СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПУЛЛОРОЗА-ТИФА ПТИЦ Российский патент 1996 года по МПК A61K39/112 G01N33/555 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов, используемых для массовой прижизненной диагностики пуллороза тифа птиц.

Известны способы получения диагностических препаратов, включающие выделение из микробных клеток полисахаридно-полипептидного комплекса или О-антигенной фракции, с последующей сенсибилизацией ими формалинизированных эритроцитов.

Однако антигены, полученные известными способами в условиях отечественных биофабрик, обладают значительно более низкой гемосенситивной, антигенной и серологической активностью, чем лабораторные образцы, что не позволяет получить промышленным поточным методом эритроцитарные диагностикумы с требуемыми стандартными качествами.

В птицеводческой практике для прижизненной диагностики пуллороза-тифа применяется пуллорный эритроцитарный антиген, способ получения которого заключается в выращивании бактериальной массы возбудителя пуллороза-тифа в реакторах глубинным методом, получении бактериальной массы центрифугированием, гидролизе бактериальной массы в 0,1 н растворе уксусной кислоты при 90-92^oС в течение 60 мин с последующим освобождением гидролизата от бактериальных клеток центрифугированием, а от уксусной кислоты диализом против водопроводной воды до рН 5,0-5,5, осаждении полисахаридно-полипептидной фракции из гидролизата 8-10 объемами этанола и сенсибилизации полисахаридно-полипептидной фракцией формалинизированных эритроцитов барана.

При осуществлении такого способа в условиях биофабрик трудно получить высококачественный эритроцитарный диагностикум. Это обусловлено значительной утратой под воздействием примеси железа, способности полисахаридно-полипептидной фракции вступать в прочную химическую связь с рецепторами эритроцитов.

В биологической промышленности для получения питательной среды бульона Хоттингера; выращивания бактериальной массы, гидролиза бактериальной массы в растворе уксусной кислоты используют металлические реакторы, на внутренней поверхности которых в процессе стерилизации и выращивании биомассы при постоянной аэрации образуется ржавчина (Fe₂О₃). Во время культивирования штаммов возбудителя пуллороза-тифа в течение 12-14 ч при непрерывной работе электромешалки 90-120 об/мин со стенок реакторов смывается вместе с бактериальными клетками окись железа и осаждается при центрифугировании. При гидролизе бактериальной массы в 0,1 н растворе уксусной кислоты при 90-92^oС окись железа растворяется и остается в гидролизате после удаления бактериальной массы центрифугированием. Кроме того, в течение первых 24 ч диализа, когда рН гидролизата 2,0-3,0, частично соединения железа попадают в гидролизат из водопроводной воды.

Растворенные соединения железа в гидролизате вступают в связь с активными центрами полисахаридно-полипептидной цепи, тем самым лишая ее ковалентности по отношению к рецепторам эритроцитов и возможности прочной химической связи О-антигенной фракции с эритроцитами, т.е. теряются сенсибилизирующие свойства антигена.

Помимо того, при осаждении полисахаридно-полипептидной фракции в этаноле вместе с ней в осадок выпадает гидрат окиси железа, образующийся в этаноле. Растворить в дистиллированной воде полисахаридно-полипептидную фракцию загрязненную гидратом окиси железа, практически невозможно при любом значении рН. Поэтому сенсибилизация эритроцитов полисахаридно-полипептидной фракцией с примесью гидрата окиси железа происходит по варианту рыхлого, а не прочного химического связывания антигенной фракции, вследствие чего полисахаридно-полипептидная фракция с поверхности эритроцитов удаляется при отмывании буферным раствором после сенсибилизации, а также элюирует в раствор при хранении. Нельзя пренебрегать и тем, что работа постоянно с 2000 3000 литрами спирта в производственном цехе, насыщенном множеством оборудования, крайне пожароопасна, как и социально нежелательна. Ежегодно на производство пуллорного эритроцитарного антигена расходуется 100000 литров спирта ректификата.

Повысить качество антигена с использованием известного способа возможно лишь при условии, если будет использовано оборудование (реакторы, трубопроводы), исключающие загрязнение бактериальной массы соединениями железа и замена водопроводной воды для диализа дименирализованной. Наши отечественные биофабрики выполнить эти условия не могут.

Целью изобретения является разработка надежного, экономичного и безопасного в пожарном отношении способа получения пуллорного антигена, который позволит получать стабильно высокоэффективный диагностикум для исследования птиц в полевых условиях.

Это достигается тем, что из полученной бактериальной массы возбудителя пуллороза-тифа выделяют О-антигенную фракцию и сенсибилизируют ею эритроциты барана.

О-антигенную фракцию выделяют щелочным гидролизом при температуре 92-94^oС в течение 2 ч.

Сенсибилизацию эритроцитов барана проводят в течение 4 ч при 45-48^oС или в процессе формалинизации.

При таком способе получают высокоэффективной и специфичный растворимый О-антиген из клеточных стенок возбудителя пуллороза-тифа, обладающий максимально возможной для О-антигенной фракции способностью вступать в прочную связь с рецепторами эритроцитов.

Высокая диагностическая ценность антигена обусловлена полным исключением отрицательного влияния железа и его соединений на антигенную, гомосенситивную активность и растворимость в буферном растворе рН 7,0-7,4 О-антигенной фракции, так как при щелочном гидролизе бактериальной массы, в отличие от уксуснокислого, содержащаяся в ней примесь окиси железа, остается в нерастворенном состоянии или частично переходит в гидрат окиси железа, который в щелочной среде также не растворим. Поэтому при освобождении гидролизата от бактериальных клеток центрифугированием, он полностью освобождается и от соединений железа.

При предлагаемом щелочном гидролизе отпадает необходимость диализа против водопроводной воды, тем самым предотвращается повторное загрязнение и значительные потери О-антигенной фракции.

Благодаря высокой сенсибилизирующей активности О-антигенной фракции, полученной щелочным гидролизом, для достижения предельного уровня насыщения рецепторов эритроцитов требуется значительно меньшая сенсибилизирующая доза, в сравнении с полисахаридно-полипептидным комплексом, выделенным уксуснокислым гидролизом. Это делает нецелесообразным осаждение О-антигенной фракции в этаноле, а следовательно устраняется пожароопасность. Исключение диализа гидролизата, осаждения в этаноле О-антигенной фракции помимо сокращения технологического цикла на 4 сут позволяет снизить стоимость препарата, как минимум, на 40%
Пример. А. Получение О-антигенной фракции. Бактериальную массу S.gallinarum-pullorum, выращенную в бульоне Хоттингера в реакторах, осаждают центрифугированием при 12 тыс об/мин на центрифуге СГО-100. Осадок бактериальной массы суспендируют в 0,1% -ном растворе КОН до концентрации 90-100 млрд микробных клеток в 1 см по оптическому стандарту мутности и экстрагируют при 92-94^oС в течение 2 ч. Гидролизат освобождают от бактериальных клеток при том же режиме центрифугирования, определяют концентрацию О-антигенной фракции в гидролизате. рН гидролизата доводят до 7,6-7,8 10%-ным раствором Н₂SО₄, выдерживают в водяной бане при 90-92^oС в течение 40-45 мин и используют в качестве сенситина.

Б. Сенсибилизация и формалинизация эритроцитов барана. Кровь барана в растворе Олсевера в соотношении 1:1 центрифугируют при 7000 об/мин на центрифуге СГО-100, осадок эритроцитов отмывают от плазмы 5 объемами фосфатно-буферного раствора (рН 7,2-7,4) при том же режиме центрифугирования и суспендируют до 20% концентрации в фосфатнобуферном растворе, содержащем 0,3-0,33% формальдегида, выдерживают при 45-50^oС в течение 3-3,5 ч. По истечении указанного срока добавляют гидролизат (сенситин) возбудителя пуллороза-тифа из расчета 1,0-1,2 мг сухого вещества О-антигенной фракции на 1 см 20% взвеси эритроцитов, тщательно перемешивают и выдерживают 4 ч при 45-48^oС и 10-12 ч при 41-42^oС. Сенсибилизированные и консервированные эритроциты осаждают центрифугированием при 7000 об/мин, 2 раза отмывают 5 объемами фосфатно-буферного раствора при том же режиме центрифугирования. Осадок отмытых, сенсибилизированных и формалинизированных эритроцитов суспендируют в фосфатно-буферном растворе рН 7,2-7,4 до 10% концентрации и добавляют формальдегид из расчета 0,03-0,033%
Для получения эритроцитарного диагностикума можно использовать и впрок формалинизированные эритроциты при температуре 40-41^oС в течение 16 ч при концентрации формальдегида 0,3-0,033% Сенсибилизацию предварительно формалинизированных эритроцитов проводят при 45-50^oС в течение 4 ч.

Пуллорный эритроцитарный антиген, приготовленный предлагаемым способом, сохраняет свою активность и специфичность в течение 2 лет при 4-8^oС.

При таком способе получают из бактериальной массы S.gallinarum-pullorum О-антиген, свободный от примеси соединений железа, обладающий максимально возможной сенсибилизирующей, антителосвязывающей, агглютинирующей активностью, комплементарностью и способностью вступать в прочную химическую связь с рецепторами эритроцитов, который по своей диагностической ценности в кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации превосходит существующий пуллорный диагностикум (табл.1-5).

Технология промышленного производства антигена по предлагаемому способу предельно проста, безопасна в пожарном отношении, на 4 сут требуется меньше времени и в сравнении с принятой технологией на 40-45% снижает себестоимость диагностикума.

Методика исследования птиц не меняется по сравнению с используемой для известного антигена.

Использование: ветеринарная микробиология, эритроцитарный диагностикум, пуллороз - тиф птиц. Сущность изобретения: выращивают бактериальную массу возбудителя пуллороза - тифа птиц и выделяют из нее О-антигенную фракцию гидролизом в 0,1%-ном растворе КОН при температуре 92-94^oС в течение 110-120 мин. Сенсибилизацию эритроцитов барана проводят в течение 4 ч при 45-50^oС или в процессе формалинизации. При этом сенсибилизацию проводят при концентрации О-антигенной фракции 1-1,2 мг на 1,0 см³ 19-20%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов. Для получения эритроцитарного диагностикума сенсибилизацию эритроцитов можно проводить в процессе формалинизации эритроцитов через 3-3,5 ч от ее начала при 45-48^oС в течение 4 ч, а затем при 41-42^oС в течение 10-12 ч. 1 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц, включающий получение бактериальной массы Salmonella pullorum-gillinarum, выделение из нее антигенной фракции, формалинизацию эритроцитов баранов и сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов полученным антигеном, отличающийся тем, что выделяют O-антигенную фракцию гидролизом бактериальной массы в 0,1%-ном растворе КОН при температуре 92 - 94^oC в течение 110 120 мин, а сенсибилизацию проводят при температуре 45 50^oC в течение 4 ч при концентрации O-антигенной фракции 1 1,2 мг на 1,0 см³ 19 20% -ной взвеси эритроцитов в фосфатно-буферном растворе. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят в процессе формалинизации эритроцитов через 3 3,5 ч от ее начала при температуре 45 48^oC в течение 4 ч, а затем при температуре 41 - 42^oC в течение 10 12 ч.