СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/22 

Изобретение относится к области медицины, к химиотерапии вирусных инфекций.

В настоящее время серьезную проблему в ряде областей медицины представляет цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция, т.к. она развивается на фоне приобретенного иммунодефицита, возникающего в результате химиотерапевтического и лучевого лечения опухолей, иммунносупрессивного воздействия при трансплантации органов или в результате ряда других вирусных инфекций (в том числе и при СПИДе). Очень часто, именно ЦМВ-инфекция является причиной летального исхода при выше перечисленных примерах, также при ранней детской смертности.

Единственным известным средством борьбы с этой инфекцией является препарат ганцикловир (гуанин, ингибирующий синтез инфекционной ДНК-вируса).

Однако отрицательным свойством ганцикловира является наличие невосприимчивых к нему вариантов вирусов, а также быстрое возникновение в организме резистентных штаммов, что сразу снижает или ликвидирует эффективность лечения.

Перед нами стояла задача изыскания новых антивирусных препаратов, влияющих на репродукцию ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

Поставленная задача нами решена применением в качестве средства, обладающего антивирусной активностью, галогенида четвертичной аммониевой соли диметиламиноэтил -β-(4-гидрокси-3,5-ди-трет. бутилфенил)-пропионата (ИХФАН-10) общей формулы

где .

Данная структура синтезируется согласно схеме: N,N-диметиламиноэтил-β-(4-гидрокси-3,5 -ди-трет. бутилфенил)-пропионат получают путем переэтерификации метил-b-(4-гидрокси-3,5-ди-трет. бутилфенил)-пропионата N,N-диметиламиноэтанолом в условиях щелочного катализа при 130-140^oC в токе аргона при удалении из сферы реакции образующегося метанола. При взаимодействии полученного пропионата в среде ацетона, бензола или эфира с галоидводородом или алкилгалогенидом образуется галоидгидрит или четвертичная аммониевая соль указанного пропионата.

Структура соли подтверждена данными элементарного анализа, ИК- и ПМР-спектроскопии.

Пример 1. В 11 мл (0,11 М) диметиламиноэтанола растворяют 0,23 г (0,01 М) натрия. К полученному раствору добавляют 29,1 г (0,1 М) метил-b -(4-гидрокси-3,5-ди-трет. бутилфенил)-пропионата. Смесь нагревают при 130-140^oC в слабом токе аргона с отгонкой образующегося метанола в течение 3-4 часов. Смесь охлаждают, растворяют в 100 мл эфира, эфирный раствор дважды промывают водой (2х200 мл), сушат, упаривают в вакууме. Остаток растворяют при нагревании в 100 мл гексана и оставляют на ночь в морозильнике. Выпавшие кристаллы отделяют, промывают 30 мл холодного гексана, сушат. Получено 19,5 г слегка кремовых кристаллов. Из гексанового маточника кислой экстракцией с последующим подщелачиванием водной фазы 5%-ным NH₄OH дополнительно получают 7,8 г аналогичных кристаллов.

Общий выход 27,3 г (78% от теории) N,N-диметиламиноэтил-b-(4-гидрокси-3,5-ди -трет.бутилфенил)-пропионата, т.пл. 69-70^oC.

Найдено С 72,36, Н 9,94, N 4,10, C₂₁H₃₅O₃N.

Вычислено C 72,16, H 10,09, N 4,01.

ИК-спектр (KBr): n_он 3640, ν_co 1649 см^-1. ПМР-спектр (CDCl₃,δ, м.д.): C(CH₃)₃ 1,42, CHδ2

Пример 2. К раствору 3,5 г (0,01 М) пропионата в 20 мл бензола добавляют 1 мл (0,015 М) иодистого метила. Смесь выдерживают 2 часа при 20-25^oC, выпавшие кристаллы отделяют, промывают гексаном, сушат, кристаллизуют из воды.

Получено 4,6 г (ИХФАН-10) (98% от теории) пластинчатых кристаллов с т. пл. 169-170^oC.

Найдено С 53,76, Н 7,45, N 2,73, J 25,40, C₂₂H₃₈O₃NJ.

Вычислено% C 53,76, H 7,79, N 2,85, J 25,82.

ПМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): C(CH₃)₃ 1,42, CH₂OH 2,67, CH₂COO 2,85 (J 8,2 Гц), (CH₃)₂N 3,49, COOCH₂ 4,09, CH₂N 4,58, OH 5,07, H_м 6,95.

Таким образом ИХФАН-10 был использован нами в качестве средства, обладающего антивирусной активностью, в качестве же модельных вирусов использован ДНК-содержащий цитомегаловирус, а в качестве РНК-содержащих - вирус везикулярного стоматита.

Оценку действия препарата проводили в культуре диплоидных клеток эмбриона человека М-19, зарегистрированных в Международной коллекции культур ВОЗ. Для этого клетки рассевали в пеницилиновые флаконы и культивировали в течение 3 суток при 37^oC, после чего ко всем клеткам добавляли испытуемые вирусы, производили абсорбацию, а затем добавляли к разным флаконам различные концентрации ИХФАН-10. Клетки далее культивировали при 37^oC в течение 2-3 суток, после чего замораживали при температуре -20^oC, оттаивали и в жидкости определяли инфекционный титр вируса, титруя их также на диплоидных клетках М-19. Контролем служила зараженная культура без добавления препарата.

Пример 3. Исследование влияния различных доз на репродукцию цитомегаловируса в диплоидных клетках человека, зараженных разной множественностью инфекции.

3-суточную культуру диплоидных клеток человека заражали множественностью инфекции (0,01 ТЦПД/клетку или 1 ТЦПД/кл.) и вносили разные концентрации ИХФАН-10. Через 48 часов культивирования определяли титр ЦМВ (см. таблицу 1).

Полученные данные свидетельствуют о том, что ИХФАН-10 обладает ингибирующей репродукцию ЦМВ активностью, причем эта активность зависит как от дозы взятого препарата, так и количества введенного вируса. При высокой множественности (1 ТЦПД 50/кл. ) эффективной концентрацией препарата является 50 мкг/мл и 100 мкг/мл, ингибирующие репродукцию на 4 и 6 логарифмов соответственно (т. е. ингибирует более 99,99% вируса). При низкой множественности инфекции (0,01 ТЦПД 50/кл. ) эффективной оказывается и концентрация 20 мкг/мл, при которой ингибируется более 99% вируса.

Аналогичные результаты были получены и с другой серией препарата.

Пример 4. Исследование влияния различных доз препарата на репродукцию вируса везикулярного стоматита.

Действие препарата изучали по 2 тестам: одноцикловой и многоцикловой репродукций.

Одноцикловая репродукция на диплоидные клетки человека М-19 наносили вирус с высокой множительностью инфекции (10 ТЦПД 50/кл.), затем проводили адсорбцию (1 час при 37^oC) и трехкратную отмывку неадсорбированного вируса, после чего клетки заливали средой поддерживания, содержащей препарат. После 8 часов культивирования собирали вируссодержащую жидкость и титровали на клетках М-19.

Многоцикловая репродукция на клетки М-19 наносили вирус с низкой множественностью инфекции (0,01 ТЦПД 50/кл.) в среде, содержащей препарат, и инкубировали клетки в течение 3 суток, после чего в жидкости титровали вирус в культуре М-19. Учет цитопатического титра проводили на 3 сутки (таблица 2).

Полученные данные свидетельствуют, что ИХФАН-10 тормозит репродукцию ВВС как при заражении клеток высокой множественностью инфекции (один цикл репродукции), так и при заражении низкой множественностью (многоцикловая репродукция). При этом титр вновь образованного вируса и в том и в другом случае снижается на 99,9% или более. При изучении 2-х других серий препарата были получены идентичные результаты.

В результате проведенных экспериментов было показано, что ИХФАН-10 обладает антивирусной активностью в отношении цитомегаловируса и вируса везикулярного стоматита, которая проявлялась как при высокой, так и при низкой множественности инфекций. Индекс эффективности при оптимальных дозах превышал 99,9% вновь синтезированных вирусов.

Изобретение относится к области медицины, к химиотерапии вирусных инфекций. В качестве средства, обладающего антивирусной активностью, применен галогенид четвертичной аммониевой соли диметиламиноэтил пропионата (ИХФАН-10). 2 табл.

Средство, обладающее антивирусной активностью, отличающееся тем, что представляет собой галогенид четвертичной аммониевой соли диметиламиноэтил-β-(4-гидрокси-3,5-ди-трет. бутилфенил) пропионат общей формулы


X Br, J.