Способ диагностики клещевого энцефалита Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для диагностики клещевого эн- цефалита (КЭ). Известен способ вирусологической диагностики КЭ, основанный на выделении возбудителя из материала от больных с использованием чувствительных биологических систем и последующей его идентификации в серологических реакциях с гипериммунными сыворотками.

Однако такой метод трудоемкий, продолжительный во времени и позволяет только ретроспективно подтверждать диагноз.

Известен также способ диагностики КЭ, основанный на определении вирусспецифи- ческих белков с помощью современных экспресс-методов: метода флюоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА). Однако, использование для диагностики КЭ МФА требует, как правило, предварительного накопления вируса в чувствительной биологической системе. К тому

же метод трудно стандартизуем и не исключает получения ложноположительных результатов. Использование же ИФА ограничено из-за пригодности последнего для исследования крови больных, а также возможных ложноположительных результатов за счет взаимодействия ревматоидного фактора c.lg.Y человека и животных.

Цель изобретения: ранняя диагностика и повышение точности способа.

Для. достижения поставленной цели способ предусматривает получение очищенных стандартизованных препаратов вирусной РНК из биологических проб от больных КЭ (кровь) и последующее выявление ее в реакции молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с Р-меченными ДНК-зондами.

Способ осуществляют следующим образом:

Из исследуемого клинического материала выделяют суммарные нуклеиновые кислоты. Наносят их на нитроцеллюлозный

ч|

ч

00

о ю ю

фильтр, фиксируют отжигом и гибридизиру- ют с меченным радиоактивным изотопом 32Р зондом, содержащим фрагменты генома вируса КЭ штамма Софьин. Отгибридизо- ванный фильтр экспонируют с рентгеновской пленкой. Содержание вирусной РНК в исследуемой пробе определяют полуколичественно, сравнивая интенсивность и размер засвеченных участков пленки со стандартными сигналами. При содержании РНК вируса КЭ в исследуемой пробе 10 пг диагностируют КЭ,

Пример конкретного выполнения изобретения.

Выявление РНК вируса КЭ из крови больных.

Кровь для исследования в количестве 500 мкл вносят в стерильную полипропиленовую пробирку с раствором натриевой соли этилендиаминтетрзуксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 8 мМ с целью предотвращения свертывания крови. Затем к пробе добавляют 500 мкл фенола, насыщенного 10 мМ раствором ацетата натрия до рН 5.2 и додецилсульфат натрия до содержания 0,5 мас.%. Смесь инкубируют на водяной бане в течение 15 мин при 60°С, периодически встряхивая, охлаждают 15 мин при -20°С, центрифугируют и отбирают 200 мкл водной фазы. Добавляют 20 мкл ЗМ раствора ацетата натрия (рН 5,2) до конечной концентрации 0,3 М, три объема перегнанного этилового спирта, встряхивают и осаждают РНК при -40°С в течение 1 ч. Затем образцы центрифугируют при 8000- 10000 об/мин, водноспиртовую фазу удаляют, а осадок промывают спиртом и растворяют в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. В пробирку помещают 20 мкл полученного раствора, добавляют 20 мкл 50 мМ фосфатного буферного раствора, содержащего пзраформальдегид (до 7,5% концентрации), прогревают на водяной бане при 55°С в течение 15 мин для денатурации нуклеиновых кислот. Затем пробирку охлаждают во льду, добавляют 40 мкл 5М раствора NaCI и наносят пробу на нитроцел- люлозный фильтр. Нуклеиновые кислоты фиксируют на фильтре прогреванием в вакуумном сушильном шкафу при 80°С в течение 2 ч, Отожженные фильтры помещают в гибридизационный раствор, содержащий 0,02% (вес/объем) фиколла-400, 0,02% (вес/обьем), бычьего сывороточного альбумина, 0,02% (вес/объем) поливинилпирро- лидона, 100 мкг/мл денатурированной при 100°С в течение 5 мин ДНК быка, а также 100 мкг/мл денатурированной суммарной РНК дрожжей, 0.5% додецилсульфата натрия, 0.09М цитрата натрия в 0.9М NaCI (рН

7,0). Гибридизационный раствор используют из расчета 0,5 мл на 1 см2 фильтра, инкубируют 2 ч при 65°С, а затем добавляют 50 нм/мл денатурированного зонда (32Р-меченнаякДНК-ВКЭ)и инкубируют 12-18ч при 65°С. После этого фильтры отмывают в растворе, содержащем 0.015М цитрата натрия в 0,15 М NaCI рН 7,0, при 55°С трижды по 30 мин. Фильтры сушат при комнатной температуре и экспонируют с рентгеновской пленкой РМ-1 или РТ-1 (Тасма) в течение 4-24 ч, которую затем проявляют.

В качестве положительного контроля используют ДНК рекомбинантной плазмиды, несущей ДНК-копии (кДНК) генома вируса КЭ штамма Софьин в количестве 1000 пг, 100 пг, 10 и 1 пг. Отрицательными конт- ролями служат дрожжевая РНК и ДНК быка, каждая в количестве 1 мкг в пятно, а также

РНК, выделенная из донорской крови. Результаты реакции оценивают визуально, сравнивая интенсивность и размер пятен в образцах со стандартами. Положительными считают пробы, интенсивность сигнала которых 10 пг кДНК вируса КЭ, 1 пг - отрицательными, а 1-10 пг - слабоположительными. В последнем случае обследование повторяют. Содержание в крови 10 пг РНК вируса считают диагностически значимым.

Предлагаемый способ апробирован на 400 пробах крови, полученных от 123 больных. Использование гибридизационного анализа для индикации РНК вируса КЭ в

пробах крови больных с разным клиническим течением заболевания позволило при многократном их обследовании подтвердить диагноз в 82% случаев, в то время как при анализе с помощью биопробы-в 53%.

Положительный эффект - усовершенствование лабораторной диагностики КЭ. Высокая специфичность способа исключает необходимость дополнительной вирусологической идентификации, в связи с чем использование предлагаемого способа позволяет обеспечить экспрессную и раннюю диагностику КЭ. Способ, ориентированный на раннее выявление возбудителя,

позволяет оптимизировать тактику лечебных мероприятий,

Формула изобретения Способ диагностики клещевого энцефа- лита путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что, с целью ранней диагностики и повышения точности способа, в крови определяют содержание РНК вируса клещевого энцефалита путем молекулярной гибридизации

нуклеиновых кислот с ДНК-зондом, мече- уровне 10 пг и более диагностируют клеще- ным радиоактивным фосфором, и при его вой энцефалит.

Использование: в медицине, в частности в вирусологии, и касается диагностики клещевого энцефалита. Сущность изобретения: определяют в биологическом материа- .ле содержание РНК вируса клещевого энцефалита путем молекулярной гидриди- зации нуклеиновых кислот с ДНК - зондом, меченным радиоактивным фосфором и при его уровне 10 пг и более диагностируют клещевой энцефалит. Способ позволяет осуществлять раннюю диагностику и повысить его точность до 82%.