Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики гепатита С.
Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит Д, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение вирусом гепатита с, как правило, осуществляется при переливании крови. Вирус гепатита С при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В. Однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени. Поэтому для проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять людей, инфицированных вирусом гепатита С.
Многочисленные исследования вируса гепатита С позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. Вирус гепатита С имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов, и содержит единственную открытую рамку считывания, которая перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010 3011 аминокислотных остатков, являющийся предшественником индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков. К структурным белкам вируса гепатита С относятся Cor (ядерный)-антиген (молекулярная масса 19 кДа) и два гликопротеина с молекулярными массами 32 кДа и 72 кДа. Все они процессируются с N-концевого участка вирусспецифического полипротеина. Cor-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид вируса гепатита С. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона вируса гепатита С, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком вируса гепатита С (NS1). Белок NS2 вируса гепатита С размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 размером 60 кДа обладает нуклеотид трифосфатсвязывающей геликазной активностью и участвует в репликации генома вируса гепатита С. Кроме того, он обладает ферментативной активностью сериновой протеазы и участвует в процессировании неструктурных белков. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, белок NS4 гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью и участвует в репликации вирусного генома.
Большинство методов диагностики инфицированности вирусом гепатита С основано на определении антител к белкам вируса гепатита С в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита С, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты вируса гепатита С, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов вируса гепатита С, и в частности, белка NS3 вируса гепатита С (патенты ЕР NO 445423 A2, G 01 N 33/576, 1990; EP NO 419182 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 388232 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 406511 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 416 725 A2, C 12 N 15/51, 1990 и др.).
В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕР NO 388232), так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант (ЕР NO 445423) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов вируса гепатита С (ЕР NO 377303 A1, C 12 N 15/51, 1989).
Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный, искусственно созданный полипептид, состоящий из продукта экспрессии фрагмента генома вируса гепатита С, слитого с бета-галактозидазой E. coli, связывающий антитела к продукту гена белка NS3 вируса гепатита С, фрагмент ДНК НС250, штамм E.coli НС250 ВКПМ N В-6596, трансформированный рекомбинантной плазмидой рНС250, содержащей фрагмент ДНК НС250.
Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37oС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30 32oС, колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре 4 37oC при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитридов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при 30 32oС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при 39 42oС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1х10 кл/мл. Белок стабилен при температуре 4oС в течение 5 6 месяцев.
Полипептид выделенный и очищенный из штамма-продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена NS3 белка вируса гепатита С в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N В-6596.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Получение фрагмента ДНК НС250.
Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды:
cr1 5' GGGGATCCTGCCCCTCCGGGCACGCTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTAT 3'
cr2 5' GCACCCGGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTCTGCCCGTAGAGTCCTTGGAAACTAC 3'
cr3 5' TATGCGGTCTCCGGTCTTCACGGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTAC 3'
cr4 5' CGCAGACATTTCAAGTGGCCCACCTACACGCTCCCACTGGCAGC 3'
cr5 5' GGCAAGAGTACTAAAAGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGCTGCAGGG 3'
rc1 5' ATGCCCACAGCGTGCCCGGAGGGGCAGGATCCCC 3'
rc2 5' - CCGTGAAGACCGGAAGACCGCATAGTAGTTTCCAAGGACTCTACGGGCAGAAAGTCCACCGCCTTCGCA- ACCCCCGGGYGCATACGGCAGCCCGGAAG 3'
rc3 5' TGGGCCACTTGAAATGTCTGCGGTACGGCCGGGGGGGATGAGTTGT 3'
rc4 5' - CCCTGCAGCTTGTACCCTTGGGCTGCATATGCAGCCGGCACTTTAGTACTCTTTGCCGCTGCCAGTGGG- AGCGTGTAGG 3'
Олигонуклеотиды cr 1, 2, 3, 4, 5 и rc 1, 2, 3, 4 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Для этого в эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмолей каждого из олигонуклеотидов, 50 мкл десятикратного буфера для киназы (0,5М трис HCl, рН 7,6, 0,1 М MgCl, 50 мМ дитиотреитол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмолей (150 мкКИ) [гамма-Р] АТФ (удельная активность 3000 Ки/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага Т4, бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 минут при 37 град.С. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98 град.С, охлаждают до 16 град.С и обрабатывают ДНК-лигазой. Для этого 100 мкл смеси обработанных киназой олигонуклеотидов смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66М трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), добавляют 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 4 град.С в течение 5 часов. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65 град. С в течение 15 минут для инактивирования фермента.
10 мкл раствора обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после авторадиографии виден фрагмент размером около 250 п.н.).
100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотреитол) в течение 5 часов при температуре 37 град. С. Ферменты инактивируют нагреванием при 70 град. С.
10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после авторадиографии виден фрагмент размером около 250 п.н.).
ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционным эндонуклеазами фрагмента ДНК смешивают с ДНК векторной плазмиды pUCl8, обработанной рестриктазами BamHI и PstI, обрабатывают ДНК-лигазой Т4 в течение 5 часов при 4 град. С. Полученный лигазной смесью трансформируют клетки E. coli штамма DH5 альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма HCNS3 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 256 п. н. что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК НС250.
Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определяется нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК НС250:
GGGGATCCTGCCCCTCCGGGCACGCTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTATGCACC
CGGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTCTGCCCGTAGAGTCCTTGGAAACTACTAT
GCGGTCTCCGGTCTTCACGGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTACCGCAGACATTTC
AAGTGGCCCACCTACACGCTCCCACTGGCAGCGGCAAGAGTACTAAAGTGCCGGCT
GCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGCTGCAGGG
Фрагмент ДНК, аналогичный НС250, был получен также путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc4.
Пример
2. Получение плазмид.
Синтезированный фрагмент ДНК НС250 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI, ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5A, обработанной рестриктазами PstI и BamHI.
Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PL T90. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2%-ным LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют, выделяют плазмидную ДНК, которую гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI.
Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма E.coli HC250 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и около 250 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС250. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что синтезированный фрагмент ДНК в плазмиде рНС250 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида рНС250 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности NS3 белка вируса гепатита С, слитые с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.
При мер 3.
Выделение полипептида.
Штамм E. coli, содержащий плазмиду рНС250, выращивают в 100 мл среды LB при 30 град. С до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 39oС и растят клетки еще в течение 2-х часов. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин, лизируют ультразвуком и выделяют белки по одному из известных методов.
Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли. В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 10 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PL T90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий полученную нами плазмиду рНС250. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E.coli, содержащий плазмиду рНС250, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 120 130 кД. Аминокислотная последовательность полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, кодирующего участок гена NS3, представлена ниже:
X- Gly Ser Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg
Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val - Asp
Phe Leu Pro Val Glu Ser Leu Glu Thr Thr Met Arg - Ser
Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val - Pro
Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr - Gly
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala - Ala
Gln Gly Tyr Lys, где X последовательность бета галактозидазы E. coli.
Контроль антигенной активности.
Контроль антигенной активности полипептида осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 часа. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15М Nacl, 20mM трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 час при 37 град. С обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к NS3 белку вируса гепатита С, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конюъгатом при 37 град. С в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20мг в 0,1М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полученный полипептид связывается с антителами к NS3 белку вируса гепатита С.
Таким образом, данное изобретение представляет собой полипептид, обладающий свойствами белка NS3 вируса гепатита С, взаимодействующий с антителами к белку NS3 вируса гепатита С, позволяющий определять антитела к вирусу гепатита С.
Использование: иммунобиотехнологическая диагностика вируса гепатита С человека. Сущность: получение фрагмента ДНК НС 250, определяющего синтез полипептида, который обладает свойствами белка NS3 вируса гепатита С человека. Полипептид получают с помощью штамма бактерий Escherichia coli, трансформированного плазмидой, содержащей фрагмент ДНК НС 250. Данный полипептид способен связывать антитела к продукту гена белка NS3 вируса гепатита С. 3 с.п.ф-лы.
и кодирующий рекомбинантный полипептид НС 250, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена белка NS 3 вируса гепатита С.
где X последовательность бета-галактозидазы Е. coli.
