СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к способам приготовления питательных сред для выращивания микроорганизмов, а именно к способам приготовления плотных питательных сред, и может быть использовано в практике научно-исследовательских микробиологических лабораторий и в микробиологическом производстве.

Известен способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов, где в качестве уплотнителя используется карраген, полученный путем экстрагирования из ирландского мха Chondrus crispus [1]
Общим с заявляемым способом является использование в качестве уплотнителя питательной среды гельобразующего вещества растительного происхождения.

К недостаткам данного способа следует отнести высокую себестоимость готовой питательной среды, обусловленную сложностью ее приготовления, которая заключается в том, что растворы каррагена имеют pH, равный 7,6, и в своем составе содержат фосфаты, нитраты и мочевину. Эти вещества создают высокую буферную емкость и затрудняют корректировку pH. Дополнительная очистка каррагена трудоемка, что приводит к удорожанию готовой питательной среды.

Известен способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов, где в качестве уплотнителя используется поливиниловый спирт [2]
Общим с заявляемым способом является использование уплотнителя питательной среды, не уступающего по прочности агаровым студням.

К недостаткам данного способа следует отнести высокую себестоимость готовой среды за счет большого расхода поливинилового спирта (40.150 г/л воды).

Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления плотной среды, где в качестве уплотнителя используется агар-агар в количестве 2.5% в зависимости от вида среды и качества самого агар-агара [3] Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют необходимое количество агар-агара и нагревают до полного растворения в аппарате или в автоклаве текучим паром в течение 40.90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2.3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют pH, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют автоклавированием при температуре 120^oC 15.30 мин. После стерилизации плотной питательной среде в посуде придают нужную форму.

Общим с заявляемым способом является внесение в жидкий питательный субстрат источников углерода, азота, фосфора, минеральных солей, микроэлементов и уплотнителя.

К недостаткам данного способа следует отнести высокую себестоимость готовой питательной среды, обусловленную сложностью переработки и дополнительной очистки агар-агара, а также удаленностью сырьевой базы для его получения (в России агар-агар производят в Южном Приморье, Южном Сахалине, на юге Курильских островов, Белом море).

Задачей изобретения является снижение себестоимости питательной среды и расширение сырьевой базы приготовления питательных сред.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве уплотнителя питательной среды в комбинации с агар-агаром используется растительный полимер лихенин, полученный из лишайника Cetraria islandica.

Возможность использования лихенина в качестве уплотнителя питательной среды для выращивания микроорганизмов установлена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информация.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. В питательный субстрат помещают необходимое количество уплотнителя (смесь из агар-агара и лихенина) и кипятят его до полного расплавления. Затем смесь фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, при необходимости корректируют pH, добавляют источники углерода, азота, фосфора, минеральных солей, микроэлементов и стерилизуют автоклавированием в стандартных условиях. Затем разливают в посуду для культивирования микроорганизмов: чашки Петри, пробирки, колбы, матрацы и др. Полученные плотные питательные среды выдерживают 1 сут и засевают известным способом (шпателем, иглой, пипеткой и т.п.), после чего инкубируют требуемое время в условиях, необходимых для культивирования конкретных микроорганизмов.

В табл.1 представлена сравнительная характеристика основных показателей уплотнителей питательных сред лихенина и агар-агара. При оценке физико-химических свойств лихенина в качестве критерия сравнения выбрали показатели, используемые для характеристики агара микробиологического, изложенные в ГОСТ 17206-84, поскольку до настоящего времени агар-агар является основным уплотнителем в производстве плотных питательных сред.

По результатам, представленным в табл.1, видно, что содержание золы и азотистых веществ в агаре и лихенине практически одинаково. Кроме того, лихенин обладает лучшей растворимостью, не содержит ионов йода и тяжелых металлов в концентрациях, ингибирующих рост микроорганизмов. Различие по показателю содержания влаги препаратов объясняется существованием различий в методах высушивания и не влияет на качество получаемых студней.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в табл.2.

Изобретение позволяет снизить себестоимость питательной среды за счет введения в ее состав лихенина и уменьшения количества агара. Использование в составе питательной среды лихенина вместо агар-агара не ухудшает ее качества по физико-химическим и ростовым свойствам.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Выделение лихенина. Берут 1 кг предварительно очищенного от механических примесей сухого лишайника, заливают его 80 л дистиллированной воды и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Затем воду сливают и заливают 12 л 0,25%-ного раствора пищевой соды. Смесь выдерживают в течение часа при комнатной температуре. По истечение этого времени раствор сливают и заливают 12 л вновь приготовленным раствором. Эту операцию повторяют трижды. Затем лишайник отмывают проточной водопроводной водой в течение 1 ч, проверяют реакцию промывных вод. Если реакция отлична от нейтральной, процедуру отмывки проточной водопроводной водой повторяют. В отмытый лишайник добавляют 20 л дистиллированной воды, доводят до кипения и при медленном огне вываривают в течение 1 ч. Отвар выстаивают в течение 15.30 мин и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Затем в лишайник добавляют 4 л дистиллированной воды, доводят до кипения и при медленном огне вываривают в течение 1 ч. Отвар снова фильтруют и собирают в емкость. В полученный этим способом отвар добавляют 5% угля активного осветляющего древесного порошкообразного и доводят до кипения. Смесь кипятят 10.15 мин и затем оставляют горячей на 2.3 ч осаждения, после чего фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Из полученного отвара выделяют лихенин различными способами, которые не оказывают существенного влияния на качество конечного продукта.

1. Метод замораживания-оттаивания.

Отвар лихенина разливают в металлические кюветы слоем 0,8.1,0 см и замораживают при температуре минус 10.15^oC. Операцию ведут в течение 10.12 ч. Затем вымороженный отвар лихенина разрезают на тонкие кусочки и промывают в проточной водопроводной воде в течение 20.30 мин. Промытая студнеобразная масса выкладывается на решетки и выдерживается при комнатной температуре до получения готового сухого продукта.

2. Метод сублимационного высушивания.

Отвар лихенина разливают по кюветам слоем 0,8.1,0 см и выдерживают в сублимационной установке камерного типа в течение 35 ч по следующему режиму: температура замораживания минус 35^oC, греющих плит от минус 35^oC до 25^oC (температура греющих плит повышается постепенно, начиная с 5 ч сушки), температура конденсатора не выше 50^oC, величина вакуума не более 200 мкм рт. ст.

Сухой лихенин в зависимости от метода высушивания представляет собой либо порошок, либо волокнистые пористые пластины белого цвета.

Пример 2. Получение питательной среды на основе лихенина.

Плотные питательные среды, содержащие лихенин, готовят и используют по аналогии с агаризованными средами. Концентрация питательных субстратов - органических и минеральных веществ находится в пределах, используемых для приготовления плотных питательных сред, на которых культивируются микроорганизмы. При приготовлении плотных сред учитывалось то, что смесь из 1% агар-агара и 3% лихенина по прочности студня и другим физико-химическим свойствам не уступает 2% агаровым средам (табл.3).

По результатам, представленным в табл.3, видно, что такие показатели качества студня, как прочность, падение прочности и температура плавления, в агаровых и лихениновых студнях имеют одинаковые значения.

Плотные питательные среды, содержащие лихенин и агар-агар, эластичные, гладкие, хорошо держатся в чашках Петри в перевернутом состоянии, посев культур и снятие их бактериологической петлей не затруднен.

Пример 3. Ростовые свойства питательных сред, полученных по заявляемому способу, в сравнении со средами, полученными по способу-прототипу.

Рост микроорганизмов различных систематических групп на плотных питательных средах, приготовленных согласно заявляемому способу, в сравнении с агаровыми средами, приготовленными по способу-прототипу, дан в табл.4.

Примечания к табл.4. Среда 1: бульон Хоттингера до амин.азот (110±10 мг% NfCl-0,5% KCl-0,02% Na₂HPO₄-0,1% pH=(7,0.7,2).

Среда 2: 6% солянокислотный недеионизированный гидролизат казеина до амин.азот 25-30 мг% KH₂PO₄-0,1% K₂HPO₄-0,1% MgSO₄-0,03% FeSO₄-0,03% глицерин 1% pH+(6,8.7,0).

Среда 3: триптический гидролизат рыбной кормовой муки до амин.азота (110±10) мг% NaCl-0,5% pH+(6,8.7,0).

Среда 4: мясная вода 100 мл, пептон 1% NaCl-0,5% глюкоза-0,5% pH+(6,8. 7,0).

Среда 5: мясная вода 1000 мл, пептон 10% NaCl-0,5% pH+(7,8.8,8).

Среда 6: сусло по известному способу (Т.Н.Симушина, Н.И.Монахова, Л. АГусарева. Микробиологический контроль гидролизно-дрожжевого производства. - М. 1991).

Среды, приготовленные по способу-прототипу, помимо уплотнителя не отличаются от сред, приготовленных по заявляемому способу. При приготовлении плотных питательных сред, а именно при выборе концентрации уплотнителя учитывалось то, что смесь из 1% агар-агара и 3% лихенина по прочности студня и другим физико-химическим свойствам не уступает 2% агаровым средам.

По результатам, представленным в табл.4, видно, что на экспериментальных (с лихенином) и контрольных (с агар-агаром) средах в специфичных для конкретного вида микроорганизма условиях рост и развитие микробных культур были идентичны.

Использование: изобретение относится к способам приготовления питательных сред для выращивания микроорганизмов, а именно к способам приготовления плотных питательных сред, и может быть использовано в практике научно-исследовательских микробиологических лабораторий и в микробиологическом производстве. Сущность изобретения: в качестве уплотнителя питательной среды в комбинации с агар-агаром используется растительный полимер лихенин, полученный из лишайника Cetraria islandica. При этом достигается снижение себестоимости питательных сред и расширение сырьевой базы для их приготовления. 4 табл.

Способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов, предусматривающий внесение в жидкий питательный субстрат источников углерода, азота, фосфора, минеральных солей, микроэлементов и уплотнителя, отличающийся тем, что в качестве уплотнителя питательной среды в комбинации с агар-агаром используют растительный полимер лихенин, полученный из лишайника Cetraria islandica.