Штамм бактерий РSеUDомоNаS Sp.,разлагающий нафталин и антрацен Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 C02F3/34 C02F101/30 

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма бак- . терий, способного к высоким скоростям разложения нафталина и антрацена, и который может быть использован для очистки сточных вод различных производств, а также почв, загрязненных этими соединениями.

Нафталин и антрацен являются токсичными, высокоустойчивыми компонентами почв и сточных производственных вод, загрязняющими окружающую среду.

Целью изобретения является получение нового штамма, способного с более высокими скоростями осуществлять деградацию нафталина и антрацена о

Штамм Pseudomonas sp. ВКПМ В-3343 (рабочий номер 16 N2) вьзделен из о сточных вод предприятий микробиологической промышленности с помощью метода длительной экспериментальной адаптации. Взятые активзше илы помещались в минеральную среду, содержащую нафталин как единственный источник углерода и энергии в концентра- Щ1И 1 г/л. Через 10 сут культивирования небольшую аликвоту (25 мл) переносили в свежую среду с нафталином. Подобные операции проводились до появления заметного роста микроорганизмов. Затем клеточную суспензию высевали на твердую минеральную среду с нафталином в соответствующем(

О) СП

4

Q1

CD

10

15

20

разведении для получения единичных колоний. У отобранных штаммов проверяли активность по разложению нафталина. Наиболее; интересные высевали на среды, содержащие нафталин и антрацен. При обнаружении деградации антрацена культуры высевали на жидкие среды с антраценом, как единственным источником углерода и энергии. Штамм Pseudomonas sp. ВКПМ В-3343 бьл отобран как наиболее активный деструктор нафталина и антрацена, присутствующих в среде как вместе, так и отдельно.

Характеристика штамма Pseudomonas sp. ВКПМ В-3343. Среды для хранения: МПА и минеральные среды с нафталином или тетрадеканом.

Морфологические признаки: парные палочки, слабоизогнутые,, длина клеток 1,2-2,4 мкм, ш-фина 0,8-0,9 мкм у 24 часовой культуры, выросшей на мясопептонном бульоне, грамотрица- тельные, подвижные, спор не образуют, 25 ра,змножаются делением.

Физиологические признаки: аэроб, температурный оптимум +25 - -30 С, растет при +4°С, не растет при +42 С, оптимум рН 6,8-7,5. Культуральные признаки:

на мясо-пептонном агаре культура на третьи сутки образует круглые, S-формы колонии диаметром 2-3,5 мм, при росте на нафталине в минеральную среду выделяется темно-коричневый пигмент. Рост на мясо-пептонном бульоне с образова1шем пленки белого цвета и небольиим выделением газа .

14654564

бензоат, толуол, м-ксилол, салици- лат, бифенил и фенантрен.

Штамм Pseudoraonas sp. ВМПМ В-3343 деградирует молекулы нафталина и антрацена, используя их в качестве единственных источников углерода и энергии. При концентрации нафталина в среде 5 г/л его полное разрушение наступает через 4-5 сут, при концентрации антрацена в среде 1 г/л процесс полной деструкции занимает около 3 сут, при совместном содержании по 0,5 г/л оба субстрата отсутствуют в среде через 24 ч.

Пример 1 . Штамм Pseudomonas sp. ВМПМ В-3343 выраирвали в жидкой среде с нафталином в течение 3 сут. Состав среды, г/л: 3,4,К,НР04

30

4,3, (N114)2804 2,о; MgCl 0,26, CaCli 0,026; микроэлементы, мг/л: MnCli-4H20 1, PeSO 7Н20 0,б1 Na,Mo04 2Н,0 2, нафталин 5 г/л,дистиллированная вода, р Н 6,8-7,1.Через 3 сут культивирования нафталина в среде содержится менее 10% от исходного, на 5 сут он в среде отсутствует.

Трехсуточной суспензией выросшей культуры засевали минеральную среду с антраценом (концентрация 1 г/л) .и выращивали на качалке при 200 об/ми в течение 2 сут, температура ферментации 28°С. Контроль за процессом разложения осуществляли с помощью методов газо-жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, для чего культуральную жидкость подкисляли 1 н КС1 до рН 2,0, экстрагировали диэтиловым эфиром, растворитель упа- ривали на роторном испарителе, тщательно высушенный остаток растворяли в 0,3 МП пиридина и добавляли 0,1 мл силир ующего агента (Ы,0-бис „ 45 (триметилсилил)-трифторацетамид).Наличие метаболитов выявляли на газо- зкидкостном хроматографе и идентифицировали методом масс-спектрометрии.

35

40

Биохимические признаки: гштратывосстанавливает, желатину разжижает, крахмал не гидролизует, при росте на средах, содержащих органическую серу, выделяет сероводород, обладает оксидазной, каталазной и липазной активностью, при росте на среде КИНГ А вьщеление флуоресцирующего пигмента не наблюдается,усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу и рамнозу с образованием кислоты, подкисление среды не наблюдается при росте на мальтозе и лактозе, из спиртов ассимилирует этанол, глицерин, манггит, из алифатических углеводородов - соединения с длиной цепи от восьми до двадцати .углеродных атомов, из ароматических углеводородов - пирокатехин, бензол.

0

25

Пример 1 . Штамм Pseudomonas sp. ВМПМ В-3343 выраирвали в жидкой среде с нафталином в течение 3 сут. Состав среды, г/л: 3,4,К,НР04

30

4,3, (N114)2804 2,о; MgCl 0,26, CaCli 0,026; микроэлементы, мг/л: MnCli-4H20 1, PeSO 7Н20 0,б1 Na,Mo04 2Н,0 2, нафталин 5 г/л,дистиллированная вода, р Н 6,8-7,1.Через 3 сут культивирования нафталина в среде содержится менее 10% от исходного, на 5 сут он в среде отсутствует.

Трехсуточной суспензией выросшей культуры засевали минеральную среду с антраценом (концентрация 1 г/л) .и выращивали на качалке при 200 об/мин в течение 2 сут, температура ферментации 28°С. Контроль за процессом разложения осуществляли с помощью методов газо-жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, для чего культуральную жидкость подкисляли 1 н КС1 до рН 2,0, экстрагировали диэтиловым эфиром, растворитель упа- ривали на роторном испарителе, тщательно высушенный остаток растворяли в 0,3 МП пиридина и добавляли 0,1 мл силир ующего агента (Ы,0-бис „ 45 (триметилсилил)-трифторацетамид).Наличие метаболитов выявляли на газо- зкидкостном хроматографе и идентифицировали методом масс-спектрометрии.

35

40

Через 2 сут культивирования остаточное количество антрацена составляло менее 0,1% от исходного, на 3 сут антрацен в среде не обнаружен. Одним из на:иболее характерных метаболитов, обнаруженных в эфирном экстракте, являлась гидроксинафтойная кислота, что может служить доказательством микробиологического разложения антрацена.

Пример 2.В лабораторную установку аэротенк-биофильтр, прея ставляющую собой колонку, загруженную волокнами триацетилцеллюлозы с иммобилизованными в них в процессе формования клетками Pseudomonas sp. ВМПМ В-ЗЭАЗ и совмещенного с ней аэротенка снизу перистальтическим насосом подавали син- етический сток (раствор нафталина (40 мг/л) в водопроводной воде) . Объем колонки 100 мл, скорость подачи жидкости 1 мл/с, аэрация 3,3 мл/с, температура 20°С, рН 7,15. Установка эффективно работала весь испытательный срок, составляющий 60 сут, в выходящей воде содержание нафталина устойчиво не превышало 10 мкг/л. Микрбиологический контроль чистоты используемой культуры, произведенный на: 50 сут работы установки, показал отсутствие заражения биофильтрат побочной микрофлорой.

Пример З.В нижнюю часть лабораторной установки, описанной в примере 2, перистальтическим насосом подавали синтетический сток,представляющий собой раствор антрацена (5 мг/л) в водопроводной воде. Режим зксппуатации установки тот же, что и

зо

465456

в примере 2, рН 7,05. Установка работала в течение 30 сут, в выходящей воде антрацена обнаружено не было. Пример 4.В нижнюю часть лабораторной установки, описанной в примере 2, перистальтическим насосом подавали синтетический сток,состоящий, г/л: ацетон 0,1, этанол 0,2,

10 бензол 0,1, нафталин 40, антрацен 5, аммонийные соли 2. Скорость подачи синтетического стока составляла 0,5 МП/с, рН 7,0. Установка работала в течение 30 сут, в выходящей воде

f5 нафталина и антрацена обнаружено не было.

Таким образом, предлагаемый штамм Pseudomonas sp. ВМПМ В-3343, способный разлагать нафталищи антрацен,

20 может быть использован для деградации этих соединений при высокс их содержании в почвах или промышленных стоках, кроме того, новый штамм может быть применен в доочистке ряда

25 стоков, содержащих в выходящей воде нафталин в концентрации 5-10 мг/л.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas sp. .ВКПМ В-3343, разлагающий нафталин и антрацен.

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Pseudomonas sp. ВКПМ В-3343, разлагающий нафталин и антрацен. Штамм может быть использован для очистки сточных вод и загрязненных почв от этих соединений. Целью изобретения является получение нового штамма, способного с более высокими скоростями осуществлять деградацию нафталина и антрацена. При концентрации нафталина в среде 5 г/л его полное разрушение наблюдается через 4-5 суток. Полная деструкция антрацена при исходной концентрации 1 г/л происходит через 3 сут, при совместном содержании по 0,5 г/л оба субстрата отсутствуют в среде через 24 ч. i О)