СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПОЛЛУРОЗА-ТИФА ПТИЦ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/555 A61K39/112 G01N33/539 A61K39/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Известны способы получения эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифв птиц [1 3]
Однако существующий способ изготовления антигена обладает рядом недостатков. Изготовление антигена осуществляется в течение 15 дн и включает восемь стадий с использованием для стадии экстрагирования 0,2 н. уксусной кислоты из расчета 1 г на 0,6 0,8 кг сырой бакмассы и осаждение деконтата этанолом из расчета 8 10 объемов на объем гидролизата. Осуществляется три стадии центрифугирования для разделения биомассы, для получения фугата-синсетина и для удаления несоединившегося антигена, что требует больших материальных и временных затрат (до 3-х сут).

Длительность и многооперационность процесса может привести к контаминации антигена посторонней микрофлорой, нарушению технологии отдельных стадий, а следовательно, снижению качества конечного продукта по сравнению с требованиями технических условий на "Антиген пуллорный эритроцитарный" (ТУ 46-21-530-80).

Все это делает процесс изготовления пуллорного эритроцитарного антигена трудоемким и конечный продукт из-за высокой себестоимости производства является неконкурентноспособным.

Целью изобретения является повышение качества и снижение себестоимости при производстве пуллорного эритроцитарного антигена.

Цель достигается исключением в технологии использования для экстрагирования уксусной кислоты, а для осаждения фугата-синсетина этанола, сокращением количества стадий технологического процесса с 8 до 4, а требуемого времени на изготовление антигена с 15 до 5 сут.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Собранную биомассу после глубинного культивирования в биореакторах штамма S. gallinarum pullorum 24KCT, ЛБ, 10-Б в "S"-форме возбудителя пуллороза-тифа ресуспендируют с помощью поверхностно-активного вещества МС-37 ТУ-10-964-92 и щелочи (1%-ный раствор ПАВ и 1%-ный раствор двууглекислого натрия или 0,2%-ный раствор NaOH на дистиллированной воде) до концентрации 25 млрд. микробных клеток в 1 мл и экстрагируют в течение 60 мин при t 93 96^oC. Экстракт освобождают от клеточного дейтрита центрифугированием на центрифуге ОТР-101 К (16000 об/мин) и прогревают при t 93 96^oC в течение 50 60 мин. Полученный экстракт фильтруют и используют для сенсибилизации эритроцитов барана.

Сенсибилизация эритроцитов барана.

Сенсибилизацию эритроцитов проводят экстрактом антигенного комплекса. На 1 л 20% взвеси формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе pH 7,2 7,4 добавляют 300 350 мл экстракта антигена. Тщательно перемешивают и подогревают в водяной бане при t 56 60^oC 30 40 мин. Затем взвесь эритроцитов выдерживают при t 40^oC 2 3 ч или при комнатной температуре 12 ч. Бутыли оставляют для осаждения методом отстоя. По мере оседания эритроцитов сенсибилизирующий раствор сливают, а к осадку доливают равный объем буфера с 0,15% формальдегида. Операцию повторяют 3-4 раза до полного осветления надосадочной жидкости.

Отмытые сенсибилизированные эритроциты фильтруют через бязево-марлевую салфетку, ресуспендируют в стерильном фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,15% формальдегида, до 10% концентрации и выдерживают при t 37^oC 24 ч. Далее производится расфасовка в 20 мл флаконы. Данные по предлагаемому способу по сравнению с существующим принятым за прототип приведены в таблице.

Таким образом, исключение ряда стадий производства антигена и использование больших объемов уксусной кислоты и этанола повышает качество и снижает себестоимость препарата.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:
1. Временная инструкция по изготовлению и контролю пуллорозного эритроцитарного антигена, утв. 21.05.1980 (прототип).

2. Антиген пуллорный эритроцитарный. Технические условия (ТУ 46-21-530-80), утв. 10.07.80.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М. Мир, 1987, 58, 59, 68, 153, 345.

Использование: биотехнология, эритроцитарный антиген, диагностика пуллороза-тифа птиц. Сущность изобретения: способ изготовления пуллорного эритроцитарного антигена включает следующие операции: ресуспендирование бикмассы ПАВ с добавлением NaCO₃, или NaOH с последующим экстрагированием при t 93 - 96^oC в течение 60 мин. центрофугирование и фильтрация для получения экстракта антиген-сенситина, наслоение экстракта антиген-сенситина на формалинизированные эритроциты, осветление сенсибилизированных эритроцитов барана методом осаждения и разведения их до 10% концентрации. Длительность процесса сокращается с 15 до 5 сут. исключается использование уксусной кислоты и этанола при повышении качества препарата. 3 з. п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц, включающий получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии, отличающийся тем, что выделение антигенной фракции осуществляют обработкой бактериальной массы поверхностно-активным веществом МС-37 с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93 96^oС. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество и соду берут в количестве 1 об. а щелочь 0,2 об. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соды используют двууглекислый натрий, а щелочи едкий натрий.