Способ получения антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц Советский патент 1978 года по МПК C12K1/00 A61K39/02 

глютининов. Другие виды шфкулируюших антател, вступая в реакцию с бактериально клеткой, не вызывают образование макроскопически видимого комплекса антиген-ант тел ( агглютината), Цель изобретения - разработка способа поцучения пуллорного антигена, который позволяет получать высокочувствительный, специфичный и стабильный диагностикум, пригодный для исследования пт1щ в полевых условиях в любом возрасте. Это достигается благодаря тому, что из полученной бактериальной массы выделяют полисахаридно-полипелтидную фракцию и се сибилизируют ею формалинизированные эритроциты барана. Фоомалинизацию эритроцитов барана про BfiasT О,3%плым раствором формальдегида в течение 14 ч при . Сенсибилизацию эритроцитов проводят последовательно 45 мин при 80 С и 2 ч при . При таком способе получают наиболее активный и специфичный растворимый антиген - полисахаридно-попипептидную фракцию возбудителя пуллороза - тифа для сенсибилизации эритроцитов барана, который Вступает в макроскопически видимую реакцию не с одним видом антител (например, агглютининами, в частности с цельноклеточ ным цветным пуллорным антигеном, а, со всеми циркулирующими антителами, суммарный титр которых в крови .больных птиц значительно выше титра агглютининов (например в 16 раз) и не реагирует с вйдонеспедифическими; антителами (например с антителами E.coEi). Консервация эритроцитов в 0,3%-ном растворе формальдегида в отличие от более высоких концентраций (например 1,5-3%), надежно консервируя эритроциты, не измешет их способность сорбировать попнсахаридно-полнпептидную фракцию, а сенс1гбнли- зация формалинизированных эритроцитов при 80 С обеспечивает прочную связь антиге}ш с рецепторами эритроцитов и высокую, сте пень их насыщения антигеном. Приме р. Получение 500ОО доз антигена для прижизненной диагностики пуллороаа - тифа птиц. А. Получение полисахаридно-полипептидной фракции возбудителя .пуллороза -тифа. Бактериальную массу S.jjuEfDPum-j aeGna j«um, выращенную на питательных средах, осаждают центрифугированием при 5000 об/мин н дважды отмывают фнзиологическим раствором при том же режиме центрифугирования. Осадок отмытой бактериальной массь суспендируют в ОД и. растворе ледяной уксусной кислоты до кон- «ентрации 45 млрд.микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности и экстршируют при , С в течение 60 мин. Гидролизат освобождают от бактегриальных клеток центрифугированием при 6000 об/мин в течение 45 мин, диализируют против водопроводзюй воды до рН 5,0-5,5. Полисахаридно-полипептидную фракцию осаждают из гидролизата 8-10 объемами этанола, отделяют центрифугированием при 40ОО oD/мин в течение 20 ман и растворяют в дистиллированной воде (рН 8,5-9,0) из расчета 10 г сухого вещества на 1 л воды. Содержание общего, остаточного и белкового азота в растворе полисахаридно-полипептидной фракции определяют по Кьельдалю, .а редуцирующих Сахаров - по Хагедорну-Иенсену. Количество указанных иш редиентов в 1%-ном водном растворе полисахаришю- полипептишюй фракции должно быть, мг%: Редуцирующих Сахаров в пересчете на глюкозуЗОО-315 Общего азота75-80 Остаточного азота55-6О Белкового азота2О-25 Б. Формалинизацяя эритроцитов барана. 1, п крови барана в равном объеме раствора Олсевера центрифугируют пря 2ООО об/мин в течение 10 wtm, осадок эритроцитов трижды отмывают фосфатно-буферным раствором (pii 7,О-7,2) при том же режиме центрифугирования и суспендируют в буферном растворе, содержащем 0,3% формальдегида. Взвесь эритроцитов выдерживают при 40°С в течение 14 ч при постоянном помешивании магнитной меЩалкой 90 об/мин. ФopмaJrи шзиpoвaнныe эритроциты осаждают центрифугированием при 200О об/мин в течение 10 мин и 5 раз отмывают 10 объемам, буфер.чого раствора. В. Сенс .гбилкаацня формалинизированных эритроцитов барана тлисахаридно-полипаптидной фракцией возбудителя пуллороза тифа. На 1 л 10%--ной взвеси формалинизированны: эритроцитов на фосфатяо-буферном растворе (рН 7,О-7,2) добавляют 250-ЗОО мл 1%-ного водного раствора полисахарисно- полипептидной фракции возбудителя пул- лороза - тифа, тщательно перемешивают и подогревают в водяной бане при 80 С в т&чение 45 мин, а затем переносят в термо:стат на 2 ч при 40.С.. %1итроциты освобождают от раствора пописахаридно-полипептидной фракции центрифугированием при 2000 об/мин в . течение Ю мин. Осадок Э1эитропитов трехкратно отмывают 1О объемами раствора буфера при том же режиме центрифугирования.

Осадок сенсибилизированных и отмытых эритроцитов суспендируют в буферном растворе до 1О%-ной концентрации добавляют- мертиолат 1:10000.

Пулпорный антиген, приготовленный предлагае.хим способом, сохра}шет активность и специфичность в течение года при

4-а

Результаты опытов свидетельствуют о том, что пуллорный антиген, подученный предлагаемым способом, по чувствительности превосходит известный антиген в пробирочной реакции в 15-ЗО раз, а в условиях птицефабрик выявляет в 3-6 раз больше больной птицы и не вступает в реакцию с видонеспецифическими антителами.

Высокая чувствительность и специфичность полученного антигена позволяет проводить исследование птиц на пуллороз - тиф в любом возрасте, начиная с ЗО-дневного, что очень важно в современном промышленном птицеводстве;в 2-3 раза сократить сроки оздоровления хозяйств от пулпороза-тифа; увеличить сохранлость цыплят до 30 дневного возраста на 1-2% и резко снизить затраты на лекарственные препараты, применяемые с лечебно-профилактической целью при выращивании птицы.

Методика исследования- птиц не меняется по cpaBHeHtno с используемой для известного антигена.

Формула изобретения 1, Способ получения антигена для диагностики пуллороза - тифа птиц, включающий

Ь

получение бактериальной массы возбудителя пуллороза - тифа, отличающийс я тем, что, с целью повыш.ен чувствительности и спецнфичлости антигена, из nqлученной бактериальной массы выделяют полисахаридно-полчпептндлую фракцию и сенсибилизируют ею формалилнзированные эритроциты барака.

2.Способ по л. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что формалиннзацию эритроцитов

проводят 0,3%-11ым раствором формальдегида в течение 14 ч. при ,

3.Способ по пп, 1 и 2, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов барана проводят последовательно при 80 С в течение 45 мин и при в течение 2 ч.

4.Способ по п. 1, о т л VI ч а ю щ и йс я тем, что пописахаридно-полипептид1ую

фракцию выделяют путем гидролиза бактериальной массы 0,1 н. раствором уксусной кислоты при 9О-92 С в течение 60 мин с последующим осаждением ее из гидролизата 8-10 объемами этанола.

25

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, М., Медицина, 1966, с. 124-128, 550-554.

2.Коваленко Я. Р. Применение биологических и химиотерапевтических препаратов

в ветеринарии, М., СельхоЗиздат, 1951, с. 63.