Штамм S - вируса картофеля для получения диагностических сывороток Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области фито- вирусологии, в частности к иммунодиагностике вирусных заболеваний картофеля.

Целью изобретения является получение штамма S-вируса картофеля, обладающего высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностических сывороток с высоким титром антител и отличающихся высокой специфичностью и активностью.

Штамм депонирован во Всесоюзном институте защиты растений Госагропрома СССР под номером 15. Штамм назван S-4.

Морфологические и физические свойства.

Штамм S-вируса картофеля S-4 ВИЗР № 15 имеет нитевидные частицы размером

260-10x12-13 нм. Температурная точка инактивации вируса - 60°С. точка предельного разведения сока - , длительность сохранения инфекционности в соке при 20-22°С 3-4 дня.

В клетках инфицированных растений картофеля и томатов вирус локализуется в виде диффузно рассеянных частиц и в виде скоплений различной формы, отмечена тесная связь вирусных частиц с хлоропластами.

На растениях картофеля различных сортов штамм S-вируса картофеля S-4 вызывает слабое изгибание черешков листьев книзу по главной жилке.

На растениях томата (dycoperslcon csculentum MILL) штамм не вызывает симптомов, накапливаясь в высокой концентраСП

VI о

С

ел

ции . Томаты сорта Невский используют в качестве накопителя вируса.

Штамм вызывает системно оголяющий некроз на растениях мари стенной (Chenopodlum murale L.) и мари Киноа (С. duinoa Wild), характерное закручивание листьев чилийских томатов (Lycoperslcon chilense Dun.) книзу по главной жилке, просветление жилок, сопровождающееся появлением некротических черных пятен на листьях паслена полегающего (Solarium demissum Lindi.).

Лучшими растениями-индикаторами штамма S-вируса картофеля S-4, наиболее стабильно проявляющими в ответ на заражение выраженную системную реакцию, являются чилийские томаты и марьстенная.

Штамм S-вируса картофеля S-4 ВИЗР № 15 легко передается способом механической инокуляции. Для приготовления иноку- ляции листья пораженных растений растирают в фарфоровой ступке с добавлением 0,1 М фосфатного или цитратного буферного раствора рН 7,4 в пропорции 1:1 - 1:10. Полученную вируссодержащую суспензию наносят на листья заражаемого растения с помощью паролонового тампона после предварительного опудривания их мелкозернистым карборундом.

Эффективность передачи на томаты сорта Невский 100%.

Передача штамма с пораженных растений картофеля на растения чилийских томатов персиковой тлей (Mysodes percicae Suls.) 14,1 - 27%, крушинниковой тлей (Aphisnasturtli Kalt.)11,1%. При осуществлении передачи тлями насекомых, собранных со здоровых растений, подсаживают на пораженные растения картофеля на 24 ч, затем переносят на молодые растения чилийских томатов, выращиваемые под изоляторами, которые через 24 - 48 ч, обрабатывают инсектицидом.

Штамм поддерживают в клубнях картофеля сорта Приекульский ранний. Зимой растения картофеля выращивают в теплице, обеспечивая изолированные условия.

Для поддержания штамма используют также заражение растений чилийских томатов и последующее ускорение из боковых побегов.

В течение 3 мес. штамм можно сохранять в лиофилизированном соке листьев пораженных растений картофеля.

Штамм в растениях томата сорта Невский накапливается в высокой концентрации: значение титра вируса 1:64 - 1:128, что в 2-4 раза выше по сравнению с контролем (производственным штаммом). В растениях томата вирус накапливается в максимальной концентрации в листьях среднего яруса через 3-4 нед. после инокуляции. Штамм не оказывает угнетающего действия на растения томата, что позволяет получить большое

количество зеленой массы при высокой концентрации вируса.

П р и м е р 1. Использование штамма S-4 ВИЗР № 15 для сыворотки к S-вирусу картофеля.

0 Листья томатов, инфицированных штаммом S-4, собирают, охлаждают в холодильнике, измельчают на мясорубке, вирус экстрагируют в рабочем буферном растворе, обладающем стабилизирующими свой5 ствами (0,05 М натрий лимоннокислый трехзамещенный, 0,007 М трилон Б, 0,2% сульфита натрия). Инфекционный сок осветляют путем кратковременного (5-6 мин) эмульгирования с охлажденным хлорофор0 мом и низкоскоростного центрифугирования в течение 20 мин при 3500 об/мин. Дальнейшую очистку вируса проводят путем гель-фильтрации на хроматографиче- ских колонках, заполненных гелями на

5 декстрановой основе (молселекты Г-50 и ДЭАЭ-50). Концентрируют вирус 3,1% поли- этиленгликолем (ПЭГ 15000) в присутствии 0,25 М хлористого натрия. После выдерживания вирусного антигена в холодильнике 1

0 ч проводят центрифугирование в течение 20 мин при 4000 об/мин. Осадок ресуспенди- руют в 0,1 исходного объема физиологическим раствором. На всех этапах очистки наличие вируса контролируют серологиче5 ским методом.

Иммунизацию проводят по схеме: 2 внутримышечных инъекции по 2,5 мл с интервалом 1 нед. и 4 внутривенные инъекции с интервалом 1 день по 1, 3,3,3 мл антигена.

0 Кровь отбирают на 7-й, 9-й и 11-й день после последнего введения антигена.

Получают сыворотку крови по общепринятой методике.

5 После получения сыворотки определяют ее титр и специфичность отдельно по кроликам с гомологичными и гетеролргич- ными (X, М, Y, F) вирусами картофеля, а также с растительным соком, полученным

0 из здоровых растений картофеля и томатов. Для определения серологического родства готовят разведения моноштаммовых сывороток от 1:2 до 1:4096 и ставят реакции с антигенами исследуемых штаммов. После

5 определения титра делают рабочее разведение сывороток. Приготовленные таким образом сыворотки испытывают для выявления S-вируса картофеля в штаммовых растениях и растениях картофеля различных сортов.

Полученные сыворотки имеют следующий титр: к штамму S-4- 1:8191. к производственному штамму - 1:1024.

Антисыворотки, полученные к штамму S-4 и к производственному штамму, при разведении 1:4 не реагируют с соком здоровых растений картофеля и томатов, а также с гетерологичными вирусами картофеля, т.е. являются высоко специфичными.

Таким образом, использование в качестве антигена штамма S-4 ВИЗР № 15 позволило получить антисыворотку к S-вирусу картофеля, отличающуюся более высоким титром по сравнению с приготовленной к производственному штамму S-вируса картофеля.

П р и м е р 2. Исследуют выявляемость S-вируса картофеля сыворотками, полученными к штамму S-4 и производственному штамму S-вируса картофеля.

Проводят серологический анализ проб листьев, собранных на посадках картофеля 7 сортов: Невский, Гатчинский, Мавка, Зарево, Приекульский ранний, Луговский. Пораженность материала, по данным серологического анализа, составляет: при использовании сыворотки, приготовленной к производственному штамму S-вируса картофеля 20,0% сыворотки, приготовленной к

штамму S-4-28,0%.

П р и м е р 3. В производственных условиях по схеме, описанной в примере 1, проводят получение антигена, иммунизацию кроликов, получение диагностической сыворотки. С использованием штамма S-4 ВИЗР № 15 можно приготовить серии высокоспецифичной диагностической сыворотки к S- вирусу картофеля с титром 1:4096 - 1:8192. Формула изобретения

Штамм S-вируса картофеля ВИЗР № 15

для получения диагностических сывороток.

Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике вирусных заболеваний картофеля. Цель изобретения - получение штамма S-вируса картофеля, обладающего высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностических сывороток с высоким титром антител и отличающихся высокой специфичностью и активностью. Для этого выделяют из растений сорта Воротынский ранний штамм S-вируса картофеля с последующим получением чистых линий при заражении растений томата сорта Невский и чилийских томатов высокими разведениями сока листьев пораженных растений картофеля. Штамм депонирован в ВИЗР под N15. Он способен накапливать в инфицированных растениях в высокой концентрации. Штамм обеспечивает получение на кроликах специфической сыворотки к S-вирусу картофеля с титром 1:4096-1:8192.