СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФИННОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ПРОТЕИНАЗ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/50 B01J20/24 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки протеиназ, и может быть использовано в пищевой промышленности, биохимии, медицине, в производстве моющих средств, в фермантативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей.

Известен способ получения бацитрацин-сафарозы сорбента для афинной хроматографии протеиназ. По этому способу в качестве носителя используют производные агарозы, которые неустойчивы в кислой среде и могут разрушаться целлюлозами в процессе хроматографии. Кроме того, в качестве конденсирующего реагента при синтезе используют высокотоксичный бромциан [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающий взаимодействие аминопроизводного кремнеземсодержащего материала, используемого в качестве инертного носителя с антибиотиком-полипептидом и конденсирующим агентом при рН 1,8-9,5. Недостатками данного способа являются низкий выход сорбента, использование в качестве конденсирующего агента концерогенного вещества п-бензохинона. Также к недостатку способа следует отнести применение инертных силикатных материалов, которые для взаимодействия с антибиотиками-полипептидами должны быть аминированы аминопропилтриэтоксисисиланом, являющимся труднодоступным, дорогостоящим реагентом.

Целью изобретения является упрощение процесса, увеличение выхода сорбента, неиспользование концерогенных веществ. Это достигается способом получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающим взаимодействие аминсодержащего нерастворимого носителя, в качестве которого используют природные биополимеры, например, хитин или хитозан, с антибиотиками-полипептидами и с конденсирующим агентом, в качестве которого используют водный раствор (10-25% ) глутарового альдегида, причем на 1 г природного биополимера берут 0,15-0,5 г антибиотика и 0,15-0,5 г глутарового альдегида и процесс проводят при 15-37^o С.

Предложенный способ отличается от известного использованием в качестве нерастворимого аминсодержащего носителя природного биополимера (в качестве конденсирующего агента глутарового альдегида при соотношении на 1 г носителя берут 0,15-0,5 г антибиотика и 0,15-0,5 г глутарового альдегида) и проведении процесса при 15-37^o С.

П р и м е р 1. Синтез бацитрацин-хитозана. К 1 г хитозана прибавляют 25 мл 25% -ного глутарового альдегида (10 мкМ) в 0,1 М фосфатном буфере при рН 6,9. После перемешивания в течение 4 ч при комнатной температуре помещают в термостат на 37^o С и оставляют на ночь. Затем сорбент отфильтровывают, промывают тем же буфером и помещают в раствор 0,5 г (9 мкМ) бацитрацина в том же буфере, перемешивают 30 мин и оставляют на ночь в термостате при 37 ^oС. Готовый сорбент отфильтровывают, промывают буфером и водой. Содержание бацитрацина в образце 8,5 мкМ/г, выход 94% Для определения включения антибиотика в сорбент навеску в 20 мг гидролизуют 5,7 н НС 48 ч при 105 ^oС и измеряют количественно содержание аминокислот (Asp, Glu, Val, Lys) на аминокислотном анализаторе. Выход реакции рассчитывают по отношению количества присоединяющегося антибиотика к количеству антибиотика, вводимого в реакцию (мкМ), принимая за 100% исходное содержание антибиотика в реакционной смеси на 1 г хитина или хитозана.

Из данных таблицы видно, что по известному способу наибольший выход достигается при избытке бацитрацина 340 мкМ. В предложенном способе в целях экономии предлагается уменьшить количество дефицитных антибиотиков до 9 мкМ, т.е. в 38 раз. При этом выход повышается до 94%
Таким образом, способ обладает существенными преимуществами по сравнению с известным. Вместо инертных силикатных материалов в известном способе, требующем для активации применения дорогостоящего аминопропилтриэтоксисилана, предлагаются природные биополимеры отходы крабьего промысла хитин или хитозан, уже имеющие на поверхности аминогруппы и не требующие активации.

Россия располагает большими сырьевыми ресурсами ракообразных для производства хитина и хитозана. Учитывая экологические аспекты утилизации отходов, эти биополимеры являются достаточно дешевыми носителями для афинных сорбентов, не уступающие в этом отношении макропористым силикатным материалом. Хитин и хитозан обладают высокой химической и биологической стойкостью, достаточной проницаемостью. Эти материалы характеризуются значительной степенью гидрофильности и могут использоваться в гранульной форме.

Вместо канцерогенного п-бензохинона предлагается в качестве конденсирующего агента использовать безвредный глутаровый альдегид.

Синтез проводят при более низких температурах (15 37^oС), что снижает затраты энергии и уменьшает возможность побочных реакций.

Предлагаемый способ дает возможность лучше контролировать процесс, т.к. исходное количество аминогрупп на хитине или хитозане можно заранее определить и подобрать соответствующее количество антибиотика. Расход антибиотика сокращается в предлагаемом способе в 3,7-23 раза, а выход афинного сорбента увеличивается в 4-23 раза по сравнению с известным способом. Синтезированные по предлагаемому способу сорбенты по качеству сравнимы с применяемыми ранее. ТТТ1

Использование: изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки протеиназ и может быть использовано в пищевой промышленности, биохимии, медицине, в производстве моющих средств, в ферментативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей. Сущность изобретения заключается в том, что для получения афинного сорбента для очистки протеиназ осуществляют синтез аминосодержащего нерастворимого носителя, в качестве которого используют природные биополимеры, например, хитин или хитозан, с антибиотиками-полипептидами и конденсирующим агентом, в качестве которого используют 10-25%-ный водный раствор глутарового альдегида, причем на 1 г природного биополимера берут 0,15-0,5 г антибиотика и 0,15-0,5 г глутарового альдегида и процесс проводят при 15-37 ^oС. 1 з.п.ф-лы. 1 табл.

1. Способ получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающий взаимодействие аминосодержащего нерастворимого носителя с антибиотиками-полипептидами и конденсирующим агентом, отличающийся тем, что в качестве аминосодержащего нерастворимого носителя используют природные биополимеры, например, хитин или хитозан, а в качестве конденсирующего агента глутаровый альдегид, причем на 1 г природного биополимера берут 0,15 0,5 антибиотика и 0,15 0,5 г глутарового альдегида. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс проводят при 15 - 37^oС.