СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИХ ГИДРОКСИЛЬНУЮ ГРУППУ, ИЛИ ИХ РАСТВОРИМЫХ СОЛЕЙ, ШТАММ БАКТЕРИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ БИОТРАНСФОРМАЦИИ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ГИДРОКСИЛЬНУЮ ГРУППУ. Российский патент 1998 года по МПК C12P17/12 C12P7/02 C12P7/40 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение касается микробиологического способа получения гетероциклических карбоновых кислот с гидроксильной группой и азотом в гетероцикле или их растворимых солей общей формулы I

на основе соответствующих гетероциклических карбоновых кислот с азотом в гетероцикле, а также используемых для этой цели микроорганизмов.

В последующем под азотсодержащими гетероциклическими карбоновыми кислотами следует понимать гидроксилированные или негидроксилированные кислоты, а также их растворимые соли, такие как, например, соли щелочных металлов или аммониевые соли.

2-Гидрокси-азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты представляют собой важнейшие промежуточные продукты в процессах синтеза активных веществ. Например, 2-гидроксиникотиовая кислота служит исходным материалом для получения 2-хлорникотиновой кислоты (заявка на патент США 4081451), являющейся, в частности, важным промежуточным продуктом для получения фармацевтических соединений (Ann. Pharm. Fr., 1980, 38(3), 243 - 252).

Известен способ получения 5-бром- и 5-хлор-2-гидроксиникотиновых кислот и ряда их производных путем галогенирования соответствующих 2-гидроксиникотиновых кислот гипогалогенокислотой в концентрированной галогенводородной кислоте или гипогалитом щелочного металла в водном или водно-щелочном растворе (EP, 0225172, кл. C 07 D 213/803, 1987).

Способ является технологически сложным и небезопасным, так как реакция сопровождается выделением газообразного хлора и требует мер предосторожности. Кроме того, не все соединения, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены вышеуказанным способом.

До настоящего момента не было известно микробиологического способа получения азотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот, содержащих в гетероцикле, помимо азота, гидроксильную группу.

Задачей настоящего изобретения была разработка простого и экологически чистого способа получения химически труднодоступных азотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот с гидроксильной группой в гетероцикле на микробиологической основе.

Эта задача решается с помощью нижеописываемого способа при использовании нового типа микроорганизмов, позволяющих осуществить этот способ.

В соответствии с изобретением способ основан на преобразовании азотсодержащей гетероциклической карбоновой кислоты общей формулы II

где R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или различными по значению и могут представлять собой атом водорода, атом галогена или C₁-C₄ алкилгруппу, а
X - атом азота или CR₃-группа, где R₃ - атом водорода или атом галогена,
или ее растворимых солей с помощью микроорганизмов, содержащих специфическую гидролазу и использующих 6-метилникотиновую кислоту, в азотсодержащую гетероциклическую карбоновую кислоту, содержащую гидроксильную группу, общей формулы I

где R₁, R₂ и X имеют вышеуказанное значение,
или ее растворимые соли.

Под термином "использующие 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмы, содержащие специфическую гидролазу," следует понимать следующее.

Если, например, из шлама отстойника в качестве инокулярной среды при использовании 6-метилникотиновой кислоты вырастить биомассу, то в результате можно получить использующие 6-метиликотиновую кислоту микроорганизмы, то есть микроорганизмы, способные расти и развиваться на 6-метилникотиновой кислоте как единственном источнике углерода, азота и источнике энергии. При селекционировании микроорганизмов с использованием известных специалистам методов (речь идет о микроорганизмах, полностью разлагающих 6-метилникотиновую кислоту через 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту в качестве промежуточного продукта) получаются микроорганизмы, содержащие специфическую гидролазу, то есть микроорганизмы, специфически гидроксилирующие единственный углеродный атом, расположенный между кислотной группой и атомом азота.

В принципе для данного метода могут быть использованы все виды микроорганизмов, селекционированные по данному принципу, например из шлама отстойников или проб почвы.

Более целесообразным представляется использование нового штамма бактерий, известных под названием Ki101 (Германская коллекция микроорганизмов). Данный штамм зарегистрирован в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ, Машеродервег 1б, Д-3300 Брауншвейг от 10.02.1992 года.

Ниже приводятся результаты исследований культуры Ki101 (Германская коллекция микроорганизмов (DSM) 6920):
Форма клеток - Ничтожно мелкие палочки
Ширина, мкм - 0,4 - 0,5
Длина, мкм - 1,0 - 1,5
Подвижность - -
Жгутики - -
Грам-реакция - -
Лизис под действием 3% KOH - +
Аминопептидаза (Черни) - +
Споры - -
Оксидаза - +
Каталаза - +
Через анализ последовательности 16r-рибонуклеиновой кислоты род определить не удалось.

Селекция и культивирование такого типа микроорганизмов при использовании 6-метилникотиновой кислоты производились известными специалистам способами.

В процессе селекции целесообразно проводить "скрининг" микроорганизмов в аэробных условиях.

Во время "скрининга" микроорганизмы необходимо культивировать в состоянии покоя (не встряхивать!).

Целесообразно, если количество 6-метилникотиновой кислоты в стадии селекции и выращивания будет составлять до 1 мас.%, предпочтительно до 0,5 мас.%.

Селекцию и выращивание рекомендуется проводить при pH в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8.

Температуру на стадии селекции и культивирования следует поддерживать на уровне 15 - 50^oC, предпочтительно от 25 до 40^oC.

Обычно селекцию и культивирование проводят в среде минеральных солей, предпочтительно в среде минеральных солей, имеющей состав, приведенный в табл. 1.

Если желаемая оптическая плотность при 650 нм (ОП₆₅₀) составляет от 0,5 до 100, то микроорганизмы либо отбирают с применением известных специалистам методов, либо субстрат, азотсодержащую гетероциклическую кислоту, непосредственно добавляют в среду микроорганизмов для проведения указанной реакции (биотрансформации).

Собственно биотрансформация протекает в дальнейшем при использовании нерастущих клеток.

В качестве субстратов с общей формулой II могут быть использованы, например, никотиновая кислота, пиразинкарбоновая кислота или их галоидированные или C₁-C₄ алкилированные производные.

В качестве производных никотиновой или пиразинкарбоновой кислот предпочтительно использование гидроксилированных 6-хлорникотиновой кислоты, 5,6-дихлорникотиновой кислоты и 5-хлорпиразинкарбоновой кислоты.

В качестве производных C₁-C₄-пиразинкарбоновой кислоты лучше всего гидроксилируется 5-метилпиразинкарбоновая кислота.

Субстрат для биотрансформации можно вводить непрерывно или за один раз. Наиболее целесообразным представляется такое добавление субстрата, чтобы концентрация его в культурной среде не превышала 10 мас.%, предпочтительно 7 мас.%.

В качестве среды для биотрансформации можно применять обычные хорошо известные специалисту среды. Процесс биотрансформации предпочтительно проводить в низкомолекулярном фосфатном буфере.

Обычно биотрансформацию проводят при использовании суспензии микроорганизмов, имеющих оптическую плотность при 650 нм (ОП₆₅₀) в пределах от 0,5 до 100, предпочтительнее от 5 до 50.

Биотрансформацию рекомендуется проводить при температуре от 15 до 50^oC, предпочтительнее от 25 до 35^oC, и pH от 5 до 9, предпочтительнее от 6,5 до 7,5.

Обычная продолжительность процесса от 5 часов до 3 дней, после чего гидроксилированный продукт, соответствующий формуле I, выделяют при использовании известных способов, например, путем подкисления не содержащего клеточной культуры верхнего слоя.

Описываемым способом были получены гидрокси-азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты общей формулы I

где X - атом азота,
R₁ и R₂ могут иметь одинаковое или различное значение и могут представлять собой атом водорода, атом галогена или C₁-C₄ алкильную группу, исключая вариант, когда R₁ и R₂ вместе являются водородом, а также в случае, если X - CH-группа, R₁ и R₂ - атом галогена.

Наиболее предпочтительными представителями этой новой группы соединений можно считать 5,6-дихлор-2-гидроксиникотиновую кислоту, 3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновую кислоту и 3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновую кислоту.

Пример 1. Выделение микроорганизмов, использующих 6-метилникотиновую кислоту.

В 300-мл колбу Эрленмейера загружают 100 мл среды, содержащей минеральные соли, содержащую 1 ммоль 6-метилникотиновой кислоты (табл. 1), и добавляют 10 мл шлама из отстойника с очистительных сооружений фирмы Лонца АГ в местечке Весп, Швейцария или же пробы грунта с предприятий Лонца в Веспе, после чего выдерживают, не оказывая никакого воздействия, при 30^oC. Через 10 дней в нескольких загрузках с помощью спектрофотометрического метода определяют 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту. Затем эти культуры повторно переносят несколько раз в свежую среду, содержащую минеральные соли. После этого в ту же среду вводят путем смазывания образующую 2-гидрокси-6-метионикотиновую кислоту клеточную структуру, содержащую 1,6% (мас./об.) агар-агара. Затем пластинки агара инкубируют при 30^oC в атмосфере, содержащей 4% O₂ и 96% N₂. Отдельные колонии трансферируют в жидкую среду и выдерживают в состоянии покоя. Штамм бактерии, известный под названием Ki101 (Германская коллекция микроорганизмов 6920), в процессе роста на культуре 6-метилникотиновой кислоты обеспечивал синтез 2-гидрокси-6-метилникотиновой кислоты.

Пример 2. Микробиологическое окисление никотиновой кислоты в 2-гидроксиникотиновую кислоту.

Штамм бактерий Ki101 (ГКМ 6920) выращивают в среде минеральных солей (800 мл) (таблица 1) при добавлении 8 ммолей 6-метилникотиновой кислоты в 1-литровой колбе Фернбаха при 30^oC при использовании качалки при 100 об/мин. Инокулят составляет 5% (об./об.). Через 5 дней оптическая плотность достигает около 0,5. Затем клеточную культуру снимают и промывают один раз фосфатным буфером (50-молярным) при pH 7,0. Повторно суспендируют клетки в 20 мл 50 ммоль фосфатного буфера, содержащего 200 мг (1,38 ммолей) натриевой соли никотиновой кислоты. Оптическая плотность (ОП₆₅₀) составляет 20. Через 6 часов инкубации на шейкере при 30^oC методом тонкослойной хроматографии следов никотиновой кислоты обнаружить не удается. После этого биомассу отделяют на центрифуге, верхний слой подкисляют, доводя pH до 2,5, с целью осаждения 2-гидроксиникотиновой кислоты.

С помощью метода ¹H-ЯМР (DMSO) никаких примесей в выделенном продукте определить не удалось. В общей сложности удается получить 140 мг (1 ммоль) 2-гидроксиникотиновой кислоты, что соответствует выходу 72% на введенную никотиновую кислоту.

После стерилизации добавляли, мл:
Раствор 2 - 0,5
Раствор 3 - 1,0
Раствор 4 - 1,0
Раствор 5 - 0,5
Примеры 3 - 7 проведены аналогично примеру 2. Результаты приведены в табл. 2.

Данные анализа к примеру 6:
(3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота)
¹H-ЯМР (DMSO, 400 МГц) δ (ч. на мил.):
2,4, s; 2,6 s; 3,8, s; 7,8, s.

¹³C-ЯМР (DMSO, 100,5 МГц) δ (ч. на мил.):
20, t; 40, m; 130, s; 134, s; 155, s; 164, s; 170, s.

Данные анализа к примеру 7:
(3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота)
¹H-ЯМР (D₂O и диоксан, 400 МГц) δ (ч. на мил.):
3,8, s; 4,7 s; 8,0, s.

¹³C-ЯМР (D₂O и диоксан, 100,5 МГц) δ (ч. на мил.):
132, s; 133, s; 145, s; 149, s, 164, s; 172 s.

Изобретение касается нового микробиологического метода получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот и их растворимых солей с общей формулой I, приведенной в описании, на основе соответствующих азотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот и нового штамма микроорганизмов, используемого в данном процессе. Способ обеспечивает экологически чистое и нетрудоемкое производство указанных соединений. Новый штамм микроорганизмов Кi 101 (DSM 6920) предназначен для биотрансформации соответствующих указанных кислот в азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты, содержащие гидроксильную группу. Выход до 72%. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения азотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот, содержащих гидроксильную группу, общей формулы I

где R₁, R₂ и X имеют одинаковые или различные значения, причем R₁ и R₂ представляют собой атом водорода, атом галогена или C₁-C₄ - алкильную группу, а X - атом азота или CR₃-группу, в которой R₃ - атом водорода или атом галогена,
или их растворимых солей, отличающийся тем, что осуществляют биотрансформацию азотсодержащей гетероциклической карбоновой кислоты общей формулы II

где R₁, R₂ и X имеют указанные выше значения,
или ее растворимых солей в присутствии штамма бактерий, использующего в качестве единственного источника углерода 6-метилникотиновую кислоту и содержащего специфическую гидролазу. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе биотрансформации используют азотсодержащую гетероциклическую карбоновую кислоту общей формулы II

где R₁ и R₂ имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом хлора или метильную группу, а X - атом азота или CH-группу. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что биотрансформацию проводят в присутствии штамма бактерий Ki 101 (DSM 6920). 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что процесс проводят при однократном или многократном (непрерывном) добавлении субстрата так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала бы 10 мас.%. 5. Способ по пп.1 - 4, отличающийся тем, что процесс проводят при температуре 15 - 50^oC и при pH 5 - 9. 6. Штамм бактерий Ki 101 (DSM 6920), предназначенный для биотрансформации азотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот в азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты, содержащие гидроксильную группу.