ГОМОЛОГИ 1α - ГИДРОКСИВИТАМИНА D С НЕНАСЫЩЕННОЙ БОКОВОЙ ЦЕПЬЮ, КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБСТВУЮЩАЯ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1996 года по МПК C07C401/00 A61K31/59 

Изобретение относится к новым производным витамина D, проявляющим особую активность в стимулировании дифференциации злокачественных и здоровых клеток, конкретно к ненасыщенным в боковой цепи и с удлиненной боковой цепью аналогам 1 α 25-дигидроксивитамину D₃ (1,25-(ОН)₂D₃), проявляющим селективность действия в качестве противоопухолевых средств за счет повышения активности в дифференциации злокачественных клеток и существенно сниженной активности в метаболизме кальция.

Активность витаминов D (витамины D₃ или D₂) в регулировании метаболизма кальция и нормального развития и роста костной ткани требует метаболизма основного витамина в определенные гидроксилированные формы. Установлено, что 1 α 25-дигидроксивитамин D₃ (1,25-(ОН)₂D₃)-дигидроксилированный метаболит, образующийся обычно из витамина D₃ в человеке или животном, представляет собой активное вещество, ответственное за стимуляцию переноса кальция в кишечнике и ресорбцию кальция из костей (костная мобилизация) с регулированием в результате общего содержания кальция в организме (такое связанное с кальцием действие метаболитов или аналогов витамина D в последующем будет называться общим термином кальцемическая активность или кальцемическое действие соединений). Некоторые структурные аналоги 1,25-(ОН)₂D₃, такие как 1 α-гидроксивитамин D₃, 1 α-гидроксивитамин D₂, 1 α 25-дигидроксивитамин D₂ или фторзамещенные производные 1,25-(ОН)₂D₃ известны в качестве высокоактивных кальцемических средств, вследствие чего 1,25-(ОН)₂D₃ и его активные аналоги использовались или были предложены к использованию в качестве лекарств для профилактики или лечения различных нарушений метаболизма кальция в костной ткани, таких как почечная остеодистрофия, устойчивые к витамину D рахиты или остеопороз и связанные с ним заболевания.

Недавно обнаружено, что помимо своего хорошо известного кальцемического действия 1,25-(ОН)₂D₃ выполняет также и другие биологические функции. К примеру, было найдено, что 1,25-(ОН)₂ D₃ и близкие его аналоги (1 α -ОН-D₃), 1,25-(ОН)₂D₂, фторзамещенные аналоги и т.д.) способны стимулировать клеточную дифференциацию [1,2] В частности, было найдено, что 1,25-(ОН)₂ и его аналоги замедляют пролиферацию злокачественных клеток в культуре (например, клеток лейкемии человека) и стимулируют их дифференциацию от нормальных макрафагового типа клеток (такой тип активности в дальнейшем будет называться дифференциативной активностью производных витамина D). Вследствие их заметной активности в качестве стимулирующих дифференциацию средств такие производные витамина D потенциально применимы в качестве противораковых средств, их применение для лечения лейкемии человека действительно предлагалось [3] Хотя эти соединения высокоэффективны при дифференциации злокачественных клеток в культуре, тем не менее их столь же сильное кальцемическое действие in vivo ограничивает или препятствует их применению в качестве практических противораковых средств. Таким образом 1,25-(ОН)₂ D₃ и его фторированные производные являются чрезвычайно мощными средствами дифференциации клеток, но они также являются наиболее сильнодействующими соединениями с точки зрения кальцемической активности и в количествах, необходимых in vivo для эффективного использования в качестве противораковых (например, противолейкемических) средств, те же самые соединения могут привести к опасно высокому уровню кальция в крови вследствие присущей им кальцемической активности. Другие известные производные витамина D показывают аналогичную связь между дифференциативной и кальцемической активностями, так что их практическое применение в качестве протираковых средств также ограничено и опасно.

Эти наблюдения ясно указали на необходимость исследований и стимулировали такие исследования, связанные с поиском соединений с большей специфичностью и избирательностью действия в качестве противораковых средств, т.е. соединений с улучшенным соотношением дифференциативной/кальцемической активностей. Недавно проведенные работы привели к получению нескольких аналогов витамина D с усиленной дифференциативной активностью. Например, было найдено, что определенные гомологи 1,25-(ОН)₂ D₃, у которых боковая цепь удлинена на один атом углерода (в середине или на конце цепи), проявляют заметно более высокую дифференциативную активность (примерно в 10 раз выше) для клеток лейкемии в культуре по сравнению с самим 1,25-(ОН)₂ D₃ [4-6] Однако эти гомологи все еще остаются чрезвычайно сильными кальцемическими средствами с кальцемической активностью, примерно одинаковой с активностью 1,25-(ОН)₂D₃. Таким образом эти соединения характеризуются улучшенным соотношением дифференциативная/кальцемическая активности, но для них не преодолены затруднения, связанные с нежелательно сильным кальцемическим действием. Были получены и другие родственные витамину D соединения, обладающие дифференциативной активностью [7] но по своему строению они отличны от предлагаемых соединений.

Обнаружены родственные витамину D соединения, обладающие необходимой и перспективной активностью с точки зрения дифференциации в сравнении с их кальцемической активностью. Такие новые аналоги витамина обладают очень заметной активностью по замедлению пролиферации злокачественных клеток и стимулирования их дифференциации от нормальных моноцитного типа клеток (одинаковая или более высокая, чем у 1,25-(ОН)₂ D₃ активность), но эти соединения менее активны, чем 1,25-(ОН)₂ D₃ с точки зрения их кальцемического действия. Таким образом эти новые соединения обладают неожиданно улучшенным соотношением дифференциативной/кальцемической активностей, вследствие чего эти соединения являются предпочтительными средствами для лечения раковых заболеваний. Обладая высокой активностью по стимулированию дифференциации, но гораздо меньшей активностью в качестве кальцемических средств, данные соединения могут быть введены в организм без чрезмерного повышения уровня кальция в крови, в результате чего основная практическая проблема, связанная с высокой кальцемической активностью, оказывается преодоленной.

Новые соединения с точки зрения их строения характеризуются, как имеющие ненасыщенность в боковой цепи гомологи 1,25-(ОН)₂ D₃ и боковая цепь удлинена внедрением двух или трех метиленовых звеньев в углеродную цепь. Соединения могут быть представлены нижеследующей общей формулой:

Конкретные и предпочтительные примеры таких соединений включают: 24-дигомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамин D₃, т.е. соединения вышеприведенной формулы, где Х, Y и Z представляют водород и n=3, и 24-тригомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамин D₃, т.е. соединение вышеприведенной формулы, где Х, Y и Z представляют водород и n=4.

Эти новые соединения родственны имеющему ненасыщенность в боковой цепи 24-гомовитамину D₃ [4] Однако новые соединения отличны по своим структурным и биологическим показателям. Различие в строении заключается в наличии ненасыщенной боковой цепи, модифицированной внедрением двух или трех метиленовых звеньев, а с биологической точки зрения соединения характеризуются как очень сильные клеточные дифференциативные средства, не обладающие значительно сниженной кальцемической активностью.

Получение новых соединений. Способы синтеза новых соединений изобретения отражены схемами 1, 2 и 3. На схеме 1 получение промежуточного 1 α-гидроксивитамин D-22-альдегида, который в реакции с поставляющим боковую цепь соответствующим алкилфенилсульфоном (схема способа синтеза 2) образует целевые гомологи витамин D (например, соответственно соединения (25) и (26) Схема 3 иллюстрирует получение алкилфенилсульфонов, необходимых для образования боковой цепи. Экспериментальные подробности осуществления стадий химического процесса, отраженного схемами, приведены в нижеследующих конкретных примерах. Соединения, обозначенные арабскими цифрами (например, соединение 1,2,3 и т.д.) в примерах, относятся к формулам с теми же номерами на схемах.

Общие методики.

3 β -ацетокси-22,23-биснор-5-холевая кислота (1) получена от Steroids (Уилтон, NH). Все другие химикаты были лучшего качества продажными продуктами. Растворители очищены стандартными методами.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляют на предварительно покрытых силикагелем алюминиевых пластинках с УФ-индикацией с помощью ЕМ Science (Гиббстаун, шт. Нью-Йорк). Использованы следующие системы растворителей: А хлороформэтанол (85:15 об/об); В-гексан-этилацетат (1:1) и С-гексан-этилацетат (3:1).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляют с применением жидкостного хроматографа фирмы Waters Associates, снабженного системой подачи растворителя модели 6000А, универсальным инжектором модели 6VК и детектором с переменной длиной волны модели 450. Используют колонки Зорбакс-Сил (Phenomenex) (6,2 мм х 25 см и 10 мм х 25 см). Системы растворителей: А 3% 2-пропанола в гексане; В 2% 2-пропанола в гексане; С 6% 2-пропанола в гексане; D 10% 2-пропанола в гексане; Е 20% 2-пропанола в гексане. Для предварительного фильтрования образцов ВЭЖХ применяют патроны с силикагелем Сер-Пак (Waters Associates).

Масс-спектры при бомбардировке электронами (МС) записывались при 70 еV на масс-спектрометра Kratos MS-50 ТС, снабженном записывающей системой Kratos DS-55.

Ультрафиолетовые (УФ) спектры поглощения регистрировались в видимой области на спектрофотометре Hitachi модель 60-100.

Спектры в инфракрасной области регистрировались на спектрометре Nicolet МХ-1 ГТ-1Р с применением пленок маслянистых веществ или растворов в четыреххлористом углероде.

Спектры протонного магнитного резонанса (IH-ЯМР) снимались на приборе Bruker 270 при 400 или 50 МГц в растворах CDCl₃, содержащих в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилан (ТМС).

П р и м е р 1. Синтез защищенного С-22 альдегида (соединение 18, схема 1).

Альдегид синтезируют по общей методике Kulner и др. (Tetr. Letters 28, 6129-32, 1987). Соединение (1) (10 г) растворяют в 420 мл 5%-ного КОН в метаноле, и раствор перемешивают 15 мин при комнатной температуре до прекращения обнаруживания исходного соединения с помощью ТСХ (система растворителей А). К полученному раствору по каплям прибавляют 160 мл 10%-ной серной кислоты в метаноле при перемешивании и образовавшуюся суспензию разбавляют 400 мл 1%-ной серной кислотой в метаноле. Смесь кипятят 48 ч для завершения этерификации (ТСХ, система растворителей А). Соединение (2) (сложный эфир) экстрагируют этилацетатом, органическую фазу промывают 5% NaHCO₃, насыщенным NaCl и сушат над сульфатом магния. Полученное соединение (2) (0 г, 88%) используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору соединения (2) (4,4 г, 12 ммоля) в 135 мл сухого диметилформамида (ДМФА) добавляют имидазол (3,6 г, 52,8 ммоля), затем трет-бутилдиметилсилилхлорид (4 г, 26,4 ммоля). Раствор перемешивают 5 мин при комнатной температуре до момента образования объемистого осадка, после чего перемешивание продолжают еще 15 мин. Реакционную смесь экстрагируют гексаном (400 мл), промывают водой, насыщенным раствором NaCl и сушат над сульфатом магния. После испарения растворителя получают по данным ТСХ (система растворителей В) продукт (соединение (3), 5,3 г, 91%), использованный на следующей стадии без дополнительной очистки. Аналитический образец получают вытеснительной хроматографией с применением 2% этилацетата в гексане.

Смесь соединения (3) (1 г, 2,1 ммоля) двубромистого олова (0,42 г, 1,5 ммоля) и безводного бикарбоната натрия (0,91 г, 10 ммолей) в 20 мл гексана кипятят 30 мин в атмосфере азота до исчезновения исходного соединения (3) (ТСХ, система растворителей С). Осадок отфильтровывают, а раствор сушат при пониженном давлении. Остаток вновь растворяют в 5 мл безводного ТГФ, добавляют тетрабутиламмонийбромид (0,06 г, 0,19 ммоля), и смесь перемешивают 30 мин при комнатной температуре в атмосфере азота. Затем добавляют раствор тетрабутиламмонийфторида (10 мл, 1 М в ТГФ), затем добавляют 0,7 мл с-коллидина, и смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавляют еще 5 мл раствора тетрабутиламмонийфторида и перемешивание продолжают 3 ч. Добавляют эфир (50 мл), и органическую фазу промывают водой, холодной 1 н, НСl, 10% NaHCO₃ и сушат над безводным сульфатом магния. Полученное соединение (3) (0,44 г, 58%) растворяют в бензоле, хроматографируют на силикагеле (70-230 меш, 30 г) и элюируют с помощью этилацетата в гексане. Аналитический образец получают ВЭЖХ (система А, 77 мл);
ИК (пленка): 1737, 1604, 1495, 1082, 1030 см^-1;
УФ (3% 2-пропанола в гексане) γ_max 262 нм ( ε 7000), γ_max 272 нм ( ε 9800), γ_max 282 нм ( ε 10500), γ_max 293 нм ( ε 6000);
1Н-ЯМР (CICl₃) δ 0,54 (3Н, с, 18-СН₃), 0,94 (3Н, с, 18-СН₃), 0,94 (3Н, с, 19-СН₃), 1,22 (3Н, д, J 6 Гц, 2-СН₃), 3,6 (1Н, м, 3-Н), 3,68 (3Н, с, СО₂СН₃), 5,42 (1Н, м, 6-Н), 5,58 (1Н, м, 7-Н), МС m/3 (относительная интенсивность): 358 (61), 340 (12), 325 (100), 299 (68), 271 (7), 253 (17), 237 (26), 211 (27), 143 (72), 119 (35).

Раствор соединения (4) (830 мг, 2,3 ммоля) в 350 мл смеси бензол-этиловый эфир (1:4 об/об) облучают при перемешивании 40 мин (4х10 мин) в атмосфере азота в охлаждаемой водой погруженной ячейке, снабженной барботером для азота и викоровым фильтром, с помощью УФ-лампы среднего диаметра На novia 608А36. Ход реакции контролируют с помощью ВЭЖХ с применением 2% 2-пропанола в гексане при 265 нм. Раствор испаряют при пониженном давлении, вновь растворяют в 100 мл абсолютного этанола и кипятят 3 ч в атмосфере азота. Затем раствор концентрируют, вновь растворяют в 1 мл 10% этилацетата в гексане и хроматографируют на силикагеле (70-230 меш, 30 г). Сложный эфир витамина (5) (298 мг, 36%) элюируют смесью 15% этилацетата в гексане. Аналитический образец получают ВЭЖХ (система В, R_v 94 мл);
ИК (пленка): 1738 см^-1;
УФ (ЕtOH): γ_max 264 нм, γ_min 228 нм;
IН-ЯМР (CDCl₃) δ 0,56 (3Н, с, 18-СН₃), 1,2 (3Н, д, J 7 Гц, 21-СН₃), 3,66 (3Н, с, СО₂СН₃), 3,95 (1Н, м, 3-Н), 4,8 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19 Z-H), 5,05 (1Н, д, I 1,2 Гц, 19Е-Н), 6,03 (1Н, д, J 11 Гц, 7-Н), 6,23 (1Н, д, J 11 Гц, 6-Н), МС m/з (относительная интенсивность): М⁺ 358 (45), 340 (9), 325 (45), 299 (22), 253 (19), 237 (18), 136 (60), 118 (100).

Раствор соединения (5) (10 мг, 0,028 ммоля) в 5 мл сухого толуола охлаждают в атмосфере азота до -70^оС в бане с сухим льдом в ацетоне. К охлажденному раствору по каплям при перемешивании добавляют диизобутилалюминийгидрид (ДИБАЛ-Н, 50 мкл, 25%-ный раствор в толуоле, 0,088 ммоля), реакционную смесь перемешивают 10 мин при -70^оС, после чего медленно прибавляют метанол (2 мл). Смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, разбавляют этиловым эфиром и промывают 5%-ным НСl, 5%-ным NaHCO₃, водой, насыщенным раствором NaCl и сушат над безводным сульфатом магния. Хроматографией на силикагеле (15% этилацетата в гексане) получают соединение (6) (4,9 мг, 54%) со следующими спектральными характеристиками. МС: 328 (М⁺, 29), 310 (5), 295 (31), 269 (11), 253 (6), 136 (47), 118 (86), 29 (100);
1Н-ЯМР (СDCl₃) δ 0,59 (3Н, с, 18-СН₃), 1,14 (3Н, д. J 7 Гц, 21-СН₃), 4 (1Н, м, 3-Н), 4,81 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Е-Н), 5,05 (1Н, д, J= 1,2 Гц, 19 Z-H), 6,05 (1Н, д, J 11 Гц, 7-Н), 6,23 (1H, д, J=11 Гц, 6-H), 9,58 (1Н, д, J 3,8 Гц, 22-Н).

Дальнейшее элюирование колонки с силикагелем 5% 2-пропанола в гексане приводит к получению С-22-спирт (соединение (7), 2,7 мг, 29%).

Соединение (5) превращают в соединение (8) обработкой 20 ч при 4^оС n-толуолсульфонилхлоридом в пиридине. Соединение (8) (102 мг, 0,2 ммоля) растворяют в мл безводного дихлорметана, и полученный раствор при перемешивании и 55^оС прибавляют к метанольному раствору (15 мл) безводного бикарбоната калия (250 мг). Смесь перемешивают 24 ч при 55^оС, после чего растворители удаляют при пониженном давлении, а остаток экстрагируют эфиром. Органическую фазу промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Полученное соединение (9) (50 мг, 68%) очищают хроматографией на силикагеле с применением 20% этилацетата в гексане.

К суспензии двуокиси селена (9 мг, 0,8 ммоля) в 2 мл сухого метиленхлорида добавляют гидроперекись трет-бутила (112 мкл, 3 М раствор в толуоле, 0,34 ммоля), смесь перемешивают при комнатной температуре в азоте до образования прозрачного раствора. Затем добавляют безводный пиридин (12 мкл, 0,15 ммоля) и вслед соединение (9) (50 мг), растворенное в 2 мл безводного дихлорметана. Смесь перемешивают в атмосфере азота 30 мин, добавляют холодный раствор 10% бикарбоната натрия (2 мл) и экстрагируют эфиром. Органическую фазу промывают холодным 10%-ным раствором бикарбоната натрия, ледяной водой и сушат над безводным сульфатом магния. Хроматографией на силикагеле (10-20% этилацетата в гексане) получают 12,5 мг соединения (10), которое тут же растворяют в 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, полученный раствор нагревают при перемешивании 15 мин при 55^оС в азоте. Реакционную смесь переносят на лед, экстрагируют эфиром и промывают ледяным насыщенным раствором бикарбоната натрия. Объединенные эфирные экстракты промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Аналитические образцы (5,7Е) и (5Е, 7E) изомеров соединений (11) (12) соответственно получены препаративной ВЭЖХ в отношении 2,5:1.

Соединение 11. ВЭЖХ: R_v 68 мл;
УФ (Е107Н): γ_max 264 нм, γ_min 227 нм, A264 2,07; A 227.

1Н-ЯМР (СDСl₃) δ 0,56 (3Н, с, 18-СН₃), 1,2 (3Н, д, J 6,5 Гц, 21-СН₃), 2,04 (3Н, с, 3 β-ацетил), 3,66 (3Н, с, 22-СО₂СН₃), 4,4 (1Н, м, 1-Н), 5,2 (1Н, м, 3-Н), 5,01 (1Н, уш.с, 19Е-Н), 5,34 (1Н, уш, с, 19Z-H), 6,01 (1Н, д, J 10 Гц, 7-Н), 6,33 (1Н, д, J 10 Гц, 6-Н); МС m/3 (относительная интенсивность): 416 (М⁺, 4), 356 (100), 338 (21), 251 (13), 134 (95).

Соединение 12.

ВЭЖХ: R_v 78 мл;
УФ (ЕtOH): γ_max 267 нм, γ_min 227 нм, А267 3,51; А227
1Н, ЯМР (СDCl₃) δ 0,56 (3Н, с, 18-СН₃), 1,2 (3Н, д, J 6,5 Гц, 21-СН₃), 2,04 (3Н, с, 3 β-ОАс), 3,66 (3Н, с, 22-СО₂СН₃), 4,5 (1Н, м, 1-Н), 5,3 (1Н, м, 3-Н), 4,99 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 5,13 (1Н, уш, с, 19Z-Н), 5,81 (1Н, д, J 10 Гц, 7-Н), 6,56 (1Н, д, J 10 Гц, 6-Н).

При получении в больших масштабах изомеры (11) и (12) могут быть также успешно и эффективно разделены с использованием малеинового ангидрида по методике (патент США N 4554106).

К раствору соединения (11) (2 мг) в 0,5 мл сухого толуола при -70^оС и перемешивании в атмосфере азота прибавляют диизобутилалюминийгидрид (15 мкл, 1,5 М раствор в толуоле), смесь перемешивают 10 мин при -70^оС, после чего для разложения металлоорганического комплекса медленно прибавляют метанол. Смесь нагревают до комнатной температуры и экстрагируют этиловым эфиром. Органическую фазу промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Препаративной ВЭЖХ (система Е) получают соединения (13) и (14). Для соединения (13) получены следующие спектральные данные. МС:
344 (М⁺, 22), 326 (13), 311 (2), 285 (4), 269 (4), 152 (29) 134 (100);
1Н-ЯМР (СDCl₃) δ 0,59 (3Н, с, 18-СН₃), 1,15 (3Н, д, J 7 Гц, 21-СН₃), 4,2 (1Н, м, 3-Н), 4,4 (1Н, м, 1-Н), 4,99 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19-Н), 5,31 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Е-Н), 6,02 (1Н, д, J 11 Гц, 7-Н), 6,36 (1Н, д, J 11 Гц, 6-Н), 9,56 (1Н, д, J 4 Гц, 22-Н).

К перемешиваемому раствору соединения (II) (100 мг, 0,24 ммоля) в этиловом эфире (10 мл) добавляют 0,1 н раствор КОН в метаноле (10 мл) и перемешивают 90 мин при комнатной температуре до исчезновения исходного соединения (ТСХ, система растворителей В). Соединение (15) выделено стандартной процедурой экстрагирования (этилацетат, насыщенный раствор NaCl, безводный сульфат магния) в виде бесцветного масла (86,2 мг, 96%).

Смесь имидазола (250 мг, 3,6 ммоля) и трет-бутилдиметилсилилхлорида (250 мг, 1,6 ммоля) в ДМФА (2 мл) добавляют к перемешиваемому раствору соединения (15) (86,2 мг, 0,23 ммоля), полученную однородную смесь перемешивают 15 мин при 55^оС до исчезновения исходного соединения (ТСХ, система растворителей В). Продукт выделяют экстрагированием реакционной смеси гексаном. Органический экстракт промывают рассолом и сушат над безводным сульфатом магния. Фильтрованием гексанового раствора сырого продукта через патроны с силикагелем Сеп-Пак получают соединения (16) (136 мг, 98%).

ИК (пленка): 2974, 2930, 1736, 1447, 1286, 1258, 1150, 1085 см^-1;
УФ (гексан): γ_max 264 нм, γ_min 227 нм, А264 1,91 А227
1Н-ЯМР (СDCl₃) δ 0,07 (12Н, с, Si(CH₃)₂), 0,55 (3Н, с, 18-СН₃), 0,86 (18Н, с, С(СН₃)₃), 1,2 (3Н, д, J 6-8 Гц, 21-СН₃), 3,65 (3Н, с, 0-СН₃), 4,18 1Н, м, 3-Н), 4,36 (1Н, м, 1-Н), 4,84 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Z-H), 5,16 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Е-Н), 5,96 (1Н, д, J 11,2 Гц, 7-Н), 6,19 (1Н, д, J 11,2 Гц, 6-Н); МС m/3 (интенсивности нормализованы к m/e 248): 602 (М⁺, 10), 470 (59), 413 (7), 338 (10), 248 (100).

К перемешиваемому раствору соединения (16) (136, 2 мг, 0,23 ммоля) в абсолютном ТГФ (5 мл) в атмосфере аргона при 0^оС прибавляют литийалюминийгидрид (25 мг, 0,65 ммоля), образовавшуюся суспензию перемешивают 15 мин при 0^оС, избыток литийалюминийгидрида разлагают прикапыванием 10% воды в ТГФ. Затем суспензию разбавляют 10 мл ТГФ и перемешивание продолжают еще 15 мин при комнатной температуре. Продукт выделяют обычной экстракцией этилацетатом. Соединение (17) получено с выходом 91% в виде бесцветного масла (118,4 мг).

ИК (пленка): 3450, 2952, 2886, 1447, 1258, 1105, 1085, 834 см^-1;
УФ (ЕtOH): γ_max 264 нм, γ_min 227 нм, А 264 1,57; А227
1Н-ЯМР (СDCl₃) δ 0,0 (12Н, с, Si-CH₃), 0,53 (3Н, с, 18-СН₃), 0,85 (18Н, с, Si-C(CH₃)₃), 1,04 (3Н, д, J 6,4 Гц, 21-СН₃), 3,37 и 3,63 (1Н и 1Н, каждая м, 22-СН₂), 4,17 (1Н, м, 3-Н), 4,35 (1Н, м, 1-Н), 4,84 (1Н, уш, с, 19Z-H), 5,16 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 6 (1Н, д, J=12,2 Гц), (7-Н), 6,21 (1Н, д, J 12,2 Гц, 6-Н); МС m/3 (интенсивности нормализованы к m/3 248): 574 (М⁺, 17), 442 (67), 383 (11), 308 (17), 248 (100).

К перемешиваемому раствору ДМСО (50 мкл, 0,7 ммоля) в 3 мл дихлорметана при -60^оС в атмосфере азота прибавляют по каплям раствор оксалилхлорида (30 мкл, 0,34 ммоля) в 0,5 мл дихлорметана, полученный раствор перемешивают 10 мин при -60^оС, после чего медленно прибавляют раствор соединения (17) (27 мг, 0,05 ммоля) в 1 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при -60^оС, добавляют 0,2 мл триэтиламина и перемешивают еще 5 мин. Образовавшееся соединение (18) экстрагируют этиловым эфиром, органический экстракт промывают насыщенным раствором NaCl и сушат над безводным сульфатом магния. Фильтрованием через силикагель Сеп-Пак получают чистый по данным ТСХ продукт (17 мг, 62%).

ИК (пленка), 2954, 2929, 2884, 2857, 1727, 1472, 1375, 1256, 1085, 909, 880, 835 см^-1;
ЯМР (СНСl₃) δ 0,0 (12Н, с, Si-CH₃), 0,6 (3Н, с, 18-СН₃), 0,88 (18Н, с Si-C(CH₃)₃), 1,11 (3Н, д, J 6,9 Гц, 21-СН₃), 4,23 (1Н, м, 3-Н), 4,43 (1Н, м, 1-Н), 4,93 (1Н, уш.с, 19Z-H), 5,19 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 6,07 (1Н, д, J 10 Гц, 7-Н), 6,26 (1Н, д, J 10 Гц, 6-H), 9,54 (1Н, д, J3Гц, 22-Н);
УФ (гексан): γ_max 264 нм, γ_min 227 нм, А264 1,9, А227.

МС m/3 (интенсивности относительно m/3 248): 572 (М⁺, 13), 440 (53), 383 (11), 308 (14), 248 (100); точная молекулярная масса, вычисленная для С₃₄Н₆₀О₃Si₂ 572,4081, найдено 572, 4117.

Улучшенные выходы альдегида (18) при проведении стадии окисления в следующих условиях. К перемешиваемому раствору 25 мкл (0,36 ммоля) диметилсульфоксида в 0,25 мл безводного дихлорметана при -60^оС в атмосфере аргона прибавляют по каплям раствор 15 мкл (0,17 ммоля) оксалилхлорида в 0,75 мл безводного дихлорметана и после перемешивания смеси 10 мин при -60^оС медленно прибавляют раствор 20,3 мг (0,035 ммоля) спирта (17) в 0,5 мл безводного дихлорметалла с быстрым ополаскиванием дополнительными 0,2 мл безводного дихлорметана. Смесь перемешивают 30 мин при -60^оС и при той же температуре добавляют 0,3 мл (2,15 ммоля) триэтиламина. Смесь перемешивают еще 5 мин, нагревают до 0^оС и экстрагируют эфиром. Эфирную фазу промывают рассолом и сушат (MgSO₄). Фильтрованием через силикагель Сеп-Пак получают соединение (18) в виде бесцветного масла, которое очищают с помощью ВЭЖХ (Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 10% ЕtОAc в гексане) и получают чистый альдегид (18) (19 мг, 96% ), исходный спирт выделен только в виде следов (0,12 мг).

П р и м е р 2. Введение боковой цепи. Синтез 24-дигомо-1 α 25-дигидрокси-22-дегидровитамина D₃ (cоединение 25, схема 2).

(а) Получение гидроксисульфона (19).

К перемешиваемому раствору 31 мг (84 мкмоля) 2-метил-6-(фенилсульфонил)-2-(триэтилсилиокси)гексана (соединение 31, схема 3) в 300 мкл безводного тетрагидрофурана (содержит 1,10-фенантролин в качестве индикатора) в атмосфере аргона при -78^оС добавляют 13 мкл (90 мкмоль) диизопропиламина и затем 70 мкл Buli (1,3 М в гексане) (91 мкмоль), перемешивают 30 мин в тех же условиях, затем добавляют 6 мг С-22-альдегида (соединение 18) (10 мкмоль) в 300 мкмл безводного тетрагидрофурана и перемешивают 1 ч при -78^оС. Смесь разлагают добавлением 1 мл насыщенного раствора NH₄Cl, нагревают до 0^оС и экстрагируют этилацетатом. Экстракт промывают водой, рассолом и сушат над MgSO₄, фильтруют и испаряют. Препаративной ВЭЖХ (колонка Зорбакс-Сил, 9,6х25 см, система растворителей 10% этилацетата в гексане) получают 0,6 мг непрореагировавшего альдегида и 6,6 мг гидроксисульфона (19) в виде смеси эпимеров (выход 77%).

(b) 24-дигомо-1, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D₃ (25)
К перемешиваемому раствору гидроксисульфона (19) (3,3 мг) в 1 мл абсолютного тетрагидрофурана добавляют насыщенный раствор Na₂HPO₄ (1 мл) и затем безводный порошкообразный Na₂HPO₄ (160 мг). Смесь перемешивают в атмосфере аргона 30 мин и охлаждают до 0^оС. Затем добавляют свежеприготовленную 5%-ную амальгаму натрия (около 400 мг) и перемешивают 16 ч при 5^оС. Смесь разбавляют 5 мл гексана, и перемешивание продолжают еще 15 мин. Растворители декантируют, твердое вещество промывают гексаном (3х5 мл), к объединенному органическому раствору добавляют лед и насыщенный раствор NaCl, органический слой отделяют и пропускают через патрон с Сеп-Пак в виде гексанового раствора. Очисткой ВЭЖХ получают 2 мг (71%) защищенного Δ²² -24-дигомо-1,25-(ОН)D₃ (21) и небольшое количество 22-гидроксидированного продукта (22) (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 10% EtOAс в гексане). Защищенный триол (21) (2 мг) растворяют в 1 мл абсолютного ТГФ и к полученному раствору добавляют тетрабутиламмонийфторид (50 мкл 1 М раствор в ТГФ). Смесь перемешивают в атмосфере аргона 1 ч при 50^оС, затем добавляют эфир (8 мл), и органическую фазу промывают насыщенным раствором NaCl. Растворители удаляют, остаток растворяют в 10% 2-пропанола в гексане и фильтруют через окись кремния Сеп-Пак. ВЭЖХ (20% 2-пропанола в гексане, колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см) получают 0,6 мг целевого дигомопроизводного (25).

УФ (EtOH): γ_max 264 нм, γ_min А228 нм, А264 1,87 А228.

1Н-ЯМР (СDCl₃) δ 0,55 (3Н, с, 18-СН₃), 1 (3Н, д, J 6,6 Гц, 21-СН₃), 1,23 (5Н, с, 26, 27-СН₃), 4,23 (1Н, м, 3-Н), 4,43 (1Н, м, 1-Н), 5 (1Н, уш, с, 19Z-H), 5,32 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 5,29 (2Н, м, 22-Н и 23-Н), 6,01 (1Н, д, J 11,3 Гц, 7-Н); МС m/3 (относительная интенсивность): 442 (М⁺, 15), 424 (23), 406 (33), 391 (7), 287 (11), 285 (10), 269 (27), 251 (23), 152 (33) 134 (100), 116 (6), 59 (20); точная молекулярная масса, вычисленная для С₂₉Н₄₆О₃ 442, 3446, найдено 442, 3441.

П р и м е р 3. Введение боковой цепи. Синтез 24-тригомо-1 α 25-дигидрокси-22- дегидровитамина D₃.

Соединение 26 (схема 2).

(а) Получение гидроксисульфона (20).

К перемешиваемому раствору 58 мг (151 мкмоль) 2-метил-7-(фенилсульфонил)-2-(триэтилсилилокси)гептана (соединение 35, схема 3) в 500 мкл абсолютного тетрагидрофурана (содержащего 1,10-фенантролин в качестве индикатора) в атмосфере аргона при -78^оС добавляют 23 мкл (160 мкмоль) диизопропиламина и затем 106 мкл н-BuLi (1,5 М в гексане) (160 мкмоль). Раствор перемешивают в тех же условиях 30 мин, после чего добавляют 7 мг С-22-альдегида (соединение 18) (12 мкмолей) в 300 мкл абсолютного тетрагидрофурана и перемешивают 1 ч. Смесь разлагают при -78^оС добавлением 1 мл насыщенного раствора NH₄Cl, нагревают до 0^оС и экстрагируют этилацетатом. Экстракт промывают водой и рассолом, сушат над безводным MgSO₄, фильтруют и испаряют. Препаративной ВЭЖХ (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, система растворителей 10% этилацетата в гексане) получают 0,4 мг непрореагировавшего альдегида и 7,5 мг гидроксисульфона (20) в виде смеси эпимеров (78%).

(b) 24-тригомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамин D₃ (26).

К перемешиваемому раствору гидроксисульфона (20) (7,5 мг) в 1 мл абсолютного тетрагидрофурана добавляют насыщенный раствор Na₂HPO₄ и затем 160 мг безводного Na₂HPO₄ в виде порошка. Смесь перемешивают 30 мин в атмосфере аргона и затем охлаждают до 0^оС. Добавляют свежеприготовленную 5% амальгаму натрия (около 400 мг) и перемешивают 16 ч при 5^оС. Затем смесь разбавляют 5 мл гексана, перемешивание продолжают еще 15 мин. Растворители декантируют, твердый продукт промывают гексаном (3х5 мл), объединенную органическую фазу промывают рассолом, отделяют, сушат и испаряют. Остаток пропускают через патрон Сеп-Пак в смеси 10% этилацетата в гексане. Очисткой с помощью ВЭЖХ получают 2,12 мг защищенного Δ 22-24-тригомо-1,25-(ОН)₂D₃ (23) и 1,33 мг 22-гидроксилированного продукта (24) (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 10% этилацетата в гексане). Соединение 23 (2,1 мг) растворяют в 1 мл абсолютного тетрагидрофурана и к полученному раствору добавляют 5 мкл тетрабутиламмонийфторида в тетрагидрофуране (1 М раствор). Смесь перемешивают в атмосфере аргона 1 ч при 50^оС, затем добавляют эфир и органическую фазу промывают рассолом. Эфирную фазу сушат над безводным MgSO₄, фильтруют и испаряют. Остаток растворяют в 30% 2-пропанола в гексане и пропускают через Сеп-Пак. Очисткой с помощью ВЭЖХ (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 20% 2-пропанола в гексане) получают целевое тригомо-производное 26 (0,8 мг),
УФ (ЕtОН): γ_max 264 нм, γ_min 228 нм, А264 1,81; А228
1Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 0,56 (3Н, с, 18-СН₃), 1 (3Н, д, J 6,6 Гц, 21-СН₃), 1,23 (6Н, с, 26, 27-СН₃), 4,23 (1Н, м, 3-Н), 4,43 (1Н, м, 1-Н), 5 (1Н, уш, с, 19Z-H), 5,32 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 5,29 (2Н, м, 22-Н и 23-Н), 6,01 (1Н, д, J 11,3 Гц, 7-Н); МС m/3 (относительная интенсивность): 456 (М⁺, 11), 438 (50), 420 (30), 402 (8), 287 (10), 269 (23), 251 (23), 152 (35), 134 (100).

П р и м е р 4. Синтез вводимого в виде боковой цепи сульфона (схема 3).

(а) Получение остатка сульфона боковой цепи.

К раствору метилмагнийбромида (12,9 мл, 3М раствор в эфире) в 25 мл сухого ТГФ при -10^оС и интенсивном перемешивании прибавляют по каплям в течение 30 мин в атмосфере аргона раствор 4-хлорвалерилхлорида 27 (Aldrich 3 г, 19,2 ммоль). Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры (около 2 ч), разлагают водой и нейтрализуют разбавленной соляной кислотой. Смесь экстрагируют эфиром, объединенные органические слои промывают водой и сушат над сульфатом натрия. После удаления растворителя и разгонки остатка в вакууме получают хлорзамещенный спирт 28 в виде бесцветной жидкости (2,1 г, 70%). Хлорзамещенный спирт 28 (1,5 г, 10 ммоль) в безводном диметилформамиде (5 мл) добавляют к перемешиваемому раствору тиофенола (1,32 г, 12 ммоль) и трет-бутоксида калия (1,32 г, 11,3 ммоль) в безводном диметилформамиде (25 мл). Реакционную смесь перемешивают сутки при комнатной температуре, после чего раствор распределяют между дихлорметаном и водой. Органический слой промывают водным карбонатом натрия, водой и сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель испаряют в вакууме, а сырое масло очищают вытеснительной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью гексан-этилацетат. Получено 2,2 г (98%) сульфида 29 в виде бесцветной жидкости. Сульфид 29 (1,01 г, 4,5 ммоль) растворяют в сухом дихлорметане (40 мл) и к полученному раствору порциями при перемешивании и произвольном охлаждении добавляют 3-хлорнадбензойную кислоту (2,5 г, 11,6 ммоль; Aldrich 80-85%). Реакционную смесь перемешивают 2 ч и затем разлагают 10%-ным раствором бикарбоната натрия. Объединенные органические экстракты промывают водным сульфитом натрия и рассолом и сушат над сульфатом магния. Растворитель удаляют в вакууме и очисткой сырого масла вытеснительной хроматографией с элюированием смесями гексан-этилацетат получают сульфон 30 (1,1 г, 97%) в виде бесцветной жидкости. К перемешиваемому раствору сульфона 30 (1,3 г, 5,1 ммоль) и имидазола (1,5 г, 22,7 ммоль) в сухом диметилформамиде (50 мл) добавляют триэтилсилилхлорид (1,15 г, 7,7 ммоль), после чего смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре и разбавляют дихлорметаном. Смесь промывают водным раствором хлорида аммония и водой, органические слои сушат над сульфатом натрия и испаряют в вакууме. Остаток очищают вытеснительной хроматографией на силикагеле. Первым гексаном вымывается гексаэтилдисилоксан. Триэтилсилилзащищенный сульфон 31 (1,8 г, 97%) элюируется смесью гексан-этилацетат (9:1) в виде бесцветной жидкости.

ИК (чистое вещество): 3045, 2940, 1440, 1360, 1130, 1020 см^-1.

1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 0,518 (6Н, к, J 6,2 Гц, Si-CH₂), 0,899 (9Н, т, 1 6,2 Гц, Si C-CH₃), 1,142 (6Н, с, СН₃), 1,307-1,462 (4Н, м), 1,655-1,738 (2Н, м, 4-Н), 3,08-3,122 (2Н, м, 2-Н), 7,567 (2Н, т, J 6,8 Гц, мета-Н-арил), 7,648 (1Н, т, J 6,8 Гц, пара-Н-арил), 7,916 (2Н, д, J 6,83 Гц, орто-Н-арил); МС (Е1, 70 еV) m/3 (относительная интенсивность) 372 (М⁺, 2), 341 (100), 229 (2), 227 (18), 173 (24), 103 (22), 75 (45), 55 (33).

(b) Получение используемого в качестве боковой цепи сульфона (35).

К раствору метилмагнийбромида (14 мл 3 М раствора в эфире) в абсолютном тетрагидрофуране при -10^оС и интенсивном перемешивании в атмосфере аргона в течение 15-20 мин прибавляют раствор 6-бромгексаноилхлорида (32) (3,8 г, 2,8 мл, 18 ммоль) в абсолютном тетрагидрофуране (10 мл). Смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, охлаждают до 0^оС и осторожно разлагают разбавленной (1:1) соляной кислотой. Смесь экстрагируют эфиром, объединенные органические слои промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и после испарения получают бромзамещенный спирт (33) в виде бесцветного масла (3,6 г, 94%).

Бромзамещенный спирт (3,4 г, 16 ммоль) обрабатывают в течение 4,5 ч при 70^оС натриевой солью бензолсульфиновой кислоты (3,3 г, 20 ммоль) в абсолютном диметилформамиде. Затем смесь переносят на лед, экстрагируют дихлорметаном, промывают 1 н НСl, водой 10%-ным раствором NaHCO₃, cушат над безводным MgSO₄, фильтруют и после испарения получают сульфон (34), который очищают вытеснительной хроматографией на силикагеле с элюированием 40-50% этилацетата в гексане, получают сульфон с примесью соответствующего сульфинатного эфира (4,18 г, 98%). МС m/3 270 (М⁺), 255 (М⁺ -15), 77, 59.

К перемешиваемому раствору сульфона (34) (4 г, 14 ммоль) и имидазола (3,8 г, 55 ммоль) в безводном диметилформамиде (13 мл) прибавляют триэтилсилилхлорид (4,6 г, 5,1 мл, 30 ммоль), реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, переносят в ледяную воду, экстрагируют эфиром, сушат над безводным MgSО₄, фильтруют и испаряют. Остаток очищают вытеснительной хроматографией. Первым гексаном элюируется гексаэтилдисилоксан, 3% этилацетата в гексане элюируются сульфинатный эфир с примесью сульфона и 10% этилацетата в гексане элюируется чистый защищенный сульфон (35) (3,4 г, 60% ).

Анализ.

Вычислено для С₂₀Н₃₆О₃SSi:
С 62,45 Н 9,43 S 38,34
Найдено, С 61,97 Н 9,45 S 38,34
МС m/3 (относительная интенсивность): 355 (100) (М⁺-29), 227 (15), 173 (35), 103 (43), 75 (95), 55 (23).

ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 0,54 (6Н, к, J7 Гц, Si-CH₂), 0,94 (9Н, т, J 8 Гц, Si-C-CH₃), 1,15 (6Н, с, СН₃), 1,31-1,36 (4Н, м), 3,08-3,12 (2Н, м, 2-Н), 7,57 (2Н, т, J 6,8 Гц, мета-Н-арил), 7,66 (1Н, т. пара-Н-арил), 7,92 (2Н, д, J 6,8 Гц, орто-Н-арил).

Биологическая активность.

Новый гомолог (25) испытан на дифференциативную и кальцемическую активности с использованием апробированных известных методик. Методики проведения испытаний и полученные результаты более подробно описываются в нижеследующих примерах.

П р и м е р 5. Определение дифференциативной активности дигомо-производного (25) по отношению к клеткам ЛЧ-60 (Таблица 1).

Степень дифференциации клеток лейкемии человека 60 (ЛЧ-60) под действием испытуемых соединений определялась тремя независимыми способами, а именно: NBT-восстановление, фагоцитоз и активность эстеразы. Первые два испытания осуществлены по методикам [4] Третье испытание с определением неспецифической активности кислотной эстеразы в качестве мерила дифференциации проводят по методике, прилагаемой к тест-набору 90 фирмы Сигма (Sigma Chemical Corp. Сан-Луис, МО) (Оstrem и др. Proc. Nate, Acad, Sci. VSA 84, 2610-2614 (1987); Ostrem и др. I.Biol.Chem. 262, 14164-14171 (1987). Полученные результаты приведены в табл. 1. Данные представлены как процент дифференциации клеток в результате обработки 1,25-(ОН)₂D₃ (использован для сравнения в качестве стандарта) в различных концентрациях или испытуемым производным витамина D).

При этом отмечается назкая кальцемическая активность.

П р и м е р 6. Кальцемическая активность дигомо-производного (25).

(а) Активность по переносу кальция в кишечнике. (Таблица 2)
Отнятых от сосков самцов крыс, полученных от компании Харлан-Спраг Доули из Медисона, шт. Висконсин, кормят рахитогенной пищей с низким содержанием кальция (0,02 мас. Са, 0,3 мас. Р), описанной Suda и др. (J.Nutr. 100, 1049-1052, 1970). Крысы получают такое в общей сложности 4 недели произвольно. В конце третьей недели зверьков разделяют на группы по 6 крыс в каждой группе. Одна из групп получала ежедневно инъекции носителя (0,1 мл 0,95% пропиленгликоля и 5% этанола) внутрибрюшинно в течение того же периода времени, но с добавкой одной из следующих доз: 12,5 нг или 25 нг 1,25-(ОН)₂D₃ или 24-дигомо-1 α 25-дигидрокси-22-дегидровитамина (соединение 25). Зверьков умерщвляют через 24 ч после введения последней дозы, кишечник извлекают и дуоденальные сегменты используют для определения переноса кальция в кишечнике по методике Halloran, DeLuca (Arch. Biochem. Biophys. 208, 477-486, 1981). Полученные результаты приведены табл. 2.

(b) Определение костной мобилизации кальция (табл. 3).

Самцов крыс, отнятых от сосков и полученных от компании Харлан-Спраг Доули, кормят пищевой с низким содержанием кальция (0,02 мас. Са, 0,3 мас. Р) и дефицитом витамина D, описанной Suda и др. (I.Nutr 100, 1049-1052, 1970) в течение 4 недель. В конце третьей недели зверьков делят на группы по 6 крыс в каждой, каждая группа получает определенные дозировки (табл. 3), растворенные в 0,1 мл 85% пропиленгликоля и 5% этанола. Контрольная группа получает только применяемый в качестве растворителя носитель. Другие группы получают указанные дозировки 1,25-(ОН)₂D₃ или дигомо-производного (25) ежедневно в течение 7 дней. В конце 7-ми дневного периода введения соединений по атомному поглощению определяют содержание кальция в сыворотке крови. Результаты двух таких экспериментов приведены в табл. 3.

Представленные в табл. 1 данные показывают, что дигомо-аналог 25 явно более активен по сравнению с 1,25-(ОН)₂D₃ в стимулировании дифференциации клеток лейкемии от нормальных моноцитовых клеток. Например, при концентрации 1х10^-8 молярной 1,25-(ОН)₂D₃ создает дифференциацию клеток в 55-61% а соединение (25) при той же концентрации создает дифференциацию в 78% С учетом того, что концентрация 1х10^-7 молярной для 1,25-(ОН)₂D₃ необходимо для достижения той же степени дифференциации (примерно 90%), которая достигается при концентрации дигомо-аналога в 5х10^-8 (примерно 92%), можно сделать вывод о том, что аналог (25) примерно в 5 раз более активен, чем 1,25-(ОН)₂D₃ в качестве дифференциативного средства.

Напротив, дигомо-производное проявляет очень низкую кальцемическую активность по сравнению с 1,25-(ОН)₂D₃. Этот вывод подтверждается данными, приведенными в табл. 2 и 3. Данные по переносу кальция в кишечнике, представленные в табл. 2, показывают, например, что известный своей активностью метаболит 1,25-(ОН)₂D₃ вызывает очень значительную реакцию (по сравнению с контролем) при введении в дозировках 12,5 или 25 нг/день в течение 7 дней. Однако, в случае нового дигомо-производного (25) необходима дозировка в 125 нг/день в течение 7, чтобы вызвать реакцию, но даже при таких высоких дозировках реакция умерена и составляет примерно половину от реакции, вызванной 1,25-(ОН)₂D₃ при дозировке в 10 раз выше. Таким образом, согласно данному испытанию новое дигомо-производное по меньшей мере в 10 раз менее активен, чем 1,25-(ОН)₂.

Тот же вывод можно сделать на основании результатов по костной мобилизации кальция, приведенных в табл. 3. В этом случае дозировки в 125 и 250 нг/день (вводимые в течение 7 дней) дигомо-аналога (25) необходимы для достижения той же степени реакции, что и создаваемые 1,25-(ОН)₂D₃ соответственно в дозировках 12,5 и 25 нг. Примечателен и тот факт, что повышение дозировки дигомо-производного (до 500 нг/день) не вызывает дальнейшего роста, но даже несколько уменьшает реакцию по костной мобилизации кальция (табл. 3). Во втором опыте, отраженном в табл. 3, 1,25-(ОН)₂D₃ вновь вызывает очень значительную реакцию (в сравнении с контролем) в дозировках 12,5 и 15 нг/день при отсутствии активности со стороны дигомо-аналога в дозировке 125 нг/день. В третьем опыте, в котором дигомо-аналог испытывался в интервале дозировок вплоть до 1000 нг/день, соединение не вызывает никакой реакции по костной мобилизации кальция при любых дозировках, что указывает на отсутствие активности у соединения по повышению содержания кальция в сыворотке крови за счет костной ткани. Таким образом, результаты по костной мобилизации находятся в полном соответствии с данными по переносу кальция, приведенными в табл. 2, которые ясно показывают, что новый дигомо-аналог 25 во много раз менее активен, чем 1,25-(ОН)₂D₃ по своему кальцемическому действию.

Тот же характер проявления активности наблюдается и для тригомо-производного (26) предлагаемого изобретения. Это соединение обладает в высшей степени благоприятным и неожиданно повышенным отношением дифференциативная (кальцемическая активности за счет проявления заметной активности в стимулировании дифференциации клеток ЛЧ-60 без заметной реакции (в сравнении с контролем) по повышению содержания кальция в крови крыс.

Такой тип проявления активности это то, что требуется для соединения, предназначенного для применения в качестве дифференциативного средства для лечения раковых заболеваний. Целевая активность, т.е. клеточная дифференциация злокачественных клеток, ярко выражена, в то время как нежелательная активность, а именно кальцемическое действие, неожиданно понижено, в результате чего достигается очень значительно повышенное отношение дифференциативная кальцемическая активности. Известное соединение 1 α -гидрокси- витамины D эффективно в качестве терапевтического средства для лечения лейкемических заболеваний (патент США N 4391802). На основе приведенных данных биологических испытаний можно сделать вывод, что новые гомо-производные предлагаемого изобретения при их введении в тех же дозировках, что и соединений прототипа, будут оказывать от ложного отсутствия до менее, чем в одной десятой части нежелательного кальцемического действия, характерного для соединений прототипа, и тем самым снимают проблемы, связанные с возникновением чрезмерно высоких концентраций кальция в крови подвергаемых лечению субъектов. Таким образом, предлагаемые соединения являются эффективным практическим воплощением концепции дифференциативной терапии раковых заболеваний, и характер проявления активности со стороны этих соединений однозначно предполагает, что они окажутся предпочтительными терапевтическими средствами при таком лечении.

Для лечебных целей предлагаемые соединения могут быть приготовлены в виде растворов в приемлемом растворителе или в виде эмульсий, суспензий или дисперсий в приемлемых или неядовитых растворителях или носителях, или в виде пилюль, таблеток или капсул известными стандартными способами. Такие составы могут также включать другие фармацевтически приемлемые и неядовитые наполнители, такие как стабилизаторы, антиокислители, связующие средства, красители, эмульгаторы и вкусовые добавки. Предложенная композиция содержит в качестве активного начала гомолог 1-гидроксивитамина D в количестве 0,5-50 мкг.

Соединения предпочтительно вводятся в виде инъекций или внутривенным вливанием приемлемых стерильных растворов, или в виде пероральных доз через пищеварительный тракт. При лечении лейкемии человека производные гомовитамина вводятся больным в дозировках, достаточных для стимулирования дифференциации лейкемических клеток от макрофагов.

Мягкая желатиновая капсула содержит: 0,25 мл три-лауринтриглицерида, 5 мкг 24-дигомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитами- на D₃.

Жидкая композиция для орального введения содержит 1 мл пропиленгликоля; 100 мкг 24-тригомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамина D₃; 10 мкг альфа-токоферола.

Композиция для нанесения на кожу содержит: 1 г пальмового масла; 20 мкг 24-дигомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамина D₃.

Использование: в медицине, как соединения, обладающие биологической активностью. Сущность изобретения: гомологи 1 Альфа-гидроксивитамина D₃ с ненасыщенной боковой цепью, композиция, способствующая стимуляции и усилению дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека, содержит в качестве активного вещества гомологи 1 Альфа-гидроксивитамина D₃. Способ стимулирования и усиления дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека включает введение по меньшей мере одного из гомологов 1-гидроксивитамина D₃. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

Гомологи 1α - гидроксивитамина D₃ с ненасыщенной боковой целью общей формулы

где n = 3 или 4,
обладающие стимулирующим и усиливающим дифференциацию злокачественных клеток лейкемии человека действием.

2. Гомологи 22-гидрокси-23-фенилсульфонил витамина D₃ общей формулы

где X, Y, Z - одинаковые или различные, водород или три(низший алкил)силильная группа;
n = 3 или 4,
в качестве промежуточных продуктов для получения гомологов 1α - гидроксивитамина D₃.

4. Способ стимуляции и усиления дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека, включающий введение производных витамина D₃, отличающийся тем, что используют по меньшей мере один из гомологов 1α-гидроксивитамина D₃ общей формулы

где n = 3, 4.

Способ по п. 4, отличающийся тем, что гомологом является 24-тригомо-1α, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D₃.