СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПОЛЛУРОЗА-ТИФА ПТИЦ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/531 C12Q1/689 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов, используемых для массовой прижизненной диагностики пуллороза тифа птиц.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц, включающий получение бактериальной массы Salmonella pullorum-gillinarum, выделение из нее антигенной фракции, формалинизацию эритроцитов баранов и сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов полученным антигеном, отличающийся тем, что выделяют O-антигенную фракцию гидролизом бактериальной массы в 0,1%-ном растворе КОН при температуре 92-94°C в течение 110 120 мин, а сенсибилизацию проводят при температуре 45 50°C в течение 4 ч при концентрации O-антигенной фракции 1 1,2 мг на 1,0 см³ 19 20%-ной взвеси эритроцитов в фосфатно-буферном растворе (Патент РФ №2070055, МПК A61K 39/112, G01N 33/555, опубликовано 10.12.1996).

Однако известный процесс изготовления пуллорного эритроцитарного антигена является недостаточно эффективным из-за низкого выхода целевого продукта.

Известен также способ изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц, включающий получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции обработкой бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93 96°C с последующей сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии (Патент РФ №2085949, МПК G01N 33/555, A61K 39/112, G01N 33/539, A61K 39/02, опубликовано 27.07.1997).

Задачей предполагаемого изобретения является повышение чувствительности целевого продукта.

Это достигается в способе изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц, включающий получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции обработкой бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93 96°C с последующей сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии тем, что в качестве поверхностно-активного вещества для выделения антигенной фракции используют 0,8-1,2%-ный водный раствор Дезмола, взятого в конечной весовой концентрации 0,1-0,5%, а сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят в присутствии натриевой соли сукцината хитозана, взятой в конечной весовой концентрации 0,5-1,5%.

Известно моюще-дезинфицирующие средства, представляющие собой смеси синтетических детергентов, главным образом анионоактивных и бактерицидных хлорсодержащих веществ. К числу таких средств относится дезмол (авт. свид. №223979, кл. C11D 3/065, 1966 г.). Дезмол содержит поверхностно-активное - вещество триполифосфат натрия, метасиликат натрия, хлорамин, кальцинированную соду, сульфат натрия и воду.

Известен способ получения натриевой соли сукцината хитозана (Патент RU 2144040, МПК С08В 37/08, A61K 31/722, Опубликовано 10.01.2000), который может быть использован в ветеринарии, медицине и косметике в качестве пленкообразователя, гидранта или эмульгатора.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах:

Пример 1.

А. Получение O-антигенной фракции.

Собранную биомассу после глубинного культивирования в биореакторах штамма S. gallinarum pullorum 24КСТ, ЛБ, 10-Б в "S''-форме возбудителя пуллороза-тифа ресуспендируют с помощью поверхностно-активного вещества и щелочи (0,8%-ный водный раствор Дезмола, взятого в конечной весовой концентрации 0,1% и 1%-ный водный раствор двууглекислого натрия, взятый в конечной весовой концентрации 0,1% или 0,2%-ный раствор NaOH, взятый в конечной весовой концентрации 0,01%) до концентрации 25 млрд. микробных клеток в 1 мл и экстрагируют в течение 60 мин при t 93-96°C. Экстракт освобождают от клеточного дейтрита центрифугированием на центрифуге OTP-101 К (20000 об/мин) и прогревают при t 93°C в течение 50 мин. Полученный экстракт фильтруют и используют для сенсибилизации эритроцитов барана.

Б. Сенсибилизация эритроцитов барана.

Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят экстрактом антигенного комплекса в присутствии натриевой соли сукцината хитозана, взятой в конечной весовой концентрации 0,5%. На 1 л 20% взвеси формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе pH 7,2 добавляют 300 мл экстракта антигена. Тщательно перемешивают и подогревают в водяной бане при t 56°C 30 мин. Затем взвесь эритроцитов выдерживают при t 40°C 2 ч или при комнатной температуре 12 ч. Бутыли оставляют для осаждения методом отстоя. По мере оседания эритроцитов сенсибилизирующий раствор сливают, а к осадку доливают равный объем буфера с 0,15% формальдегида. Операцию повторяют 3-4 раза до полного осветления надосадочной жидкости.

Отмытые сенсибилизированные эритроциты фильтруют через бязево-марлевую салфетку, ресуспендируют в стерильном фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,15% формальдегида, до 10% концентрации и выдерживают при t 37°C 24 ч. Далее производится расфасовка в 20 мл флаконы, получая состав 1 эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Пример 2.

А. Получение О-антигенной фракции.

Собранную биомассу после глубинного культивирования в биореакторах штамма S. gallinarum pullorum 24КСТ, ЛБ, 10-Б в "S''-форме возбудителя пуллороза-тифа ресуспендируют с помощью поверхностно-активного вещества и щелочи (1,2%-ный водный раствор Дезмола, взятого в конечной весовой концентрации 0,5% и 2%-ный водный раствор двууглекислого натрия, взятый в конечной весовой концентрации 0,2% или 0,3%-ный раствор NaOH, взятый в конечной весовой концентрации 0,015%) до концентрации 25 млрд. микробных клеток в 1 мл и экстрагируют в течение 80 мин при t 96°C. Экстракт освобождают от клеточного дейтрита центрифугированием на центрифуге OTP-101 К (16000 об/мин) и прогревают при t 96°C в течение 60 мин. Полученный экстракт фильтруют и используют для сенсибилизации эритроцитов барана.

Б. Сенсибилизация эритроцитов барана.

Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят экстрактом антигенного комплекса в присутствии натриевой соли сукцината хитозана, взятой в конечной весовой концентрации 1,5%. На 1 л 20% взвеси формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе pH 7,2 добавляют 300 мл экстракта антигена. Тщательно перемешивают и подогревают в водяной бане при t 56°C 30 мин. Затем взвесь эритроцитов выдерживают при t 40°C 2 ч или при комнатной температуре 12 ч. Бутыли оставляют для осаждения методом отстоя. По мере оседания эритроцитов сенсибилизирующий раствор сливают, а к осадку доливают равный объем буфера с 0,15% формальдегида. Операцию повторяют 3-4 раза до полного осветления надосадочной жидкости.

Отмытые сенсибилизированные эритроциты фильтруют через бязево-марлевую салфетку, ресуспендируют в стерильном фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,2% формальдегида, до 10% концентрации и выдерживают при t 37°C 24 ч. Далее производится расфасовка в 20 мл флаконы, получая состав 2 эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Пример 3. Эффективность эритроцитарного диагностикума (полученного согласно примерам 1-2 и прототипа) для диагностики пуллороза-тифа птиц определяют на курах. 60 цыплят в возрасте от 50 дней заражают возбудителем пуллороза-тифа в дозе 0,03 мл штаммом S. gallinarum pullorum 24КСТ, ЛБ, 10-Б в "S''-форме возбудителя и делят на три группы по 20 цыплят в каждой группы. Через 10 дней диагностику пуллороза-тифа определяют в кровекапельной реакции непрямой гемаплютинации (ККРНГА) на предметном стекле путем выявления антигена пуллороза-тифа. Кровь для ККРНГА берут у птиц из гребня или подкрыльцовой вены. Каплю крови наносят на сухое, обезжиренное предметное стекло и добавляют к ней каплю эритроцитарного диагностикума (полученного согласно примерам 1-2 и прототипа). Соотношение состава 1 или 2 или прототипа и крови должно быть 1:1. Кровь цыплят каждой группы смешивают с составом 1, 2 и прототипа (кровь группы 1 смешивают с составом 1, кровь группы 2 смешивают с составом 2, кровь группы 3 смешивают с составом, полученным согласно способу-прототипу). Предметное стекло покачивают на грелке-качалке при температуре от 37° до 40°C. Температура в помещении, где ставят реакцию, должна быть не ниже 18°C. На одном предметном стекле ставят одновременно не более трех реакций. Учет результатов реакции проводят визуально. Реакцию на эритроцитарный антиген считают положительной, если в течение 2 минут в смеси крови с антигеном выпали хорошо заметные хлопья коричневого цвета с просветлением жидкости Реакцию считают сомнительной, если в течение 2 минут в смеси крови с антигеном появились слабовыраженные мелкозернистые хлопья коричневого цвета; Отрицательная реакция характеризуется образованием в капле крови с антигеном равномерной стабильной гомогенной взвеси эритроцитов барана.

В группах 1 и 2 цыплят у всех цыплят реакция на эритроцитарный антиген была положительной. В группе 3 цыплят реакция на эритроцитарный антиген была положительной у 12 цыплят, у 5 цыплят реакция на эритроцитарный антиген была сомнительной, а у 3 цыплят реакция на эритроцитарный антиген была отрицательной.

Таким образом, чувствительность целевого продукта повысилась на 40%.

Кроме того, пуллорный эритроцитарный диагностикум, приготовленный предлагаемым способом, сохраняет свою активность и специфичность в течение 3-х лет при 4-8°C. При таком способе получают из бактериальной массы S.gallinarum-pullorum O-антиген, обладающий максимально возможной сенсибилизирующей, антителосвязывающей, агглютинирующей активностью, комплементарностью и способностью вступать в прочную химическую связь с рецепторами эритроцитов, который по своей диагностической ценности в кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации превосходит известный пуллорный эритроцитарный диагностикум.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии. В качестве ПАВ используется 0,8-1,2%-ный водный раствор Дезмола, взятый в конечной весовой концентрации 0,1-0,5%. Сенсебилизацию формалинизированных эритроцитов проводят в присутствии натриевой соли сукцината хитозана, взятой в конечной весовой концентрации 0,5-1,5%. Изобретение обеспечивает получение эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц с повышенной чувствительностью. 3 пр.

Способ изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц, включающий получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции обработкой бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°С с последующей сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества для выделения антигенной фракции используют 0,8-1,2%-ный водный раствор Дезмола, взятого в конечной весовой концентрации 0,1-0,5%, а сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят в присутствии натриевой соли сукцината хитозана, взятой в конечной весовой концентрации 0,5-1,5%.