СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОЧИСТОГО ИНСУЛИНА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/39 

Изобретение относится к области химии белка, в частности к способу получения высокочистого инсулина с помощью препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).

Изобретение может найти применение в фармацевтике и медицине при изготовлении лекарственных форм инсулина гормона белковой природы, регулирующего уровень сахара в организме.

Сырьем для получения высокочистого инсулина служит частично очищенный инсулин, выделяемый из экстрактов поджелудочной железы животных (свиньи, крупного рогатого скота), либо человеческий генно-инженерный инсулин. В зависимости от источника получения полуочищенный инсулин может различаться по типу примесей. В общем случае примеси можно подразделить на три группы:
1) Инсулино-подобные вещества (дезамидоинсулин, аргинининсулин, дез-аланин-инсулин, дез-пентапептид-инсулин, синтетические производные инсулина).

2) Проинсулин и проинсулиноподобные вещества.

3) Полипептиды неинсулиновой природы (глюкаген, панкреатический полипептид, полипептиды бактерий при использовании генно-инженерной технологии).

Одно из обязательных требований, предъявляемых к препаратам фармакологического назначения, в том числе и к инсулину, высокая степень чистоты. Инсулин для приготовления лекарственных форм должен содержать не менее 96% основного вещества, а также иметь высокую степень чистоты по примеси групп 2 и 3. Так, по требованиям фармакологии США, содержание проинсулина и проинсулино-подобных веществ не должно превышать 10 миллионных долей (м.д.).

В научно-технической литературе имеются сведения о получении высокочистого инсулина в абсолютных лабораторных условиях, однако указывается, что при переходе к препаративным методикам выход и степень очистки целевого продукта, как правило, снижаются. Тем не менее известен ряд подходов к решению проблемы препаративного получения высокочистого инсулина. Так, при использовании препаративной ионообменной хроматографии может быть достигнута высокая производительность процесса, однако степень чистоты инсулина не превышает 95% С помощью препаративной афинной хроматографии получен инсулин со степенью чистоты 98% но по производительности этот способ значительно уступает ионообменной хроматографии.

Таким образом, ни один из вышеперечисленных подходов не позволяет одновременно добиться высокой производительности процесса и степени очистки инсулина, превышающей 98%
Существует еще один вариант решения этой проблемы. Известно, что ВЭХХ позволяет получать белки с высокой степенью чистоты. Показана принципиальная возможность выделения высокочистого инсулина с помощью ОФ ВЭЖХ, причем удалось разделить инсулин и содержащиеся в нем примеси, отличающиеся от него по составу даже незначительно. Однако использование токсических элюентов, проведение ОФ ВЭЖХ в режиме низкой нагрузки, то есть низкая производительность процесса, не позволяют применить описанный способ в качестве препаративной методики выделения высокочистого инсулина.

Известен способ получения высокочистого инсулина с помощью ОФ ВЭЖХ на октилсиликагеле при использовании цетилриметиламмония бромистого в качестве десорбирующего элемента. Из критериев чистоты получаемого инсулина производится содержание проинсулина 100 м.д. Выход очищенного продукта 50% Рассчитанная по уравнению

где: П производительность процесса, г/см²•ч;
Q нагрузка на колонку, г;
S площадь сечения колонки, см²;
t продолжительность процесса, ч,
производительность процесса составляет 0,07 г/см²•ч. Недостатком указанного процесса является низкая производительность, а также необходимость дополнительной очистки инсулина от токсичного цетилтриметиламмонийбромида.

Известен также способ получения высокочистого инсулина, основанный на градиентной ОФ ВЭХХ на силикагеле с привитой фазой C₈ или C₁₈ с диаметром пор 120 150 прототип. В качестве элюентов используют смесь ацетонитрила и фосфатного буфера. Элюция носит линейный градиентный характер. Максимальная нагрузка на колонку размером 150х9,4 мм составляет 0,55 г. Выход инсулина 79 -83% (от теор.), степень чистоты препарата 97,5% Сведений о содержании примесей, например проинсулина, не приведено. Производительность процесса составляет 0,11 г/см²•ч.

Известный способ имеет ряд недостатков. Это, прежде всего, низкая производительность процесса, применение токсичного растворителя (ацетонитрила) в составе элюента и технологическая сложность, связанная с использованием градиентного препаративного хроматографа.

Очевидно, что ни один из известных способов получения высокочистого инсулина с помощью ОФ ВЭЖХ не может в настоящее время быть применен в качестве препаративной методики.

Предлагаемым изобретением решается задача препаративного получения высокочистого инсулина высокопроизводительным и технологичным способом с использованием ОФ ВЭЖХ.

Суть способа заключается в следующем.

Выделение инсулина из полуочищенного продукта проводят с помощью препаративной околокритической ступенчатой ОФ ВЭЖХ на стандартных колонках в режиме перегрузки и селективной десорбции целевого продукта при рН подвижной фазы 4,20 4,45. При этом в качестве сорбента используют кремнеземные сорбенты, модифицированные алкильными гидрофобными группами C₁₆H₃₃ и C₁₈H₃₇. В качестве элюентов используют смеси алифатических спиртов из ряда: этанол, пропанол, изо-пропанол с водными 0,05 0,15 М растворами ацетатов или сульфатов щелочных металлов или аммония, причем первый элюент (А) содержит 1 15 об. алифатического спирта, что на 1 18% ниже критической концентрации десорбции инсулина и обеспечивает полную сорбцию компонентов разделяемой смеси, второй элюент (Б) содержит 16 30 об. алифатического спирта, что на 0,5 2% выше критической концентрации десорбции инсулина и позволяет осуществить селективную десорбцию инсулина, а для регенерации через колонку пропускают третий элюент (В), содержащий 50 60 об. алифатического спирта.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Препаративное получение высокочистого инсулина из полуочищенного свиного инсулина.

Содержание основного вещества в исходном полуочищенном свином инсулине - 88% проинсулина 30.000 м.д. дезамидоинсулина 4,6%
Прибор: хроматограф серии 8800 фирмы Дюпон де Немур (США). Детектирование: дифференциальный сканирующий спектрофотометр 8800 той же фирмы; λ 254 нм.

Сорбент: силикагель, модифицированный C₁₆H₃₃, размер пор
Размер колонки: 250 х 25 мм.

Подвижная фаза: 0,1 М водный раствор (NH₄)₂SO₄ - изо-пропанол, критическая концентрация десорбции инсулина Φ_c=16 об.%, рН 4,20. Скорость потока 30 мл/мин, нагрузка 5 г.

Продолжительность процесса 2,8 ч.

Выход фракции с содержанием инсулина 99,0% 3,96 г (90% от теор.). Производительность 0,36 г/см²•ч.

Пример 2.

Препаративное получение высокочистого инсулина из полуочищенного инсулина крупного рогатого скота.

Содержание основного вещества в исходном препарате 89% проинсулина - 5.000 м.д. дезамидоинсулина 3,9%
Прибор, условия детектирования аналогичны примеру 3.

Сорбент: макропористое стекло, модифицированное C₁₆H₃₃, размер пор .

Размер колонки: 250 х 25 мм.

Подвижная фаза: 0,05 М водный раствор K₂SO₄ изо-пропанол, Φ_c=17,6 об.%, рН 4,35. Скорость потока 30 мл/мин (А 10% Б 18,2%), нагрузка 4 г.

Продолжительность процесса 3 ч.

Выход фракции с содержанием инсулина 98,5% 3,57 г (91% от теор.). Производительность 0,34 г/см²•ч.

Пример 3. Препаративное получение высокочистого инсулина из полуочищенного генно-инженерного человеческого инсулина.

Содержание основного вещества в исходном препарате 90% дезамидоинсулина 5,1%
Прибор: препаративный хроматограф фирмы "Ленхром", детектирование - спектрофометр "Ленхром", λ 230 нм.

Сорбент: макропористое стекло, модифицированное C₁₈H₃₇, диаметр пор .

Размер колонки: 250 х 50 мм.

Подвижная фаза: 0,05 М водный раствор Na₂SO₄ - изо-пропанол, Φ_c-18,0 об.%., рН 4,45. Скорость потока 100 мл/мин, (А 1% Б 19%), нагрузка 35 г.

Продолжительность процесса 6 ч.

Выход фракции с содержанием инсулина 98,5% 3,6 г (90% от теор.). Производительность 0,27 г/см²•ч.

Пример 4.

Препаративное получение высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека.

Реализация способа осуществляется как в примере 2, но в качестве элюента А используют раствор состава:
0,05 М Na₂SO₄ 85 об.

изо-пропанол 15 об.

Выход фракции инсулина с содержанием 98,5% основного вещества составляет 90,5%
Продукт содержит 4 м.д. проинсулина и 0,6% дезамидоинсулина.

В результате реализации заявляемого способа получен инсулин со степенью чистоты не менее 98,5% с содержанием проинсулина не более 10 м.д. дезамидоинсулина не более 1,5% Потери массы при сушке полученного инсулина составляют не более 10% содержание нелетучего остатка не более 2% Таким образом, по степени чистоты полученный инсулин удовлетворяет требованиям мировых стандартов.

Заявляемый способ является высокопроизводительным и технологичным препаративным методом очистки инсулина:
1. Производительность заявляемого способа 0,27 0,35 г/см²•ч; способа-прототипа 0,11 г/см²•ч.

2. Выход целевого продукта: 88 91% в способе-прототипе 79 83% (от теор. ).

Такие результаты обусловлены, главным образом, условиями проведения ОФ ВЭЖХ. В условиях околокритической ступенчатой ОФ ВЭЖХ в режиме перегрузки и селективной десорбции при специальном подборе количественного и качественного состава элюентов удается выделить высокочистый (со степенью чистоты 98,5% ) инсулин в виде концентрированной фракции, что увеличивает выход целевого продукта и общую производительность процесса по сравнению с линейной градиентной элюцией в способе- прототипе.

В заявляемом способе в отличие от способа-прототипа используются нетоксичные растворители и расход их значительно уменьшен из-за изменения характера элюции.

Изобретение относится к области химии белка. Изобретение может найти применение в фармацевтике и медицине при изготовлении лекарственных форм инсулина. Изобретением решается задача препаративного получения высокоочищенного инсулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Способ отличается тем, что используют препаративную околокритическую обращенно-фазовую ВЭЖХ в режиме перегрузки и селективной десорбции инсулина. В качестве элюентов применяют смеси алифатических спиртов с водными 0,05 - 0,15 М растворами солей щелочных металлов или аммония с рН 4,20 -4,45, причем первый элюент содержит 1 - 15 об.% алифатического спирта, второй, десорбирующий, 16 - 30 об.% алифатического спирта, а регенерацию колонки осуществляют третьим элюентом, содержащим 50 - 60 об.% алифатического спирта. Производительность способа 0,28 -0,41 г/см²ч, содержание инсулина в полученном продукте - 98,5%, проинсулина - 8 м.д., дезамидоинсулина - 1,4%.

Способ получения высокоочищенного инсулина путем обработки полуочищенного инсулина млекопитающих с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии на кремнеземном сорбенте, модифицированном гидрофобными группами с последующей элюцией целевого продукта водноорганическими растворами, отличающийся тем, что в качестве элюирующего раствора используют 0,05 0,15 М водный раствор солей щелочных металлов или аммония в смеси с олифатическими спиртами при рН 4,20 - 4,45, а элюцию целевого продукта осуществляют вначале элюирующим раствором, содержащим 1 15 об. алифатического спирта, а затем элюирующим раствором, содержащим 16 30 об. олифатического спирта.