Изобретение относится к медицине и медицинской биотехнологии. Рекомбинантный альбуминсвязывающий рецептор (HSA) а типа из человеческого группы G стрептококка. HSA рецептор обладает способностью связывать человеческий сывороточный альбумин. Кроме человеческого альбумина рецепторы этого типа связывают сывороточный альбумин мыши, крысы, морской свинки и собаки, но не связывает альбумин быка, козы и кролика.
Благодаря способности связывать человеческий сывороточный альбумин HSA рецептор может быть использован в иммунологических исследованиях. HSA рецептор может быть использован в ELISA диагностических тест-системах для определения уровня альбумина в любых биологических жидкостях человека при различных видах патологии и в норме. HSA рецептор может быть эффективным лигандом для аффинной хромотографии, с помощью которой может быть получен высокоочищенный альбумин человека и некоторых млекопитающих.
Из литературы известно, что многие стрептококковые штаммы, экспрессирующие G белок, связывают человеческий сывороточный альбумин. Известно, что полноценный ген G белка кодирует белок, имеющий молекулярный вес 65 кД, и обладающий как lgG связывающей, так и альбуминсвязывающей активностью. Сайты связывания для lgG и альбумина находятся раздельно в разных частях молекулы G белка, lgG связывающей рецептор локализован в С-терминальной части; в то время как албумин-связывание происходит за счет N-терминальных доменов. (1, 2, 3).
HSA рецептор может быть выделен из стрептококка энзиматической обработкой клеточной взвеси папаином (нативный G белок) с последующей обработкой этой взвеси бактериолитическим агентом мутанолизином, или экстракцией 0,6 М HCL при кипячении. Он может быть получен также и генно-инженерным путем (рекомбинантный белок).
При обработке стрептококка, экспрессирующего G белок, мутанолизином, образуется 14 кД пептид, который связывают только HSA, но не lgG. Связывание альбумина с полноразмерным G белком (65 кД) гораздо выше, чем с 14 кД пептидом (3). Следовательно, мутанолизиновый метод не позволяет выделить полноценный альбуминсвязывающий белок.
Выделение HSA рецептора методом экстракции соляной кислотой из стрептококка, характеризуется гетерогенностью получаемого продукта. Полностью отделить HSA рецептор от lgG связывающей активности таким образом не удается (4). Кроме того выделение HSA рецептора из спрептококка характеризуется трудоемкостью технологического процесса, связанной с использованием условно-патогенного микроба. Ввиду этого предпочтительным является получение рекомбинантного белка. Известен HSA рецептор, полученный шведскими авторами (5) путем клонирования гена HSA рецептора в непатогенном хозяине. Однако описанный ими препарат HSA рецептора является гетерогенным. В данной работе для клонирования АВ области (области, ответственной за связывание альбумина) рестрицировали плазмиду pSPG2 (6) EcoRl с последующей обработкой фрагментом Кленова, добавлением синтетического Sall-линкера и лигированием. При рестрикции Sall и Pstl был получен фрагмент в 640 н.п. который изолирован из агарозы и вставляли между теми же сайтами в вектор pEМL8. Фрагмент гена, кодирующего G белок вырезали из полученной плазмиды, используя EcoRl и Hinh III сайты и вставляли в плазмиду pEG, конструкция которой описана в работе Eliasson (7). В результате была получена плазмида pB1B2, ответственная за альбуминсвязывающую активность. Из субклона, продуцирующего HSA белок, был выделен белок, очищен аффинной хромотографией, и исследован в SDS-PAGE электрофорезе. В итоге был получен белок с молекулярным весом 30,5 кД. Описанный авторами альбуминсвязывающий белок оказался гетерогенным с деградацией очищенного продукта.
Причиной гетерогенности полученного препарата очевидно явился довольно сложный путь его генетического конструирования, т.к. исходно брали 1,5 кв фрагмент гена G белка, который обеспечивал экспрессию только lgG связывающей активности за счет функции двух внутренних дополнительных промоторов. Альбуминсвязывающая активность в данном случае отсутствовала и чтобы ее получить авторам пришлось применить сложный путь конструкции, используя на первом этапе синтетический Sall-линкер.
Константы связывания рекомбинантного альбуминового рецептора с человеческим альбумином авторы не приводят, исследования способности HSA рецептора связываться с другими альбуминами также не представлены, что не позволяет составить полную иммунохимическую характеристику полученного ими рецептора.
Техническим результатом предложенного нами изобретения является получение гомогенного продукта альбуминсвязывающего белка, характеризующегося высокой константой связывания с HSA. Достижение технического результата обусловлено увеличением выхода целевого продукта. В нашем случае экспрессия альбуминсвязывающего белка значительно выше, так как продукция обеспечивается функцией мощного промотора из лактозного оперона E.coli. Полученный продукт гомогенен, т.к. транскрипция идет с промотора E.coli.
Сущностью изобретения является получение HSA рецептора путем клонирования гена G белка из стрептококка G148 в E.coli, выделение белка из клеток E. coli путем их вскрытия кипячением в 2% SDS и последующей очистки альбуминсвязывающего белка аффинной хpомотографией.
1. Клонирование HSA рецептора. Был сконструирован банк генов стрептококка G148 в фаговом EMBL 3а лямбда-векторе. Из 50000 рекомбинантных фаговых клонов был отобран клон, дающий наибольшую экспрессию альбуминсвязывающей активности. Для нахождения минимального фрагмента ДНК, содержащего ген G белка (в котором есть домены, ответственные за альбуминсвязующую активность), проводили субклонирование в E.coli JM109. 1,5 кв фрагмент был клонирован в pUC8.
Из клона, дающего наибольшую экспрессию была выделена рекомбинантная плазмида 3G. Полученный нами клон, обладал как lgG, так и альбуминсвязывающей активностью.
В подходе, использованном шведскими авторами (5), которые использовали плазмиду, полученную Гуссом (6), рамка считывания лактозного оперона, в котором осуществлялось клонирование гена G белка, была нарушена, поэтому экспрессия lgG связывающей активности обеспечивалась функцией двух внутренних промоторов, а альбуминсвязывающая активность отсутствовала.
Для получения только альбуминсвязывающего белка нам необходимо было проклонировать фрагмент гена, колирующего синтез конкретного рецепторного участка.
Для сохранения данной рамки считывания в нашем случае клонирование осуществлялось в векторе pUC8 в область сайта рестриктазы Pstl. 1,5 кв фрагмент гена G белка также рестрицировали Pstl. При этом сохранилась нормальная рамка считывания лактозного оперона и часть гена, кодирующая альбуминсвязывающий белок транскрибировалась без нарушения рамки считывания. При этом образовался рекомбинантный продукт, обладающий альбуминсвязывающей активностью с высоким уровнем экспрессии альбуминового рецептора. lgG связывающей активности обнаружено при этом не было. Отобранный в данном случае рекомбинантный клон содержал плазмиду ра1. Молекулярный вес полученной плазмиды оказался большим. При рестрикции этой плазмиды двумя рестриктазами EcoR I и Hind III был получен фрагмент 0,64 кв, который и кодировал часть белка ответственного за альбуминсвязывающую активность. Для уменьшения плазмиды pa1 было проведено субклонирование. Рекстрикцией плазмиды pa1 рестриктазами EcoR I и Hind III был получен фрагмент в 0,64 кв, который был изолирован из агарозного геля и клонирован в плазмиду pUC 8, которая была рестрицирована этими же рекстриктазами. В результате была получена плазмида pa7, с фрагментом гена кодирующим область белка, ответственного за альбуминсвязывающую активность.
Таким образом по существу получен активный штамм-продуцент, который может быть назван Ecoli JM109 a7.
2. Выделение HSA рецептора. Культура Ecoli JM109 a7 выращивалась ночь в LB среде с ампициллином (100 мкг/мл) при сильном шуттелировании, затем клетки осаждали центрифугированием при 5000 g, отмывали, суспендировали в PBS буфере с добавлением 0,003 М фенилметилсульфонил флюорида. Клетки вскрывали кипячением в 2% SDS. После центрифугирования при 20000 g в течение 1 ч, надосадок диализовали против PBS в течение ночи.
3. Аффинная хроматография. Диализат наносили на колонку, заполненную цианбромированной сефарозой 4В, связанной с HSA, предварительно уравновешенную PBS буфером рН 7,0 с 0,02% азидом натрия. Несвязавшийся белок удаляли промыванием колонки тем же буфером. HSA связывающий белок элюировали 0,1 М глициновым буфером, рН 2,0 в виде одного пика. Значение рН в элюате немедленно доводили до рН 7,0 0,5 М раствором трис HCL, рН 8,8. Альбуминсвязывающий белок диализовали и лиофилизировали. Выход целевого продукта HSA белка до 10 мг с одного литра культуры.
4. Иммунохимические характеристики препарата рекомбинантного HSA-рецептора. Препарат HSA рецептора был исследован на способность связываться с человеческим сывороточным альбумином.
Для этого использовали два варианта твердофазного иммуноферментного анализа прямой и двуслойный (сэндвич) методы. В первом из них испытуемый препарат был иммобилизован на твердой фазе и при этом оценивали количество связавшегося с ним меченного пероксидазой альбумина. Во втором методе на твердой фазе адсорбировали препарат немеченного альбумина, к нему из раствора присоединялись молекулы HSA рецептора, которые в свою очередь связывали из раствора меченный пероксидазой альбумин. Во всех экспериментах использовали не менее четырех параллельных рядов титрования. Результаты представлены на графиках 1 и 2.
На графике 1 (фиг. 4) приведен результат исследования способности препарата HSA рецептора, иммобилизованного на твердой фазе, связывать различные концентрации альбумина человека.
График 2 (фиг. 5) демонстрирует способность HSA рецептора, находящегося в свободном (не иммобилизованном) состоянии связывать альбумин человека. На этом графике приведен результат связывания HSA рецептора с lgG человека. HSA рецептор с lgG не реагировал.
Иммуноблотинг. Для проверки способности HSA рецептора связывать как альбумины человека, так и альбумины различных млекопитающих был использован метод иммуноблотинга. Препараты различных альбуминов в различных разведениях наносили по 2 мкл на нитроцеллюлозные фильтры, которые помещали на 30 мин в раствор bLotto (2 части 3% молока + 1 часть PBS). Затем фильтр помещали на 30 мин в раствор bLotto, содержащий HSA рецептор, меченный пероксидазой. Фильтр отмывали 3 раза по 5 мин раствором bLotto и 3 раза по 5 мин PBS. Отмытый фильтр подсушивали и помещали в раствор с параоксифениленом в концентрации 1 мг/мл с добавлением H2O2. Результаты опыта представлены на фиг. 1, который показывает, что HSA рецептор эффективно связывает альбумины человека, мыши, крысы и морской свинки; слабо связывает бычий и лошадиный альбумин, и не связывает кроличий и яичный альбумин. Методом иммуноблотинга также было определено взаимодействие препарата альбуминового рецептора с LgA, lgM и lgG человека. Полученные данные, (фиг. 2) свидетельствуют об отсутствии взаимодействия HSA рецептора с иммуноглобулинами человека классов А, М и G.
Определение константы связывания альбуминового рецептора с альбумином человека. Для определения равновесной константы связывания HSA рецептора с человеческим альбумином использовали метод Friguet (8), который заключается в следующем: антиген в различных концентрациях инкубируют в растворе с антителом при постоянной концентрации последнего до достижения равновесия. Концентрацию свободного антитела затем определяют с помощью непрямого иммуноферментного метода. В качестве связывающего агента (антитела) в данном случае использовали HSA рецептор, а в качестве лигандов (антигена) альбумин. Константа равновесия между HSA рецептором и человеческим альбумином составила 2,7х109M-1.
Так как для рекомбинантного HSA рецептора константа связывания ранее другими авторами не определялась, то полученные данные можно сравнить с константой связывания человеческого альбумина с 14 кД альбуминовым рецептором, выделенном из стрептококка мутанолизином, гораздо ниже вычисленной нами, хотя для двухрецепторного полноразмерного G белка она оказалась близкой к установленной нами константе связывания (3). Это еще раз показывает, что 14 кД пептид является лишь фрагментом HSA рецептора и не ответственен за полное связывание с альбумином.
Определение молекулярного веса HSA рецептора в SDS-PAGE. Препарат HSA рецептора анализировали в SDS-PAGE по методу Laemmli (9). Молекулярный вес полученного HSA рецептора составил Мв 31 кД (фиг. 3). В качестве стандартов молекулярного веса использовали: фосфорилазу В с Мв 94000; бычий сывороточный альбумин с Мв 67000; овальбулин с Мв 43000; бычью карбоник ангидразу с Мв 30000; трипсиновый ингибитор с Мв 20000 и яичный лизоцим с Мв 14000.
Стабильность препарата HSA рецептора. HSA рецептор хорошо растворим в воде и водных растворах, может быть легко лиофилизирован, несколько раз заморожен, обладает стабильностью при хранении в растворах при 10oС. Препарат HSA рецептора может быть легко помечен пероксидазой, щелочной фосфатазой и радиоактивным йодом, что позволяет использовать его в различных иммунологических тест системах.
Нуклеотидная последовательность и выведенная из нее аминокислотная последовательность, обозначение аминокислот и аминокислотный состав см. в конце текста описания.
Определение изоэлектрической точки (pI) HSA рецептора. Изоэлектрическая точка определена методом изоэлектрофокусирования. HSA рецептор фокусируется на Phast gellEF со следующими стандартами: оксидаза глюкозы pI 4,15, трипсиновый ингибитор pI 4,55, бета-лактоглобулин pI 5,2, бычья карбоник ангидраза В, pI 5,85, человеческая карбоник ангидраза, pI 6,55. Определенная pI альбуминового рецептора 5,8.
По сравнению с известными и ранее описанными белками, обладающими способностью реагировать с альбумином, предлагаемый нами HSA рецептор имеет целый ряд существенных преимуществ:
1. Большой выход HSA рецептора (до 10 мг с 1. культуры). Для описанных в литературе препаратов HSA рецептора выхода белка не приведено и ни в одном из каталогов зарубежных фирм данный препарат не представлен. Таким образом, этот препарат абсолютно оригинален, что позволяет обеспечить его высокую конкурентноспособность на мировом рынке.
2. Гомогенность полученного альбуминсвязывающего белка обеспечивает его высокую специфичность и позволяет применять в медицинской диагностике почечной и других формах паталогии, где заболевание характеризуется изменением уровня содержания альбумина в биологических жидкостях человека.
3. Высокая аффинность HSA рецептора позволяет связывать его с сорбентами, используемыми в аффинной хроматографии для очистки альбумина человека и альбумина некоторых млекопитающих или для получения чистых биологических препаратов, в которых присутствует альбумин, как балластный белок.
4. Полученный HSA рецептор по существу является абсолютно оригинальным, с высокой специфичностью, что должно позволить в диагностических системах для определения альбумина в биологических жидкостях заменить им антиальбуминовые сыворотки, которые получают трудоемким путем, с большими затратами и которые не имеют строгой иммунологической специфичности и могут давать перекрестные реакции.
В связи с изложенным полученный нами HSA рецептор имеет перспективу широкого применения в прикладной иммунологии, иммунохимии, в медицинской диагностике, а также в производственных целях.
ПОДПИСИ К РИСУНКАМ
График 1 (фиг. 4). Способность HSA рецептора, иммобилизованного на твердой фазе, связывать различные концентрации альбумина.
График 2 (фиг. 5). Связывание HSA рецептора с альбумином и с lgG.
Фиг. 1. Иммуноблотинг. Связывание HSA рецептора с альбумином (двукратные разведения с исходной концентрацией 1 мг/мл):
1) яичного альбумина
2) кролика
3) лошади
4) морской свинки
5) мыши
6) человека
Фиг. 2. Иммуноблотинг. Связывание HSA рецептора с альбумином и иммуноглобулинами человека классов А, М, G (двукратные разведения):
1) lgM
2) lgA
3) lgG
4) альбумин
Фиг. 3. SDS-PAGE альбуминсвязывающего белка, очищенного афинной хроматографией.
1) лизат HSA рецептора
2) HSA рецептор после аффинной хроматографии (концентрация 10 мкг)
3) маркер молекулярных весов
4) HSA рецептор после аффинной хроматографии (концентрация 25 мкг).
Источники
1. Akerstrom B. Brodin T. Reis K. and Bjorck L. 1985, JN. Immunol. 135, 2589-2592.
2. Bjorck L. Kastern W. Lindahl G. Wideback K. 1987, Mol. Immunol. 24, 1113-1122.
3. Sjobring U. Falkenberg C. Nielson E. Akerstrom B. Bjork L. 1988, Immunol. 140, 1595-1599.
4. Wiedeback K. Lund 1987, 92.
5. Nygren P.-A. Eliasson M. Abrahmsen L. Uhlen M. 1988, J. Molec. Recognition 1, 69-74.
6. Guss B. Eliasson M. Olsson A. Uhlen M. Frej A-K. Jornvall H. Flock J. Lindberg M. 1986, EMBO J, 5, 1567-1575.
7. Eliasson M. Olsson A. Palmcronitz E. Wiberg K. Inganas M. Guss B. Lindberg M. Uhlen M. 1988, J. Biol.Chem. 263, 4323-4327.
8. Friquent B. Chaffotte A.B. 1985, J. Immunol. Meth. 75, 305-319.
9. Laemmli U.K. 1970, Nature 227, 680-685.
10. Sanger F. Coulson A.R. Barell B.G. Smith A.J. Roc B.A. 1980, J. Mol. Biol. 143, 161-178. ЫЫЫ2 ЫЫЫ4 ЫЫЫ6
Рекомбинантный альбуминовый рецептор из человеческого группы G стpептококка обладает способностью связывать человеческий сывороточный альбумин. Благодаря своей способности связывать человеческий альбумин HSA, рецептор может быть использован в иммунологических исследованиях.
Сущностью изобретения является получение HSA рецептора путем клонирования гена G белка из стрептококка 6148 в E.Coli, выделение белка из клеток E. Coli путем их вскрытия в 2% SDS и последующей очистки альбумин-связывающего белка аффинной хроматографией. HSA рецептор получен с высоким выходом, гомогенность полученного белка обеспечивает его высокую специфичность и позволяет применять в медицинской диагностике.
Полученный белок характеризуется высокой константой связывания с альбумином человека, его высокая аффинность позволяет связывать его с сорбентами, которые могут быть использованы для очистки альбумина.
Основываясь на свойствах полученного HSA рецептора, его можно широко использовать в прикладной иммунологии, иммунохимии и в медицинской диагностике. 4 ил.
