СПОСОБ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРАЦИИ КОМПЛЕМЕНТСВЯЗЫВАЮЩЕГО АНТИГЕНА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 1994 года по МПК C12N7/02 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусных диагностических препаратов и вакцин.

До настоящего времени в литературе отсутствуют данные о разработке способов очистки и концентрации комплементсвязывающего ("растворимого", невирионного, низкомолекулярного) антигена флавивирусов, перспективного при конструировании соответствующих вакцинных препаратов (Henchal E.A. et all., I. Gen. Virol. , 1988, 69, N 8, с. 21о1, Zhang Yi-Ming et all., I.Virol, 1988, 62, N 8, с. 3027).

Известно лишь использование для этой цели способа осаждения антигена из нативных вируссодержащих суспензий 70% -ным сульфатом аммония, а также способа осаждения антигена 7-21% ПЭГ.

Однако эти способы позволяют провести лишь грубое разделение белковой смеси в примерном соответствии молекулярному весу частиц и требуют применения в дальнейшем более тонких методов очистки. Кроме того, комплементсвязывающий (КС-) антиген вируса клещевого энцефалита (КЭ) в нативных суспензиях ассоциирован с "осколками" клеточных мембран и посредством их с другими клеточными мембранными белками. Как следствие этого, в таких суспензиях наблюдается очень широкая гетерогенность по размеру и составу частиц, обладающих КС-активностью. В этой связи разрушение мембран и удаление из суспензии липидов приводит к значительной унификации по размеру и составу белковых частиц. Именно такой, освобожденный от липидов (сахарозо-ацетоновый) антиген более перспективен в качестве субстрата очистки КС-антигена вируса КЭ.

Цель изобретения - повышение степени очистки и увеличение выхода комплементсвязывающего антигена вируса КЭ.

Для достижения поставленной цели вируссодержащие ткани экстрагируют ацетоном; освобожденный таким образом от липидов субстрат пропускают через колонку с СМ-целлюлозой при рН 6,0; очищенный антиген сорбируется на колонке с СМ-целлюлозой при рН 4,7 и смывается буфером рН 6,0 с 0,3 М NaCl. Принцип способа основан на физико-химических свойствах КС-белка вируса КЭ - величине его изоэлектрической точки (6,0 - 6,1) и стабильности при кислых значениях рН. В растворе рН 6,0 он не обладает зарядом и свободно проходит через колонку с ионообменником. При этом сорбируются "балластные" белки, у которых изоэлектрическая точка лежит выше (нейтральные и основные белки). Очистка от низкомолекулярных компонентов происходит на стадии гель-фильтрации через сефадекс G-25 или G-50. Частичная очистка происходит также при изменении рН раствора антигена с 6,0 до 4,3. Часть лабильных белков в этих условиях денатурируется и выпадает в осадок. Сорбция КС-антигена проводится в условиях, когда он заряжен положительно (рН 4,7), а десорбция проводится в минимальном объеме буфера рН 6,0 с 0,3 М NaCl. Использование на последней стадии - стадии концентрации антигена ДFАЕ-сорбента не позволяет достичь цели изобретения, т. к. в процессе сорбции - десорбции антигена его комплементсвязывающая активность почти полностью теряется.

Способ осуществляется следующим образом.

П р и м е р. Исходный субстрат - сахарозо-ацетоновый антиген вируса КЭ (штамм Нугуш) получают по модифицированному способу (авт.св. N 1378112). Для очистки и концентрации берут 15 мл антигена в боратном буфере, рН 9,0. Титр в РСК 1:128, А₂₈₀ антигена в разведении 1:100 1,0.

Смену буфера проводят на колонке (22х400 мм) с сефадексом G-25, уравновешенным 0,05 М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН 6,0. 15 мл исходного субстрата наносят на колонку и промывают ФБР рН 6,0. Сбор фракций начинают сразу же после выхода свободного объема колонки (15 мл) и продолжают до 32 мл. Объем антигена после смены буфера 17 мл, титр в РСК 1:128, рН 6,0.

Очистку антигена проводят на колонке диаметром 100 мм с 50 мл СМ-целлюлозы, покрытой предохранительным слоем из 50 мл сефадекса G-25. Всю колонку уравновешивают ФБР рН 6,0. 17 мл антигена в ФБР рН 6,0 осторожно наносят на колонку и промывают 200 мл ФБР рН 6,0. Сбор фракций ведут по 10 мл. Суммарный объем фракций антигена после очистки, содержащих КС-активность 150 мл, титр в РСК 1:8 - 1:16.

Концентрация. Все фракции после очистки, содержащие КС-активность (150 мл), объединяют и доводят рН концентрированной фосфорной кислотой до 4,3. При этом часть белков денатурирует и выпадает в осадок, который удаляют центрифугированием при 6000 об/мин. Осветленный антиген (150 мл) наносят на колонку (8х100 мм) с СМ-целлюлозой, уравновешенной ФБР рН 4,7. После нанесения антигена колонку промывают 30 мл ФБР рН 4,7. КС-антиген снимают с колонки ФБР рН 6,0 с 0,3 М NaCl во фракции по 1 мл. Фракции 1-10 проверяются на КС-активность. Титр в РСК фракции 2 и 3 соответствуют 1:4096, фракции 4 1: 1024, фракции 5 1:512, в остальных менее 1:128. А₂₈₀ фракций (без разведения) 1,0 - 0,8.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает выход антигена не менее 500% , способствует достижению 99% очистки от балластных белков при 200-кратной заключительной концентрации.

Положительный эффект - повышение специфической активности препарата, а следовательно, создание предпосылок для усовершенствования вирусных препаратов.

Использование: вирусология, в частности производство вирусных диагностических препаратов и вакцин. Сущность изобретения: вируссодержащий тканевой антиген, полученный методом сахарозоацетоновой экстракции и освобожденный таким образом от липидов, очищают от балластных белков на колонке с СМ-целлюлозой при рН (6,0 - 6,1); затем сорбируют на колонне с СМ-целлюлозой при рН 4,7 и смывают минимальным объемом буфера рН 6,0 с 0,3 М NaCl. При этом достигается не менее 99% очистки по белку, до 500% выхода комплементсвязывающей активности антигена при ее 100 - 200-кратной концентрации. Положительный эффект - повышение специфической активности препарата, а следовательно, создание предпосылок для усовершенствования вирусных препаратов.

СПОСОБ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРАЦИИ КОМПЛЕМЕНТСВЯЗЫВАЮЩЕГО АНТИГЕНА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, включающий химическую обработку вируссодержащего материала, отличающийся тем, что химическую обработку проводят путем сахарозоацетоновой экстрации с последующей очисткой на колонке с СМ-целлюлозой при рН 6,0 - 6,1, а концентрацию - сорбцией на колонке с СМ-целлюлозой при рН 4,7 и десорбцией минимальным объемом буфера рН 6,0 с 03 М NaCl.