3

-групп. Для соединения (I) характерен сдвиг всех видов (ρ, δ, Vas) полос карбоксильной группы. Кроме того, отмечено появление в его спектре двух близких полос поглощения, отвечающих симметричным и несимметричным колебаниям Мо-О связи, что служит убедительным аргументом в пользу цис-положения краткосвязанных атомов кислорода. В области низкочастотной ИК-спектроскопии помимо полосы ρ_n(COO) наблюдаются две интенсивные (338 и 384 см^-1), представляющие собой положение частот колебаний карбоксильных группы и Мо-О (δ_s неплоские колебания), связанной с этой группой. Изучение М_эф по методу Фарадея свидетельствует о том, что соединение (I) диамагнитно.

Значение молярной проводимости сое- динения (I) 28,6 в этаноле намного ниже, чем значения, характерные для сильных электролитов состава 1:2 что, видимо, связано в неполной диссоциацией соединения (I) вследствие дополнительной координации фенил-аланина ионом МоО2+2

.

Нагревание соединения (III) сопровождается дегидратацией (Δm ≈4%) при 110^оС, что связано с потерей одной молекулы воды (Δm расчетная 3,7%). Дальнейшее нагревание приводит к размягчению (образованию тянущихся волокон), а затем к последующему разложению, проходящему в 4 этапа (при 225, 310, 390 и 490^оС). Итак, учитывая ряд факторов: во-первых, соединения, синтезированные по методике [2] получаются только состава MoO₂(L-H)₂; во-вторых, это наиболее характерный состав, когда L-лиганд с азот- и кислородсодержащими донорными атомами и аминокислота, в-третьих, характеристики ИК-спектров, магнитное поведение и молярная проводимость в перечисленных соединениях совпадает с таковыми для соединения (I), можно провести аналогию между веществами с более детально изученной структурой и соединением (I). На основании этого считаем, что диоксо-бис-D,L-бета-фенил-альфа-аланинато-молибден наряду с перечисленными соединениями имеет мономерное строение с цис-конфигурацией МоО₂-фрагмента и координирует анион фенил-аланина по кислороду карбоксила.

Биологическое действие соединения (I) определяли на мышах и кроликах. Для этого было сформировано несколько групп животных: клинически здоровые кролики (5 голов) контрольная группа; кролики с экспериментальной патологией печени (5 голов) 2 группа; получавшая дозу препарата 0,20 г/кг массы; кролики с экспериментальной патологией печени (5 голов), получавшие дозу препарата 0,40 г/кг массы, 3 группа и 4 группа, получавшая дозу препарата 0,60 г/кг, с патологией печени. Моделирование патологии печени проводили тетрахлорметаном в дозе 1 мл 100%-ного раствора в подсолнечном масле. Контроль за состоянием животных проводили на основании клинических и морфологических исследований. Для уточнения диагноза из каждой группы по 2 животных подвергали биопсии печени, а также это позволяло делать заключение о функции печени. Электронограммы получали на электронном микроскопе по Б.Уикли (1974).

Эффективность биологического действия соединения (I) по сравнению с эталоном приведена в табл.2.

В ходе экспериментальных исследований было обращено внимание на реактивность животных от введения соединения (I) (место инъекции, кожная реакция, изменение общего состояния и мочеиспускание, дефекация и т.д.).

Гистоморфологическая характеристика печени у клинически здоровых животных (см. фиг.1).

На электронограммах хорошо выявляется электронноплотное ядро овальной формы с гетерохроматином по периферии. В центре ядра располагается несколько ядрышек, чаще одно, а также видны РНП-гранулы. В цитоплазме гепатоцита имеются органеллы: митохондрии, гранулярный и агранулярный эндоплазматический ретикулум, рибосомы, встречаются лизосомы. Кроме этих органелл, имеются жировые капли, вакуоли, расположенные по всей цитоплазме. Вероятно, это следствие недоброкачественного, неполноценного кормления кроликов. Гликоген встречается в незначительном количестве. Морфофункциональное состояние гепатоцита зависит от его расположения в дольке: на периферии или центре. На васкулярном крае гепатоцита содержится незначительное количество микроворсинок, это характерно и для билиардного полюса.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 2-й группы (с экспериментальным хроническим гепатозом, воспроизведенным тетрахлорметаном). У животных 2-й группы (см. фиг. 2) в печени под действием гепатотропного яда развиваются изменения дистрофического и некробиотического характера. Причем ответная реакция гепатоцитов на тетрахлорметан не адекватная: отдельные в состоянии дистрофии, а другие в стадии некроза. В ядре уменьшается, а в отдельных случаях исчезают ядрышки, уменьшается количество РНП-гранул. Увеличивается количество хроматина, распавшегося на мелкие осьмиофобные гранулы. От ядра отслаивается кариолемма, в результате чего между ними увеличивается пространство. Вначале количество и размеры митохондрий увеличиваются, появляется складчатость мембран, кристы мало заметны или полностью редуцируются. В последующем эти органеллы вакуолизируются и их общее число уменьшается до полного исчезновения. Эндоплазматическая сеть становится агранулярной, а рибосомы распыляются по цитоплазме. На периферии гепатоцита цистерны сети фрагментируются и видны в виде небольших овальных везикул. В дальнейшем в гепатоцитах преобладает некробиотический характер: цитоплазма заполняется громадными вакуолями и жировыми каплями. На васкулярном и билиарном полюсах гепатоцита исчезают микроворсинки. Эндотелиоциты, звездчатые ретикулоэндотелиоциты гипертрофируются. В межсинусоидальном пространстве появляются клетки соединительной ткани, а около гепатоцитов лейкоциты. Как видно из приведенных материалов, в печени под действием тетрахлорметана развивается сосудисто-тканевая реакция, характерная для воспаления.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 3-й группы доза соединения (I) 0,20 г/кг (см. фиг.3). Кроликам с экспериментальным токсическим гепатозом ежедневно давали перорально соединение (I). Установлено, что эффект его начинается со 2-го дня применения. Как в ядре, так и цитоплазме развиваются компенсаторно-приспособительные реакции. В частности, происходит активация ядра, незначительное увеличение РНП-гранул, а в цитоплазме уменьшается количество жировых капель и вакуолей. Однако более значительных изменений при использовании этой дозы достичь не удается. В результате этого суточная доза соединения (I) была увеличена.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 4-й группы доза соединения (I) 0,40 г/кг массы (см. фиг. 4). Кроликам с экспериментальным токсическим гепатозом ежедневно в указанной дозе давали соединение (I). Установлено, что стимулирующее действие оно оказывает с первого дня введения. В печени активируются биосинтетические процессы: появляются розетки гликогена, но наибольшее влияние соединение оказывает на белок-синтезирующий аппарат гепатоцитов. В ядре отмечается правильное расположение гетерохроматина, появляются в большом количестве РНП-гранулы, которые заполняют большую часть нуклеоплазмы. В ядре насчитывается от 1 до 3 ядрышек, а часть гепатоцитов многоядреные. Это один из существенных моментов, свидетельствующих о репаративных процессах. Следовательно соединение (I) является биостимулятором для этих процессов в печени. Вероятно при гепатозе значительные изменения ядра, рибосом и других органелл приводят к последующему аутолизу клеток. Подтверждением действия соединения (I) на регенеративные процессы в клетке является восстановление мембранных структур. В частности митохондрии увеличиваются в размерах, цистерны эндоплазматической сети сохраняются почти в обычных размерах. Однако встречаются и расширенные, что составляет до 30% от их общего количества. Уменьшается в цитоплазме количество вакуолей и жировых капель. Одновременно в цитоплазме увеличивается количество лизосом, аутофагосом и в несколько раз количество свободных рибосом. Через 5-10 дней применения этого соединения гистоморфологическая структура гепатоцитов до 80% от общего количества улучшается, активируется в них белоксинтезирующий аппарат, что очень важно для осуществления жизнедеятельности клетки. Для испытания более высокой дозы были проведены следующие исследования.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 5-й группы (доза соединения (I) 0,60 г/кг массы). На кроликах с экспериментальным токсическим гепатозом были проведены аналогичные исследования с ежесуточной дачей соединения. Компенсаторно-приспособительные и регенеративные процессы в гепатоцитах усиливаются и соответствуют во многом ультраструктурным характеристикам, полученным при использовании дозы 0,40 г/кг. При этой дозе в цитозоле появляются осьмиофильные гранулы, что возможно связано с освобождением из соединения (I) молибдена и накоплением его в гепатоцитах. В связи с этим увеличение доз соединения (I) было прекращено и выявлено, что наиболее пригодно для стимуляции белоксинтезирующих органелл гепатоцита 0,40 г/кг массы животного.

Таким образом, предложенное соединение (I) оказывает выраженное действие на печень. В клетках этого органа нормализуется функциональное состояние эндоплазматической сети, активируется и увеличивается количество белоксинтезирующего аппарата (РНП гранул в ядре, рибосом). Эти процессы являются репаративными и способствуют нормализации функций печени, что можно с успехом использовать в медицинской и ветеринарной практике для профилактики и лечения гепатоза.

Широкий спектр действия соединения (I), малая токсичность, доступность позволяет без особых трудностей применять в качестве лечебного средства, для лечения и профилактики токсических поражений печени, что на сегодняшний день является актуальным.

Использование: в химико-фармацевтической промышленности, в частности при способе получения активного вещества - ди-оксо-бис-D, L-бета-фенил-альфа-аланинато-молибдена (АМ), восстанавливающего структуру печени при гепатозе. Сущность изобретения: способ получения АМ предусматривает реакцию оксида молибдена (6+) с дигидратом щавелевой кислоты с образованием оксалатного комплекса молибдена с последующей заменой лиганда в комплексе на -D, L-бета-фенил-альфа-аланин. Полученное соединение имеет состав: MoO₂ (C₉H_1 0 NO₂)H₂O, выход 82,5%. Наиболее эффективная доза для стиммуляции белоксинтезирующий органелл гепатоцита 0,40 г/-кг массы животного, токсичность ЛД(50) 2425 мг/кг массы животного. 4 ил., 2 табл.

Диоксо-бис- -D, α -бета-фенил-альфа-аланинато-молибден формулы

проявляющий свойства восстановителя структуры печени при гепатозе.