Способ одновременной очистки протеолитического фермента и его обратимого ингибитора Советский патент 1982 года по МПК C12N9/50 G01N33/50 

на - 3-5 единиц отличающемся от значения рН-оптимума фермента. В качестве фермента используют, например, катепсин D из мозга быка или трипсин. Соответственно в качестве обратимого ингибитора обычно используют ингибитор катепсина D из картофеля и ингибитор трипсина из люцерны, в качестве биоспецифического сорбента - соответственно сорбент на основе полиакриламидного геля, содержащий в качестве лиганда гемоглобин, либо сорбент на основе агарозного геля, содержащий в качестве лиганда ингибитор трипсина из люцерны. При этом обычно сорбцию и элюцию катепсина D проводят при рН 4,0, а трипсина - при рН 5,0, разделение фе мент-ингибиторного комплекса осуществляют в первом случае при рН 8,6 во втором - при рН 2,0. Предлагаемый способ разработан дл очистки протеолитического фермента и его ингибитора, обладающего .рбратимлм характером связывания с фермен том и молекулярнымвёсом в 1,5-10 ра меньшим молекулярного веса фермента. Именно эти два фактора лежат в основе технологии предлагаемого способ а. ; Сущность способа заключается в том, что для .получения очищенных пре паратов протеолитического фермента и его ингибитора за обычным этапом биоспецифической сорбции протеолитического фермента на сорбенте применяют этап биоспецифической (аффинной) элюции фермента частично очищенным препаратом обратимого ингибитора, предварительно освобожденного гель-хроматографией от высокомолеку лярных примесей, т.е. обладающих молекулярным весом, превышающим молекулярный вес ингибитора). Полученный фермент-ингибиторный комплекс отделяется от сопутствующих низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией и легко разделяется на очищенный np парат протеолитического фермента и очищенный препарат ингибитора. Способ позволяет получать очищенные препараты пртеолитического фермента и его ингибитора с высокой степенью очистки (степень очистки ф мента (продажный препарат) 80, ингибитора - 30-60). Приме р 1. Одновременная очи ка катепсина D из мозга быка и нгиби ора катепсина D из картофеля. Катепсин D из животных тканей . имеет молекулярную массу 43000 дапь тон, а поливалентный ингибитср катепсина D и трипсина из картофеля 27000, т.е. в 1,6 раза меньше. В качестве аффинного сорбента используют гемоглобин, иммобилизова ный на биогеле Р-ЗОО. Сорбент синте зируют по известной методике, активиру я биогель глутаровым альдеги-, дом 4 . Препарат катепсин D из мозга быка перед аффинной хрог атографией готовят по методу 5. Осуществляют сорбцию катепсина ,D из экстрактов мозга при на выщеуказанном сорбенте в присутствии 0,1 М ацетатного буфера и 1 М NaCl (рН 4,0-.это значение рН близко к оптимальному) . .Балластные белки удаляют промыванием сорбента тем же буфером. Ингибитор получают известным способом - экстракцией из клубней картофеля и фракционированием сульфатом аммония 6. Раствор неочищенного ингибитора, полученный как указано выше, пропускают через колонку с сефадексом G-IOO, уравновешенную О,1 М ацетатным буфером с 1 М NaC). (рН 4,0) . удаления белковых примесей.с большим молекулярным весом, чем ингибитор. Элюцию катепсина р осуществляют раствором ингибитора катепсина D из картофеля при тех же случаях, что и сорбцию. Условия элюции фермент-ингибиторрого комплекса таковы (рН 4,0), что полученный комплекс катепсина D и его ингибитора из картофеля находится в ассоциированном состоянии и молекулярный вес его равен сумме молекулярных весов фермента и ингибитора. Раствор, содержащий комплекс, отделяют от низкомолекулярных белковых примесей, пропуская его через колонку с сефадексом 6-100 уравновешенную .0,1 М ацетатным буфером с 1М NaCl (рН 4,0).Для того,чтобы разделить очищенные фермент и ингибитор проводят повторную гель-хроматографию комплекса на колонке с сефадексом G-100, но в условиях, способствующих его диссоциации (колонку уравновешивают 0,1 М бикарбонатным .буфером с 1 М NaC1 при рН 8,6) . Степень очистки катепсина D - 80, его ингибитора - 60 по сравнению с исходными препаратами. П р и М е р 2. Одновременная очистка продажного препарата свиного трипсина СРеахим, Олайнэ) и его низ- комолекулярного инигибитора из люцерны. Свиной трипсин имеет молекулярный вес 24000. а ингибитор трипсина из люцерны 7иОО. Отношение их молекулярных весов равно 3,4. В качестве аффинного сорбента используют очищенный ингибитор трипсина из люцерны, иммобилизованный на BrCN-активированной сефарозе 4 В. Исходный препарат трипсина является продажным СРеахим, Олайнэ). Препарат ингибитора трипсина из люцерны для элюции фермента получа