СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-ОКСИНИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1994 года по МПК C12P7/40 C12P17/12 

Изобретение относится к способу получения 6-оксиникотиновой кислоты энзиматическим гидроксилированием никотиновой кислоты.

Известны способы получения 6-оксиникотиновой кислоты с помощью живых микроорганизмов родов Pseudomonas, Bacillus или Achromobacter (патент Швейцарии N 658866). Согласно этому способу используют взвесь биомассы соответствующих микроорганизмов, которые получают отдельно путем размножения стартовой культуры. Процесс гидроксилирования осуществляют периодически путем однократного добавления никотиновой кислоты в виде натриевой соли. Ввиду того что в этом способе вследствие применяемых концентраций никотиновой кислоты затормаживается размножение микроорганизмов, необходимо осуществить отдельную предварительную стадию для получения всего количества эффективной биомассы.

Цель изобретения - разработка более простого способа, в результате которого получают высокие концентрацию и выход 6-оксиникотиновой кислоты.

Обнаружено, что можно обойтись без отдельного получения биомассы, если исходя из получаемой известным образом стартовой культуры никотиновую кислоту добавлять таким образом, чтобы ее концентрация в взвеси микроорганизмов в основном поддерживалась ниже концентрации, выше которой затормаживается размножение микроорганизмов. Выражение "в основном" означает, что концентрация кратковременно и/или местно, в частности, в месте добавления кислоты до полного ее перемешивания со взвесью может превысить предельно допустимое значение. В указанных условиях можно было ожидать образования биомассы, но неожиданно оказалось, что в течение этой фазы роста вырабатывается 6-оксиникотиновая кислота, которая не подвергается дальнейшей метаболизации, так что по окончании добавления никотиновой кислоты и после ее полного расхода 6-оксиникотинового кислоту удается выделить практически с количественным выходом. Возрастающая по мере добавления никотиновой кислоты концентрация 6-оксиникотиновой кислоты подавляет рост клеток. Однако последний прекращается только при относительно высоких концентрациях 6-оксиникотиновой кислоты. В зависимости от используемого штамма микроорганизмов эти концентрации составляют около 50 г/л или более. Неожиданно оказалось, что тогда 6-оксиникотиновая кислота больше не подвергается разложению, но торможение гидроксилазы, т.е. энзима, гидроксилирующего никотиновую кислоту, и, следовательно, ограничение достигаемой концентрации целевого продукта при 100% -ном выходе имеют место только при еще более высоких концентрациях. Существенно для предлагаемого способа то, чтобы концентрация никотиновой кислоты в течение роста клеток никогда не понижалась до нуля, так как в противном случае происходит разложение образовавшейся 6-оксиникотиновой кислоты. Только тогда, когда концентрация 6-оксиникотиновой кислоты достигает почти предельного значения, ингибируется ее разложение, так что по окончании добавления никотиновой кислоты можно выжидать ее полного расхода, не опасаясь потерь в выходе. В качестве микроорганизмов, гидроксилирующих никотиновую кислоту, целесообразно использовать такие роды, как Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter. Предпочтение отдается видам Pseudomonas pituda и Achromobacter xylosoxydans, в частности штамму Achromobacter xylosoxydans DSM2783. Предпочтительные микроорганизмы описаны в патенте Швейцарии N 658866. Концентрация никотиновой кислоты в взвеси микроорганизмов за весь период ее добавления составляет меньше 10 г/л. Никотиновую кислоту можно добавить маленькими порциями, предпочтительно она добавляется непрерывно.

Никотиновую кислоту можно вводить в твердом или растворенном виде, причем в каждом случае в виде свободной кислоты или водорастворимой соли. Предпочтение отдается добавлению в виде водного раствора, в частности водного раствора натриевой или калиевой соли.

Целесообразно аэрировать и перемешивать взвесь микроорганизмов, но можно ограничиться перемешивающим действием продуваемого воздуха. Парциальное давление растворенного кислорода (рО₂) должно колебаться в пределах 1-200 мбар, предпочтительно 40-80 мбар. Предпочтительно использование механической мешалки. Процесс размножения микроорганизмов и получение 6-оксиникотиновой кислоты целесообразно осуществить при 20-40^оС и рН 5,5-9.

Вместе с никотиновой кислотой для содействия росту биомассы рекомендуется добавлять еще другие питательные вещества. К ним относятся источники углерода, например глицерин или глюкоза, источники азота, например аммониевые соли или глутаминовая кислота, а также минеральные соли, микроэлементы и витамины. Эти вещества следует добавить в таких количествах, чтобы их концентрация в взвеси микроорганизмов находилась ни в лимитирующих, ни в затормаживающих процесс пределах. Такой режим работы известен каждому специалисту в данной области. Питательные вещества можно добавить как таковые или в виде сложных естественных или получаемых синтетическим путем смесей. Особенно предпочтительное сложное питательное вещество представляет собой дрожжевой экстракт.

Предлагаемый способ можно осуществить и непрерывно тем, что по достижении концентрации 6-оксиникотиновой кислоты, достаточно высокой для предупреждения дальнейшего ее разложения до других продуктов, начинают отделять целевой продукт с одновременной рециркуляцией клеток. Это может быть осуществлено, например, непрерывным или периодическим центрифугированием или ультрафильтрацией.

В целях поддержания на постоянном уровне концентрации целевого продукта скорость подачи никотиновой кислоты должна быть равной скорости отделения продукта.

П р и м е р 1. а). Получение стартовой культуры
Из 5,19 г дигидрата гидрофосфата натрия, 2,0 г дигидрофосфата калия, 0,25 г дрожжевого экстракта, 1,00 г никотиновой кислоты и 500 мл воды приготовляли жидкую питательную среду, которую в течение 20 мин стерилизовали при 120^оС. После охлаждения среды до 30^оС в нее вводили стерильный концентрированный раствор микроэлементов в количестве, обеспечивающем достижение в питательной среде указанных концентраций веществ, мг/л: Дигидрат хлористого кальция 20 Сульфат марганца (11) 10 Гептагидрат сульфата желе- за (11) 5 Гексагидрат сульфата кобаль- та (11) 0,1 Пентагидрат сульфата ме- ди (11) 0,1 Гептагидрат сульфата цинка 0,1 Дигидрат молибдата натрия 0,1
Питательную среду засевали штаммом Achromobacter xylosoxydans DSM 2783. Культуру выращивали в течение 24 ч при 30^оС и рН 7.

б). Получено 6-оксиникотиновой кислоты.

В ферментере емкостью 20 л, снабженном мешалкой, системой аэрации и устройством для регулирования значения рН, в 12 л воды растворяли 90 г никотиновой кислоты, 19,44 г гидроокиси натрия, 90 г дрожжевого экстракта, 12 г сульфата калия, 9,6 г гексанитрата хлористого магния, 1,92 г хлористого кальция, 2,4 мл полипропиленгликоля 2000, 180 г L-глутаминовой кислоты и 300 г глюкозы.

Раствор стерилизовали в течение 30 мин при 121^оС. После охлаждения раствора до 30^оС в него вводили стартовую культуру и с подачей воздуха и перемешиванием культивировали ее в течение 10 ч при рН 7. По истечении этого периода времени концентрация никотиновой кислоты понизилась с 7,5 до 2 г/л (по данным быстродействующей жидкостной хроматографии), а концентрация биомассы повысилась до 10 г/л (сухого вещества). В этот момент начинали добавлять стерилизованный в течение 20 мин при 121^оС раствор: 1,13 г никотиновой кислоты и 0,365 кг гидроокиси натрия в 3 л воды. Скорость добавления устанавливали так, чтобы концентрация никотиновой кислоты в ферментере во время добавления раствора лежала в пределах 1 - 9 г/л. Через 11 ч процесс добавления был закончен, глутаминовая кислота и глюкоза были полностью израсходованы и концентрация биомассы повысилась до 15 г/л (сухого вещества). Через дополнительные 4 ч, т.е. через всего 25 ч после засева, прекращали ферментацию. Конечная концентрация 6-оксиникотиновой кислоты составляла 74 г/л, что соответствует фактически количественному превращению никотиновой кислоты в 6-оксиникотиновую. Реакционную суспензию подвергали центрифугированию с целью отделения клеток. Прозрачный центрифугат довели до рН 1,5 добавлением конц.соляной кислоты, причем 6-оксиникотиновая кислота осаждалась в виде белого твердого вещества. Продукт фильтруют, промывают водой и высушивают при 60^оС и давлении 20 мбар.

П р и м е р 2. а). Получение стартовой культуры.

Аналогично примеру 1а) приготовляли жидкую питательную среду, засевали штаммом Pseudomonas acidovorans DSM 4746. Культуру выращивали в течение 24 ч при 30^оС и рН 7.

б). Получение 6-оксиникотиновой кислоты.

Ферментер емкостью 20 л, описанный в примере 1 б), нагружали жидкой питательной средой и стерилизовали, как указано в этом же примере. Состав жидкой питательной среды был идентичным примеру 1б) за исключением того, что не содержалось глюкозы.

После охлаждения раствора до 30^оС в него вводили стартовую культуру и с подачей воздуха и перемешиванием культивировали ее в течение 8 ч при значении рН 7. По истечении этого периода времени концентрации никотиновой кислоты понизилась с 7,5 до 2,5 г/л (по данным быстродействующей жидкостной хроматографии), а концентрация биомассы повысилась до 9,5 г/л (сухого вещества). В этот момент начинали непрерывно добавлять раствор натрийникотината [его получение и состав соответствуют тем в примере 1б)]. Скорость добавления устанавливали так, чтобы концентрация никотиновой кислоты в ферментере во время добавления раствора лежала в пределах 1 и 9 г/л. Через 12 ч процесс добавления был закончен, глутаминовая кислота была полностью израсходована и концентрация биомассы повысилась до 14 г/л (сухого вещества).

Через дополнительные 4 ч, т.е. через всего 24 ч после завеса, прекращали ферментацию. Конечная концентрация 6-оксиникотиновой кислоты составляла 73 г/л, что соответствует фактически количественному превращению никотиновой кислоты в 6-оксиникотиновую. Переработку продукта осуществляли по примеру 1.

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: способ получения 6-оксиникотиновой кислоты из никотиновой кислоты путем энзиматического гидроксилирования в присутствии микроорганизмов родов Pseudomonas или Achromobacter, в частности Pscedomonas acidovorans DS M 4746 или Achromobacter xylosoxydans DS M 2783. Путем соблюдения определенных пределов концентрации (от 0 до 10 г/л) в течение добавления никотиновой кислоты удается осуществить размножение микроорганизма и получить целевой продукт на одной стадии процесса без потерь в продукте.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-ОКСИНИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ микробиологическим гидроксилированием никотиновой кислоты микроорганизмом из рода Pseudomonas или Achromobacter в аэробных условиях при 20 - 40^oС и при значении pH 5,5 - 9, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют один из штаммов Pseudomonas acidovorans DSM 4746 или Achromobacter xylosoxydans DSM 2783, никотиновую кислоту или ее растворимую соль или ее раствор добавляют к исходной культуре микроорганизма непрерывно или по порциям, причем концентрацию никотиновой кислоты в культуре в процессе ее добавления поддерживают в интервале 0 - 10 г/л по крайней мере до торможения образующейся 6-оксиникотиновой кислотой роста микроорганизма и процесс ведут при одновременном размножении микроорганизма и образовании 6-оксиникотиновой кислоты.