МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ТЕРМИНАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЭТИЛЬНЫХ ГРУПП В КАРБОКСИЛЬНЫЕ ГРУППЫ Российский патент 1996 года по МПК C12P17/00 C12P17/06 C12P17/10 C12P17/12 C12P7/40 

Изобретение относится к новому микробиологическому способу терминального окисления алкильных групп в карбоксильные группы.

Полученные производные карбоновой кислоты могут быть использованы, например, в качестве промежуточных продуктов для фармацевтики, например, тиофен-2-уксусная кислота для синтеза антибиотиков пенициллина или цефалоспорина (Ullmann, 1983, Band 23, S.219).

Тщательные исследования по микробиологическому окислению алкильных групп в алифатических углеродородах были, в частности, проведены со штаммами микроорганизмов Pseudomonas oleovorans.

Относительно Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 и ATCC 29437 известно, что биохимическое окисление алканов в соответствующую кислоту протекает в три ступени. В результате действия комплекса алкан-гидроксилазы образуется сначала соответствующий спирт, который затем в две последующие ступени действием дегидрогеназы-спирта и дегидрогеназы-альдегида превращают в кислоту.

В вышеуказанном штамме имеются гены, ответственные за энзимы этого окисления на плазмиде OCT (Witholt et.al. TIBTECH, Vol.8, 1990, S.46-52).

С помощью указанного штамма было описано окисление только соединений с линейными насыщенными C₆-C₁₂ алкильными остатками и с этилбензолом.

Окисление замещенных алкилом циклических, ароматических или ненасыщенных углеводородов в соответствующую карбоновую кислоту перерабатывающими алкан микроорганизмами типа Rhodococcus, Mycobakterium и Pseudomonas описано в Raymond, R.L. Process Biochemistry, 1979, S.71-74.

Недостатком этого способа является прежде всего то, что реакция неспецифична для алкильных групп, содержащих более двух атомов углерода. В этом случае может происходить расщепление циклов, а метильные группы могут окисляться в ароматические углеводородные соединения.

Задача данного изобретения состоит в разработке простого и одноступенчатого способа микробиологического окисления алкильных групп в гетероциклах, с помощью которого соответствующие кислоты могут быть выделены с большим выходом и высокой чистотой продукта, причем ароматический или насыщенный гетероцикл не будет расщеплен.

Эта задача была неожиданно решена в соответствии с микробиологическим способом терминального окисления этильных групп в карбоксильные группы, включающим взаимодействие субстрата с микроорганизмами, в котором в качестве субстрата используют 5- или 6-членный гетероцикл, замещенный по меньшей мере одной алкильной группой с по меньшей мере двумя атомами углерода, а из микроорганизмов используют такие, которые превращают алкан и/или алканол в соответствующую карбоновую кислоту. При этом введение субстрата осуществляют разово или непрерывно до концентрации его в культуральной среде не выше 20% (вес/объем) при значении рН 4-11 и температуре 15-50^oC, причем полученная карбоновая кислота не подвергается дальнейшему катаболизму.

Возможно дополнительно индуцировать энзимы микроорганизма соединениями, которые служат микроорганизму источником углерода или энергии, или соединениями, которые не служат микроорганизму источником углерода и энергии.

Из организмов обычно используют бактерии штаммов Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 или Pseudomonas oleovorans ATCC 29347.

Возможно также из микроорганизмов использовать дрожжи штамма Candida tropicalis ATCC 32113 или бактерии штамма Rhodococcus rhodochrous ATCC 19607.

В качестве субстрата применяют ароматический 5- или 6-членный гетероцикл, замещенный по меньшей мере одной C₂-C₆ алкильной группой, который содержит несколько гетероатомов из ряда кислород, азот или сера, преимущественно ароматический 5- или 6-членный гетерцоикл, замещенный этильной группой, которая содержит один или несколько гетероатомов из ряда кислород, азот или сера.

Из группы 6-членных гетероциклов предпочтительными являются гетероциклы с атомами азота.

Приемлемыми представителями 5-членных гетероциклов являются тофены, фураны, пирролы, тиазолы, пиразолы или имидазолы. Особенно предпочтительны из 5-членных гетероциклов 2-этилтиофен или 2-этилфуран.

Приемлемыми представителя 6-членных гетерцоиклов являются пиридины, пиримидины, пиразины или пиридазины. В качестве 6-членного гетероцикла особенно желательны 3-этилпиридин, 2-этилпиразин или 5-этил-2-метилпиридин.

Целесообразным является индуцирование энзимов микроорганизмов, перерабатывающих алкан и/или алканол. Понятие "алканы" или "алканолы" охватывает также замещенные алканы или алканолы (алкилированные циклические соединения), например, этилбензол.

Индуцирование энзима может быть осуществлено как с соединениями, служащими микроорганизму в качестве источника углерода и энергии (алканы, алканолы, алкилированные циклические соединения, например, октан, октанол, додекан, додеканол, гексан, гексанол, этилбензол), так и с соединениями, не служащими микроорганизму источником углерода или энергии (дициклопропилкетон, -кетон, дициклопропилметанол или диэтоксиэтан), описанные Grund et.al, J.Bacteriol. 123, S.546-556, (1975).

Предпочтительно индуцирование энзима производится для Pseudomonas oleovorans н-октаном, для Candida tropicalis н-гексадеканом и для Rhodococcus rhodochrous н-деканом.

Обычно введение применяемых для индуцирования соединений во время превращения субстрата прекращается. Однако превращение субстрата может производиться также в присутствии индуктора энзима.

Как правило, подачу применяемых для индуцирования соединений во время превращения субстрата прекращают либо приостановкой подачи, либо отцентрифугированием клеток.

Превращение может быть осуществлено с помощью микроорганизмов, перерабатывающих алкан и/или алканол, например, микроорганизмами вида Pseudomonas, дрожжами вида Candida или микроорганизмами вида Pseudomonas.

Для осуществления предложенного способа пригодны также мутанты этих микроорганизмов, а также другие микроорганизмы, в которые либо посредством конъюгации, либо с помощью методов генной инженерии вводят необходимую для превращения генетическую информацию, образуя эффективные энзимы для превращения.

В качестве микроорганизмов могут быть использованы перерабатывающие алкан штаммы микроорганизмов Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 или ATCC 29347, дрожжи вида Candida tropicalis ATCC 32113 и Rhodococcus rhodochrous ATCC 19607, предпочтительно Pseudomonas oleovorans ATCC 29347.

Штаммы микроорганизмов Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 или ATCC 29347 и Rhodococcus rhodochrous ATCC 19067, а также дрожжи вида Candida tropicalis ATCC 32113 находятся на хранении в США (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852).

Вышеназванные штаммы растут с алканами, алканолами или алкилированными циклическими соединениями в среде минеральных солей (Kulla et. al. Arch. Microbiol 135, 1983, S.1-7) или в комплексной среде ("Nutrient Broth Nr.2", Oxoid Ltd. England).

Перед введением субстрата клетки выращивают обычным способом, после чего осуществляют превращение субстрата при оптической плотности 1-200 при 650 нм в питательной среде, предпочтительно при оптической плотности 5-100 при 650 нм.

Превращение можно проводить либо при разовом, либо при непрерывном введении субстрата так, чтобы концентрация субстрата в питательной среде не превышала 20% (вес/объем).

Введение субстрата рекомендуется проводить так, чтобы концентрация субстрата в питательной среде не превышала 5% (вес/объем), при этом предпочтительная концентрация субстрата в питательной среде не должна превышать 1% (вес/объем).

Превращение производят при значении рН 4 11, предпочтительно при рН 6 10.

Превращение обычно проводят при температуре 15-50^oС, предпочтительно при температуре 25-40^oС.

Превращение целесообразно проводить в течение отрезка времени продолжительностью от 1 часа до нескольких дней, предпочтительно превращение проводят по непрерывному способу в течение нескольких дней.

После превращения соответствующие кислоты могут быть выделены известным способом.

Пример 1. Получение 2-метилпиридин-5-уксусной кислоты. Pseudomonas oliovorans ATCC 29347 был инкубирован в среду минеральных солей (Kulla et. al. Arch. Microbiol. 135, 1983, S.1-7) с н-октаном в качестве единственного углеводорода и источника энергии при 30^oС и значении рН 7.

После этого клетки два раза промывали той же средой минеральных солей и установили оптическую плотность 10 при 650 нм в 100 мл среды минеральных солей. К этой клеточной суспензии был добавлен 1 ммоль 5-этил-2-метилпиридина, что соответствует концентрации субстрата, равной 0,12% (вес/объем).

По истечении 16-часового инкубационного периода при 30^oС в отсутствии н-октана было получено 0,5 ммоля 2-метилпиридина-5-уксусной кислоты с выходом, равным 50% в расчете на исходный 5-этил-2-метилпиридин. В этих условиях не происходило окисления метильной группы.

Примеры 2-5 были осуществлены в соответствии с примером 1 с количеством субстрата, равным 1 ммолю на 100 мл клеточной суспензии, и объединены в таблице 1.

Примеры 2 и 6.

Превращение с помощью микроорганизмов Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 при различных концентрациях субстрата (табл.2).

Примеры 7-11.

Превращение с помощью микроорганизмов Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 (табл.3).

Использование: микробиологический способ терминального окисления алкильных групп в карбоновую кислоту. Сущность изобретения: описан микробиологический способ терминального окисления алкильных групп в карбоновую кислоту в 5- или 6-членных гетероциклах, циклически замещенных по меньшей мере одной алкильной группой, содержащей более двух атомов углерода; превращение осуществляют с помощью микроорганизмов, перерабатывающих алкан и/или алканол. 6 з. п. ф-лы, 3 табл.

1. Микробиологический способ терминального окисления этильных групп в карбоксильные группы, включающий взаимодействие субстрата с микроорганизмами, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют 5- или 6-членный гетероцикл, замещенный по меньшей мере одной алкильной группой с по меньшей мере двумя атомами углерода, а из микроорганизмов используют такие, которые превращают алкан и/или алканол в соответствующую карбоновую кислоту, введение субстрата осуществляют разово или непрерывно до концентрации его в культуральной среде не выше 20% (масса/объем) при значении рН 4 11 и температуре 15 50^oС, причем полученная карбоновая кислота не подвергается дальнейшему катаболизму. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно индуцируют энзимы микроорганизма с соединениями, которые служат микроорганизму источником углерода или энергии, или с соединениями, которые не служат микроорганизму источником углерода или энергии. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что из организмов используют бактерии штаммов Pseudomonas oleororans АТСС 8062 или Pseudomonas oleororans АТСС 29347. 4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют дрожжи штамма Candida tropicalis АТСС 32113. 5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют бактерии штамма Rhodococcus rhodochrous АТСС 14067. 6. Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что в качестве субстрата применяют ароматический 5- и 6-членный гетероцикл, замещенный по меньшей мере одной С₂-С₆ алкильной группой, которая содержит несколько гетероатомов из ряда кислород, азот или сера. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве субстрата применяют ароматический 5- или 6-членный гетероцикл, замещенный этиловой группой, которая содержит один или несколько гетероатомов из ряда кислород, азот или сера.