РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РVR6-1 РАЗМЕРОМ 3406 П.Н., ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ДНК-ЗОНДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РОТАВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА 1-Й СУБГРУППЫ И ШТАММ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ESCHERICHIA SOLI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Р VR6-1 И СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЗОНДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РОТАВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА 1-Й СУБГРУППЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N15/46 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине (диагностика вирусных заболеваний человека), генетической инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pVR 6-I-зонд для специфического выявления ротавирусов I-й субгруппы и штамм Е. coli продуцент зонда.

Ротавирусы являются этиологическим агентом острого гастроэнтерита, по иммунологической специфичности разделяются как минимум на 2 субгруппы (с/гр) [Svensson L. L. et al. //J. Clin. Micvjbiol. 1988. 26. P. 1238 1240. Kalica A.R. et fl. //Virologu. 1981. 125. R. 194 205.

Кроме иммунологических методов субгрупповая дифференциация штаммов ротавирусов может быть проведена методом молекулярной гибридизации с использованием ДНК-зондов специфических нуклеотидных последовательностей, характеризующихся наибольшей вариабельностью у ротавирусов различных субгрупп [Estes M. et al. //NAR. 1984. 12. P. 1875. Bofh G. et al. //J. Vivol. - 1984. 51. P. 91 101. Групповую специфичность штамма ротавируса определяет 6-й ген генома.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК, несущая кДНК 6-го гена ротавируса обезьян шт.SА11, имеющего "длинный" электрофоретип (ЭФ тип) РНК, но относящегося к I-й серологической субгруппе. Однако полноразмерные копии 6-го гена ротавирусов не могут быть использованы для субгрупповой дифференциации ротавирусов человека методом молекулярной гибридизации, т.к. дают неспецифические перекрестные реакции (Dimifrov D.H. et fk. // J. infect. Dis. 1985 152, N2. P. 293 300; Новикова Н.А. и др. Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. Томск, 1991, ч.1, с. 44-45). В связи с этим для создания ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека I с/гр. необходимо получение кДНК на матрице РНК 6-го гена ротавируса человека I с/гр. и выбор наиболее вариабельного участка кДНК, обладающего с/гр. специфичностью в реакции гибридизации.

Целью изобретения является создание штамма E.coli ТG-I, содержащего плазмиду-продуцент ДНК-зонда для специфического выявления ротавирусов I-й с/гр.

Цель достигается тем, что:
1. Выделяют двунитевую РНК ротавирусов человека, характеризующуюся "коротким" электрофоретипом (I с/гр.).

2. Проводят синтез кДНК с использованием статистических затравок. Получают фрагменты ДНК- комплементарные РНК 6-го гена ротавирусов человека I с/гр.

3. Проводят лигирование кДНК с линеализованной по SmaI сайту плазмидой pGEM4Z.

4. Проводят трансформацию клеток Е.соli TG-I, отбирают клоны, несущие рекомбинантные плазмидные ДНК.

5. С использованием метода молекулярной гибридизации проводят отбор клонов E. coli, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК со встроенным фрагментом кДHК, специфически гибридизующимся с РНК 6-го гена ротавирусов человека I с/гр.

Сущность предлагаемых объектов изобретения состоит в следующем:
А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVR 6-I размером 3406 п.о. состоит из:
SmaI-SmaI фрагмента ДНК (dVR 6-I) размером 0,66 т.п.н. комплементарного участку 6-го гена ротавируса человека I-й с/гр.

SmaI-SmaI фрагмента векторной плазмиды pGEM4Z, размером 2746 п.н.

уникальные сайты реcтрикции для эндонуклеаз: Eco R I, Sac I, Kpn I, Ava I, Bam HI, Xba I, Sal I, Acc I, Hinc II, Psf I, Sph I, Hind III, Sca I, Xmn I, Ssp I, Aaf II, Nde I, Nar I.

промоторы для SP6 РНК полимеразы и Т7 РНК- полимеразы;
ori репликации плазмиды pGEM4Z;
селективные маркеры Amp^r, hac^-;
область, кодирующую α-пептид b-галактозидазы, синтез которой инактивирован встройкой dVR 6-I фрагмента кДНК.

Б. Штамм трансформированных бактерий Е. coli TG-I, используемый для получения специфического ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека I-ой с/гр.

Штамм бактерий E.coli TG-I, содержащий плазмиду pVR 6-I, депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под N ВКМ СR 367 D), характеризуется следующими признаками:
морфологические признаки: клетки прямые, палочковидные (1,2-1,6 х 2,0 x 6,0 мкм), подвижные, имеют перитрихиальные жгутики, грамотрицательные, неспороносные;
культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах; на 1,5 питательном отаре Дифко колонии гладкие, серы, блестящие, края ровные, мутные: при выращивании в жидких средах - мясопептонном бульоне и L-бульоне образуют ровную интенсивную муть;
физиолого-биохимические признаки: оптимальная температура жизнедеятельности 37^oС, рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота используют минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме) органические соединения (в виде пептона, триптона,аминокислот).

Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к ампицилиyу (100-150 мг/л).

Генетические признаки:
D (lac pro) Hi, sfr A, sup E, end A, sbe B, hst R^-, F^', tra D 36, pro AB, lac IV, 2 D M 15.

Присутствие в штаммах плазмидных ДНК, содержащих фрагментызонды, комплементарные 6-му сегменту РНК ротавируса человека 1-й с/гр. подтверждается путем проверки их устойчивости к ампицилину, путем выделения и анализа плазмидной ДНК одним из известных методов.

Проверку устойчивости рекомбинантного штамма Е.соli к ампицилину проверяют путем высевания клеток на агаризованную питательную среду (бакто-агар 1,5 г, мясопептонный бульон до 100 мл), содержащую 25 мг/мл Na-ампицилина. При наличии устойчивости трансформированных клеток Е.соli к ампицилину на чашках после инкубации при 37^oС в течение ночи вырастают колонии клеток Е. соli.

Небольшие количества плазмидной ДНК из трансформированных клеток Е. coli выделяют следующим образом: клетки Е. coli суспендируют в среде, содержащей 2,5 М LiCl, 50 мМ трис-HCl(pH 8,0), 4% тритона х -100 и 62,5 мM ЭДТА-Na₂ с добавлением равного объема смеси фенол:хлороформ (N 1:1). Суспензию центрифугируют 5-10 мин при 5 тыс.об/мин. Водную фазу отбирают и преципитируют плазмидную ДНК добавлением 0,1 объема 3 М раствора ацетата натрия (рН 5,2) и 0,6 объема изопропилевого спирта. Плазмидную ДНК осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 10-12 тыс.об/мин. Осадок растворяют в 50 мкл дист. и анализируют с использованием электрофореза в 1 агарозе в 0,089 М трис-боратном буфере при 100V на гель в течение 1,5 ч. В качестве контрольного образца используют 10 нг векторной плазмидной ДНК pGEM4Z.

Пример 1. Выделение очищенной РНК ротавирусов человека.

РНК ротавируса человека (РВЧ) выделяли из инфекционного материала больного ротавирусным гастроэнтеритом (изолят N 2175). Ротавирусы данного изолята имеют "короткий" тип миграции РНК (фиг. 1). Ротавирусы человека, имеющие "короткий" тип миграции РНК, относятся к 1-й серологической субгруппе.

500 мг инфекционного материала гомогенизируют в 3 мл буфера, содержащего 0,01 М СН₃СООNa, 0,3 М NaCl, 4 мМ ЭДТА (рН 5,2), 1% ДСН и инкубируют 1 ч при 37^oC. Затем добавляют равный объем прогретой до 65^oС фенол:хлороформенной (1: 1) смеси, перемешивают и инкубируют 3-6 мин при 65^oС. Центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 10 мин и отбирают супернатант. Экстракцию повторяют один раз при 65^oС и затем при комнатной температуре аналогично описанному выше. К отобранному супернатанту добавляют 0,1 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 2 объема этанола, выдерживают 18-20 ч при минус 20^oС и центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 1 ч. Осадок растворяют в 1 мл буфера, содержащего 0,01 М трис-НСl (рН 8,0), 0,001 М МgСl₂, 0,3 M NaCl; 20 мкг/мл панкреатической ДНКазы, инкубируют 30 мин при 25^oС, добавляют равный объем фенола (рН 8,0), интенсивно перемешивают и центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 10 мин. Водную фазу отбирают. РНК преципитируют этанолом, как описано выше, и растворяют в буфере, содержащем 10 мМ трис- НСl(рН 8,0); 1 мМ ЭДТА (ТЕ-буфер). Осадки хранят при минус 20^oС.

На следующем этапе работы проводят электрофорез РНК в 10% ПААГ в течение 18 ч с использованием буферной системы Лэммли следующего состава: 0,025 М трис- HСl (рН 8,4), 0,192 М глицин, 0,1 додецилсульфат натрия. Гель окрашивают этидиумбромидом и под ультрафиолетом вырезают 6-й сегмент РНК. Кусочек геля измельчают, заливают буфером, содержащим 0,5 М ацетата аммония (рН 8,0), 0,1 ДСН и 1 мМ ЭДТА, выдерживают при 37^oС в течение ночи и проводят фенольную экстракцию. РНК преципитируют этанолом, высушивают, растворяют в ТЕ-буфере и используют для получения ДНК-копии.

Пример 2. Синтез кДНК.

Синтез кДНК осуществляли на матрице днРНК 6-го гена РВЧ, относящегося к 1 с/гр.

К препарату днРНК ротавирусов (5-10 мкг) в буфере ТЕ добавляют 5 мкг "статистических затравок", денатурируют 3 мин при 100^oC и охлаждают во льду. Синтез кДНК проводят в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (pН 8,3) 50 мМ КСl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ dАТФ, dСТФ, dГТФ и dTTФ в объеме реакционной смеси 50 мкл. Добавляют 10 ед. РНКазина и 25 ед. обратной транскриптазы из вируса миелобластоза птиц (Омутнинский химический завод) и инкубируют 2 ч при 42^oС.

Цепи РНК удаляют щелочным гидролизом (0,25 М NaОН 20 мин при 70^oС), препарат нейтрализуют НСl, депротеинизируют равным объемом фенола (рН 8,0), нуклеиновые кислоты осаждают 2 объемами этанола в присутствии 2,5 М ацетата аммония.

Для получения двунитевой (дн) кДНК препарат в объеме 50 мкл ТЕ прогревают 2 мин при 100^oC, добавляют NaСl до 0,2 М и отжигают комплементарные молекулы ДНК 30 мин при 65^oС, 60 мин при 50^oС, 30 мин при 40^oС.

Двунитевую ДНК осаждают 2 объемами этанола в присутствии 0,З М ацетата натрия.

Достройку дн кДНК до образования "тупых" концов проводят с помощью фермента Кленова в буфере, содержащем 0,1 М Hepes рН 6,9; 10 мМ MgCl₂, 5 мМ ДТТ, 0,14 М КСl, 1 мМ каждого дНТФ, 50 ед. фрагмента Кленова при 15^oС в течение 20 ч. Реакцию останавливают добавлением 2 Мкл 0,5 М ЭДТА, проводят экстракцию фенолом, кДНК осаждают этанолом.

Пример 3. Клонирование кДНК в векторной плазмиде.

5 мкг векторной плазмиды pGEM4Z гидролизуют эндонуклеазой ревтрикции Sma-I в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-НСl, (рН 8,0), 20 мМ КСl, 10 мМ MgCl₂, 60 мм b-МЭ, в течение ночи при 30^oС, затем депротеинизируют двукратной экстракцией фенолом (рН 8,0). Фенол удаляют экстракцией равным объемам хлороформа и плазмидную ДНК осаждают спиртом.

Плазмидную ДНК и кДНК смешивают в эквивалентных количествах и соосаждают 2,5 объемами этанола. Осадок ДНК растворяют в 30 мкл буфера,содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ МgСl₂, 10 мМ ДТТ, 0,0025 мМ АТФ и 10 ед. ДНК-лигазы Т4. Реакцию проводят 2 ч при комнатной температуре в течение ночи при 15^oС. Результативность реакции проверяют методом электрофореза 1% агарозном геле.

Пример 4. Создание штаммов Е.соli, несущих рекомбинантные плазмидные ДНК.

В качестве резистентного штамма используют клетки Е.соli TG-I. Клетки E. coli, выращенные при 37^oС до λ₅₅₀= 0,2 охлаждают во льду в течение 10 мин и осаждают при 3 тыс.об/мин, 10 мин и 4^oС. Осадок клеток суспендируют в 50 мл ледяного буфера (10 мМ триc-HCl, pH 8,0, 50 мм CaCl₂) и выдерживают во льду 15 мин. Клетки осаждают как описано выше и суспендируют в 6 мл ледяного буфера и расфасовывают по 100 мкл.

К 50 мкл смеси гибридных молекул ДНК добавляют 100 мкл клеток, инкубируют 1 ч при 0^oC, затем 2 мин при 42^oС. После 10-кратного разведения бульоном 2хУТ клетки подращивают 2 ч с интенсивной аэрацией при 37^oС и высевают на агаризованнуй среду 2хУТ, содержащую 0,004 бром-хлор-индолин-галактозидазы, 40 мМ изопропил-тиогалактозидазы и 100 мм/мл ампицилина. Из выросших при 37^oС клонов трансформантов белого цвета выделяют плазмидную ДНК щелочным способом. С этой целью клетки Е.соli из отдельных колоний помещают в 25 мкл лизирующего буфера ( 50 мМ NaCl, 0,5 ДСН, 5 мМ ЭДТА), выдерживают 45-60 мин при 68^oС и добавляют 2,5 мкл 25% фикола. Полученные препараты анализируют в 1 агарозном геле в трис-боратной буферной системе при 100V в течение 2 ч. Гель окрашивают бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и анализируют в ультрафиолетовом свете. Отбирают штаммы Е.соli, продуцирующие рекомбинантные ДНК, содержащие фрагменты кДНК.

Пример 5. Идентификация специфичного для I-й субгруппы ДНК-зонда.

Проводят выделение рекомбинантных плазмидных ДНК, несущих вставки кДНК. Плазмидные ДНК метят α-P³²-dАТФ в процессе никтрансляции. Проверяют специфичность рекомбинантных ДНК методом молекулярной гибридизации сРНК и кДНК 6-го гена генома ротавирусов. С этой целью на нейлоновые фильтры производства р/к Хайли-Кайлур наносят кДНК 6-го гена РВЧ I-й и II-й субгрупп и тотальную РНК РВЧ I-й и II-й субгрупп. Проводят гибридизацию серии меченных α-P³² рекомбинантных ДНК с нуклеиновыми кислотами, нанесенными на фильтр. Идентифицируют плазмидную ДНК, которая гибридизуется с кДНК РВЧ I-й с/гр.(сама на себя) и с РНК РВЧ I-й с/гр. и не гибридизуется с кДНК и РНК РВЧ II-й с/гр. (фиг.2).

Рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую кДНК 6-го гена РВЧ I-й с/гр. специфически гибридизующуюся только с РНК РВЧ I-й с/гр. рестрицируют ферментами EcoRI и PstI в буфере У2 и определяют размер вставки к ДНК. Он равен 660 п.н. (фиг.3).

Идентифицированную рекомбинантную плазмидную ДНК обозначают рVR6-1. Физическая карта плазмиды рVR6-I-ДНК-зонда для специфического выявления ротавирусов I-й с/гр. представлена на фиг.4.

Таким образом, в результате генноинженерных разработок создан штамм E. coli ВКМ СR-367D, используемый для получения рекомбинантной плазмидной ДНК рVR6-I несущий фрагмент кДНК-зонд для специфического выявления ротавирусов человека I-й субгруппы.

Уровень синтеза зонда в составе плазмиды в сконструированном штамме Е. coli ВКМ CR-367D составляет при плотности культуры 5 x 10⁸ кл/мл 1,5 мг/л.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рVR6-I, содержащая фрагмент кДНК 6-го гена РВЧ I-й с/гр. и штамм E.coli ВКМ CR-367D используемый для получения ДНК-зонда для специфического выявления ротавирусов человека I-й субгруппы созданы в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии ГК СЭН.

Использование: медицинская биотехнология, диагностика вирусных заболеваний человека. Сущность изобретения: получение рекомбинантной плазмидной ДНК рVR6-I используемой для выделения зонда, который служит для специфического выявления ротавирусов человека I-й субгруппы и получение штамма трансформированных бактерий Escherichia coli, содержащего плазмидную ДНК pVR6-I. Полученная плазмида содержит SmaI-SmaI фрагмент кДНK размером 660 п. н. , гомологичный участку 6-ого гена ротавирусов человека I-й субгруппы. Уровень синтеза зонда в составе плазмиды в сконструированном штамме Е. coli составляет при плотности культуры 5х10⁸ кл/мл 1,5 мг/мл. 2 с. п. ф-лы, 4 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVR6-1 размером 3406 п.н. используемая для получения специфического ДНК-зонда дня выявления ротавирусов человека 1-й субгруппы, содержащая фрагмент ДНК размером 660 п.н, гомологичный участку 6-го гена ротавирусов 1-й субгруппы, SmaI-SmaI фрагмент размером 2746 п. н. векторной плазмиды рGЕМ4Z, уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз: EcoRI, SacI, KpnI, AvaI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, HincII, PstI, SphI, HindIII, ScaI, XmnI, SspI, AatII, NdeI, NarI, промоторы для SP6 РНК-полимеразы и Т7 РНК-полимеразы, ori репликации плазмиды р GЕМ4, селективные маркеры Amp^r, hac^-. 2. Штамм трансформированных микроорганизмов Escherichia coli BKM СR - 367D, используемый для получения рекомбинантной плазмидной ДНК рV R6-1 и специфического зонда для выявления ротавирусов человека 1-й субгруппы.