ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ФI-АНТИГЕНА JERSINIA PESTIS ГЛУБИННЫМ СПОСОБОМ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к питательным средам, и может быть использовано для накопления Ф1-антигена.

Известна синтетическая питательная среда для накопления Ф1-антигена, содержащая 24 аминокислоты, урацил, никотинамид, биотин, тиамин, пантотенат кальция, глюкозу, альфа-кетоглутарат, цитрат и глюконат натрия, ионы магния, кальция, железа, калия, цинка, марганца, меди, а также фосфат аммония, сульфат и бикарбонат.

Накопление Ф1-антигена на этой среде происходит в течение 4 сут при 37^oC. Титр антигена составляет 640 АЕ/мл.

К недостаткам данной питательной среды следует отнести: сложность ее изготовления, высокую стоимость и трудоемкость приготовления, длительность процесса накопления Ф1-антигена при ее использовании.

Получение Ф1-антигена на данной питательной среде повышает себестоимость целевого продукта. Высокая себестоимость Ф1-антигена обусловлена большой стоимостью компонентов среды (аминокислот, витаминов и т.п.), а также трудоемкостью изготовления самой среды.

Наиболее близкой к заявляемой является питательная среда для получения Ф1-антигена из живых чумных микробов, питательной основой которой является 5-7-суточный перевар казеина по Хоттингеру (Вейнблат В.И. и др.// Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры. Саратов, 1980, с. 36-39). В состав среды входит глюкоза, двууглекислый и хлористый натрий. Накопление Ф1-антигена с использованием этой питательной среды происходит в течение 36-42 ч при 37^oC. Выход Ф1-антигена составляет 64-128 АЕ/мл.

К недостаткам данной питательной среды следует отнести: длительное приготовление питательной основы, что повышает себестоимость среды и целевого продукта, низкий титр Ф1-антигена и длительность процесса его накопления.

Снижение себестоимости питательной основы за счет сокращения времени гидролиза не приводит к повышению титра Ф1-антигена и сокращению времени его накопления, т. к. известная питательная среда не содержит в своем составе стимуляторов роста.

Общими с заявляемой средой являются следующие компоненты: питательная основа, глюкоза, хлористый натрий и вода.

Целью изобретения является увеличение выхода Ф1-антигена при одновременном снижении его себестоимости.

Поставленная задача решается благодаря тому, что среда, состоящая из питательной основы, глюкозы, хлористого натрия и воды, дополнительно содержит экстракт кормовых дрожжей, сернокислый магний, цистин, одно- и двузамещенный фосфорнокислый калий, а в качестве питательной основы она содержит 4-5-часовой панкреатический гидролизат казеина при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат казеина 37-42
K₂HPO₄ 0,3-0,5
KH₂PO₄ 2,1-2,3
NaCl 0,1-0,2
MgSO₄ 1,0-1,1
Цистин 0,9-1,0
Глюкоза 0,9-1,1
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) 4,5-5,5
Водопроводная вода 1 л
Увеличение выхода Ф1-антигена обусловлено повышением ростовых свойств питательной среды за счет использования стимулятора роста и источника витаминов в виде цистина, экстракта кормовых дрожжей и питательной основы из 4-5-часового гидролизата казеина, содержащего аминокислоты и низкомолекулярные пептиды. Снижение себестоимости Ф1-антигена достигается за счет использования дешевой питательной основы, сокращения продолжительности самого процесса накопления целевого продукта и увеличения его выхода в 2-3 раза.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатам показано в табл. 1.

Изобретение позволяет значительно снизить себестоимость питательной среды и Ф1-антигена, повысить ростовые свойства питательной среды и сократить время накопления Ф1-антигена глубинным способом.

Предложенную питательную среду получают следующим образом: в реактор заливают 4-5-часовой панкреатический гидролизат казеина и водопроводную воду до содержания аминного азота (150±30) мг% по расчету. Смесь перемешивают, нагревают до кипения и отбирают пробу для контроля и корректировки аминного азота. В случае необходимости добавляют воду или гидролизат, анализ повторяют. Затем в бульон вводят соли из расчета, г/л среды: KH₂PO₄ - 2,2±0,1; K₂HPO₄ 0,4±0,1; MgSO₄ - 1,05±0,05; NaCl 0,15±0,05. Смесь нагревают до кипения "глухим" паром и кипятят 6-12 мин, после чего отбирают пробу для контроля и корректировки кислотности среды в пределах 7,2-7,6 ед. pH. Корректировку проводят 10% -ными растворами NaOH или HCl. Бульон охлаждают до температуры (75±5)^oC и фильтруют на фильтр-прессе через картон марки Т. Затем отбирают пробу для контроля pH и аминного азота. Полученный бульон передают в культиватор, где его стерилизуют в течение 45-50 мин при температуре 125-130^oC. Затем питательную среду охлаждают до температуры (37±1)^oC и вводят стерильные растворы из расчета, г/л: глюкозы (1,0±0,1); ЭКД (5,0±0,5); цистина (0,9±0,05).

Среда представляет собой жидкость светло-желтого цвета.

Пример 1. В реактор заливают 4-5-часовой панкреатический гидролизат казеина и водопроводную воду до содержания аминного азота 150 мг% по расчету. Смесь перемешивают, нагревают до кипения и отбирают пробу для контроля и корректировки аминного азота. В случае необходимости добавляют воду или гидролизат, анализ повторяют. Затем в бульон вводят соли из расчета, г/л среды: KH₂PO₄ 2,1; K₂HPO₄ 0,3; MgSO₄ 1,0; NaCl 0,1. Смесь нагревают до кипения "глухим" паром и кипятят в течение 6-12 мин, после чего отбирают пробу для контроля и корректировки кислотности в пределах 7,2-7,6 ед. pH. Корректировку проводят 10%-ными растворами NaOH или HCl. Бульон охлаждают до (75±5)^oC и фильтруют на фильтр-прессе через картон марки Т. Полученный фильтрат передают в культиватор, где стерилизуют его при 125-130^oC в течение 45-50 мин. Затем фильтрат охлаждают до (37±1)^oC и вводят стерильные растворы из расчета, г/л: глюкозы 1,0; ЭКД 5,0; цистина 0,9.

Пример 2. Получение Ф1-антигена.

В готовую питательную среду вводят посевной материал субкультуру чумного микроба штамм EB. Выращивание проводят в течение 27 ч при температуре (37±1)^oC, pH, равном 6,9-7,4 ед. pH, и при постоянном механическом перемешивании и аэрации 0,3 объема воздуха на объем среды в минуту.

В табл. 2 указано количество накапливаемого Ф1-антигена при использовании прототипа и заявляемой среды.

Пример 3. Исходные данные состава среды, г/л: панкреатический гидролизат казеина 37; KH₂PO₄ 2,3; K₂HPO₄ 0,5; MgSO₄ 1,1; NaCl 0,2; цистин 1,0; глюкоза 0,9; ЭКД 4,5; водопроводная вода 1 л.

В готовую питательную среду вводят посевной материал и выращивают по примеру 2. Через 27 ч выращивания количество Ф1-антигена составило 256 АЕ/мл.

Использование: микробиология, питательная среда, Ф1-антиген. Сущность изобретения: питательная среда содержит следующие компоненты, г/л: 4-5-часовой панкреатический гидролизат казеина 37-42; K₂HPO₄ 0,3-0,5; KH₂PO₄ 2,1-2,3; NaCl 0,1-0,2; MgSO₄ 1,0-1,1; цистин 0,9-1,0; глюкоза 0,9-1,1, экстракт кормовых дрожжей 4,5-5,5. Указанные компоненты (кроме цистина, глюкозы и экстракта кормовых дрожжей) добавляют в раствор гидролизата и воды, устанавливают pH 7,2-7,6, стерилизуют, охлаждают и вводят стерильные растворы цистина, глюкозы и экстракт кормовых дрожжей. Питательная среда обеспечивает увеличение Ф1-антигена чумного микроба до титра 256 АЕ/мл в течение 27 ч культивирования глубинным способом. 2 табл.

Питательная среда для накопления Ф1-антигена Jersinia pestis глубинным способом, содержащая питательную основу, глюкозу, хлористый натрий и воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит одно- и двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, экстракт кормовых дрожжей, цистин, а в качестве питательной основы содержит 4 5 часовой панкреатический гидролизат казеина при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат казеина 37 42
Двузамещенный фосфорнокислый калий 0,3 0,5
Однозамещенный фосфорнокислый калий 2,1 2,3
Хлористый натрий 0,1 0,2
Сернокислый магний 1,0 1,1
Цистин 0,9 1,0
Глюкоза 0,9 1,1
Экстракт кормовых дрожжей 4,5 5,5
Водопроводная вода 1 ли