ШТАММ БАКТЕРИЙ AZOTOBACTER VINELANDII (LIPMAN) - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12N1/20 C12R1/65 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий экзополисахарид, который может быть использован в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp ВКПМ В-3243, являющийся продуцентом экзополисахарида [1] Добиться улучшенных реологических свойств целевого продукта возможно только при использовании дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна для получения экзополисахарида культуральная жидкость Basillus polymyxa ВКПМ В-3015 [2] Экзополисахарид, полученный с ее помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известна смешанная культура микроорганизмов, включающая штамм дрожжей Candida tropicalis ЦМПМ У-507 и штамм Acinetobacter Species ЦМПМ В-3243, которые в соотношении 1:3-1:9 образуют консорциум, способный продуцировать до 9,1 г/л экзополисахарида (ЭПС) [3] Недостатком указанного консорциума является сложность и трудоемкость его культивирования.

Целью изобретения является получение нового штамма, продуцирующего экзополисахарид с заданными физико-химическими свойствами, а именно, высокой вязкостью разбавленных растворов ЭПС при низких скоростях сдвига, что необходимо для их использования при вытеснении нефти из истощенных скважин. Процесс получения ЭПС технологичен, не требует дополнительного выделения образовавшегося ЭПС. Предложенный штамм способен продуцировать до 16 г/л экзополисахарида.

Штамм Azotobacter vinelanlii (Lipman) выделен из почвы методом почвенных пластинок из нейтральной пахатной почвы АБС МГУ "Чашково". Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИгенетики", наименование штамма ФЧ-1, присвоенный номер при депонировании ВКПМ В-5933.

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933, продуцирующий ЭПС, характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамотрицательные (35-суточная субкультура часто грамположительная) крупные (2-3х0,8-1,0 мм) овальной формы клетки, расположенные в мазках парами или неправильными группами. Культура полиморфна. Большей частью палочковидные клетки с тупыми концами, в стационарной фазе роста-овалообразные, редко-кокковидной формы, с хорошо выраженной капсулой. Эндоспор не образует. Клетки заключены в мощную слизистую капсулу, выявляемую негативным окрашиванием нигрозином. Начиная с первых суток роста, на твердых питательных средах в культуре наблюдаются крупные (до 8-10 мм) инцистированные клетки с плотной оболочкой, к седьмым суткам роста их количество достигает 10-15% в поле зрения. В старых культурах (5-7 сут) встречаются клетки с почковидными выростами. Цитоплазма однородна, с небольшим количеством зернистых включений. Цисты неустойчивы к нагреванию свыше 80-100 град. При выращивании в бульоне Хоттингера (до 3 сут) рост слабый.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах: МПА, агаризованном сусле, средах Эшби, Виноградского, Федорова. При росте на МПА колонии на вторые сутки мелкие округлые 0,3-1,5 мм в диаметре, края ровные. Колонии приподнятые, гладкие, маслянисто-блестящие, плотно врастающие в агар, слизистые, тянущиеся за петлей, бесцветные, полупрозрачные. При росте на сусло-агаре колонии на вторые сутки мелкие, 0,5-1 мм в диаметре, с зернистой поверхностью, с восковидным блеском. Позже (4-6 сут) поверхность гладкая, блеск маслянистый. Колонии выпуклые, иногда почти полусферические, бесцветные или желтоватые, просвечивающие.

При росте на среде Эшби колонии на вторые сутки очень маленькие 0,1-0,4 мм в диаметре, позже (4-6 сут) 0,5-3,0 мм, приподнятые, округлые, края ровные, гладкие, маслянисто-блестящие, беловатые, полупрозрачные, сильно ослизненные.

Желатину не разжижает. Культура не лизогенна, после хранения на плотных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено.

При выращивании на плотных средах на 4-7 сутки обнаружен сплошной рост по штриху в виде выпуклых слизистых образований с флуоресцирующим зеленым пигментом. Зону флуоресценции вокруг участков роста выявляли УФ-облучением (длина волны 260 нм) через 48-72 ч при выращивании бактерий на чашках Петри с агаризованной средой Эшби.

При инкубации в МПБ в течение 24-48 ч без встряхивания отмечалось умеренное помутнение среды без формирования пленки на поверхности. При встряхивании на качалке (180-220 об/мин) помутнение по всему объему. Оптимум роста 28-30 град), рН 6,8-7,2.

Активность штамма определяют методом спиртового осаждения и гравиметрией.

Составы среды для размножения штамма следующие.

Первый состав, г/л: глюкоза 15,0; К₂НРО₄ 1,0; МgS0₄•7H₂O 0,5; FeSO₄•7H₂O 0,0005; Na₂MoO₄•2H₂O 0,005.

Второй состав, г/л: маннит 10,0; КНРО₄ 0,2; NaCl 0,2; МgSO₄•7H₂O 0,2; СаSO₄ 0,1; СаСО₃ 5,0; агар 20,0.

Третий состав, г/л: глюкоза 20; К₂НРО₄ 1,0; КН₂РО₄ 1,4; FeCl₂•6H₂O 0,1; MgSO₄•7H₂O 0,5; Na₂MoO₄•2H₂O 0,01; БВК 2,0.

Культивирование не указанных средах осуществляется при 28-30 град в течение 2-2,5 сут при рН 6,8-7,2.

В табл. 1 приведены физиолого-биохимические признаки штамма.

Для улучшения роста культуры и синтеза ЭПС в состав сред вносится азот в виде аммонийных солей и органический азот в виде белково-витаминного концентрата (БВК). БВК является дополнительным фактором роста для синтеза экзополисахаридного комплекса.

Оптимальный температурный интервал для роста культуры 28-30 град, оптимальное значение рН для роста культуры Azoto- bacter vinelandii (Lipman) 6,8-7,0, для синтеза ЭПС 6,8-7,2.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: сусло-агар, среда Эшби (маннит, глюкоза), при 4 град. Пересевы 1 раз в месяц.

Проведенные исследования по оценке токсичности и опасности показали, что указанный штамм относится к непатогенным микроорганизмам: средневирулентная доза для мышей и крыс при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении составляет более 10⁹ клеток на животное. Микроорганизм не обладает токсичными свойствами, не проникает через естественные барьеры желудочно-кишечного тракта. не диссимилирует во внутренние органы. Живая культура микроорганизма не обладает раздражающим действием на слизистую оболочку глаза.

Физико-химические свойства полученного с помощью заявляемого штамма экзополисахарида.

В состав суммы экзополисахарида входят нейтральные моносахариды, глюкоза, манноза, ксилоза, галактоза (следы), уроновые кислоты. Определение осуществляли методом жидкостной хроматографии. Регистрацию разделенных зон (пиков) осуществляли с помощью УФ-детектора. Используемый хроматограф "Милихром-18".

Полученный экзополисахарид осаждают этанолом, ацетоном. На вязкость раствора экзополисахарида рН в интервале 2-11 не влияет. ЭПС термоустойчив до 150 град, характеризуется биологической стабильностью, устойчив к воздействию микроорганизмов. За счет наличия в составе уроновых кислот ЭПС проявляет ярко выраженные свойства полиэлектролитов и имеет повышенную способность к гелеобразованию. Сильно разбавленные растворы ЭПС (0,05%-ный раствор) обладают большой вязкостью при малых скоростях сдвига (см.табл.3). Вязкость определялась на ротационном вискозиметре типа "Брукфильд".

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Бактерия Azotobacter vinelandii (Lipman) при росте на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30 град в течение 48 ч продуцирует 25 г ЭПС, превращая культуральную жидкость в гель. Культивирование штамма осуществляют на жидкой минеральной среде следующего состава, мас. К₂НРО₄ 1,0; MgSO₄•7H₂O 0,5; FeSO₄•7H₂O 0,0005; Na₂MoO₄2H₂O 0,005; вода остальное.

В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5% или этанол в количестве 1,5 об.

При культивировании на жидкой минеральной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста-ферментализат БВК в количестве 0,2% Выращивание осуществляют при 28-30 град в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 мм³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 ч на качалках (n 220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Azotobacter vinelandii (Lipman) 6,8-7,0 и для синтеза ЭПС 6,8-7,2.

Исследовали процесс синтеза ЭПС заявляемым штаммом в интервале температур 25-35 град. Для достижения необходимого значения рН приводили подтитровку 10% -ным раствором NaOH. Культивирование осуществляли в условиях согласно примеру 1. Концентрация этанола 2 об.

Данные эксперимента приведены в табл.1.

Таким образом, снижение рН ниже оптимального уровня (6,8-7,2) и повышение его значения выше оптимального приводит к уменьшению концентрации ЭПС. Оптимальное значение температуры для получения максимального выхода ЭПС - 28-30 град. Изменение температуры до значений, выходящих за указанные пределы влечет за собой снижение количества синтезируемого ЭПС.

Пример 2. Периодическое культивирование штамма Azotobacter vinelandii (Lipman) осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10 л, рабочий объем 4 л. Используют среду из примера 1. В качестве источника углеродного питания применяют этанол в количество 1 об. В качестве инокулята используют штамм, полученный по примеру 1, в колбе на качалке. Количество инокулята 20%
Условия проведения процесса: температура 28-30 град, рН 6,8-7,2, подача воздуха 0,5 л/л среды в 1 мин, скорость перемешивания 300 об/мин, время культивирования 18-20 ч.

Результаты исследования представлены в табл.2.

Процесс идет стабильно, ассоциация устойчиво сохраняет свойство синтезировать ЭПС в пяти последовательных ферментациях.

Данные по измерению вязкости раствора с концентрацией ЭПС 0,05% при малых скоростях сдвига приведены в табл. 3. Для сравнения взят экзополисахарид, синтезируемый консорциумом дрожжей Candida tropisalis ЦМПМУ-507 и бактерий Acinetobacter species ЦМПМ В-3243.

Как видно из табл.3, вязкость раствора ЭПС, синтезируемого заявляемым штаммом, значительно превышает вязкость раствора аналога.

Экзополисахарид, синтезируемый штаммом Azotobacter vine- landii (Lipman), использовали при вытеснении нефти из истощенных скважин при минимальных нормах расхода полимера и максимальной эффективности извлечения нефти, что было подтверждено в реальных условиях на нефтяных промыслах.

Экзополисахарид, синтезируемый заявляемым штаммом, использовался при проведении изоляционных работ (ограничение водопритока) в НГДУ (Кинельнефть). Обработано 6 добывающих скважин Сосновского месторождения, средний прирост добычи нефти на одну скважину составил 5 т/сут.

На Талинском месторождении (Кондпетролеум) обработано 9 нагнетательных скважин с целью повышения нефтеотдачи пластов. После обработки обводненность продукции добывающих скважин опытного участка уменьшилась с 71 до 23,5% а дебит по нефти увеличился в 1,8 раза.

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей высоковязкий экзополисахарид, который может быть использован в нефтедобывающей промышленности. Сущность изобретения: новый штамм Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933, который продуцирует при 28-30^oС, рН 6,8-7,2 в условиях аэрации и перемешивания до 10 г/л экзополисахарида, имеющего высокие физико-механические и химические характеристики. 4 табл.

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКМ В-5933 процудент экзополисахарида.