ШТАММ Rhodobacter antonii-ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей вязкий экзополисахарид, который может быть использован в различных отраслях промышленности, например в нефтедобывающей.

Известен штамм Acinetobacter sp. ВКПМ В-3243, являющийся продуцентом экзополисахарида (авт. свид. СССР 1579059). Добиться улучшенных реологических свойств целевого продукта возможно только при использовании дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна также для получения экзополисахарида культуральная жидкость Basillus polymyxa ВКПМ В-3015 (авт.свид. СССР 1698293). Экзополисахарид, полученный с ее помощью имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известна смешенная культура микроорганизмов, включающая штамм дрожжей Candida tropicalis ЦМПМ У-507 и штамм Acinetobacter Species ЦМПМ В-3243, которые в соотношении 1:3-1:9 образуют консорциум, способный продуцировать до 9,1 г/л экзополисахарида (ЭПС) (авт.свид. СССР 1311256). Недостатком указанного консорциума является сложность и трудоемкость его культивирования.

Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933, являющийся продуцентом экзополисахарида (пат. РФ 2073712). Несмотря на то, что данный штамм может продуцировать до 10 г/л экзополисахарида основным его недостатком является сложность его получения в промышленном масштабе.

Целью данного изобретения является получение нового штамма, продуцирующего экзополисахарид с заданными физико-химическими свойствами, а именно высокой вязкостью разбавленных растворов ЭПС при низких скоростях сдвига, что необходимо для их использования при нефтедобыче.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Rhodobacter antonii (справка о депонировании прилагается).

Штамм выделен методом почвенных пластинок из почвы. Штамм депонирован в ВКПМ ГосНИИгенетика, наименование штамма КР, присвоенный номер ВКПМВ-8156.

Штамм Rhodobacter antonii ВКПМ В-8156, продуцирующий экзополисахарид, характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культура представляет собой подвижные грамотрицательные, овальной формы клетки, расположенные в мазках парами или неправильными группами, диаметр клеток 1,5-2х0,5-0,8 мкм, размножаются путем бинарного деления. Культура полиморфна. Большей частью овалообразные с тупыми концами, в репликативной фазе роста расположены парами или цепочками, в стационарной фазе роста - кокковидной формы с хорошо выраженной капсулой. Эндоспор не образуют. Клетки заключены в мощную слизистую капсулу, выявленную негативным окрашиванием никрозином, образуют слизь. Цитоплазма однородна с небольшим количеством зернистых включений. Цисты неустойчивы к нагреванию свыше 80-100^oС. При выращивании в бульоне Хоттингера (до трех суток) рост слабый.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах: МПА, агаризованном сусле, средах Виноградского, Федорова. При росте на МПА колонии на вторые сутки мелкие округлые 0,3-1,5 мм в диаметре, край ровный. Колонии приподнятые, гладкие, маслянисто-блестящие, плотноврастающие в агар, слизистые, тянущиеся за петлей, бесцветные, полупрозрачные. При росте на сусло-агаре колонии на вторые сутки мелкие 0,3-1,0 мм в диаметре, с зернистой поверхностью, восковидным блеском, на 4-6 сутки - поверхность гладкая, блеск маслянистый. Колонии выпуклые иногда почти полусферические, бесцветные или желтоватые, просвечивающие.

Желатину не разжижает. Культура не лизогенна, после хранения на плотных средах в течение 3-6 месяцев негативных пятен не обнаруживалось.

При инкубации в МПА в течение 24 часов без встряхивания отмечалось умеренное помутнение среды без формирования пленки на поверхности. Оптимум роста 26-35^oС, рН 6,0-7,5.

Активность (продуктивность) штамма (с указанием условий культивирования), а также другие производственные показатели: 10-20 г/л суммы экзополисахаридов, при культивировании штамма в течение 24-48 часов в жидкой питательной среде с источниками углерода, амонийного азота, витаминов при температуре 27-29^oС, при постоянном перемешивании (220-350 об/мин).

Способ определения активности штамма с указанием метода: активность определяется методом спиртового осаждения с последующей гравиметрией.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: штамм хранится на агаризованных питательных средах при температуре 4-6^oС с пересевами 1 раз в 3 месяца или в лиофильновысушенном виде в стеклянных запаянных ампулах не более 5-и лет.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма: размножение культуры осуществляется путем пересевов на агаризованой среде МПА с 1% глюкозы.

Условия и состав среды для ферментации: на жидкой питательной среде, продолжительность культивирования 24-36 часов при температуре 27-30^oС.

Жидкая питательная среда, г/л:
Глюкоза - 20,0
К₂НРO₄ - 3,5
MgSO₄•7H₂О - 0,8
FeSO₄•7H₂O - 0,05
NH₄NO₃ - 1,2
NaCl - 1,0
Витаминный комплекс (РР, Н, В₃, В₆) - 0,005
Вода водопроводная, мл - До 1000
Генетические особенности штамма: нуждается для роста в витаминах, фаголизис не обнаружен.

В приложении приведены физиолого-биохимические признаки штамма.

Физико-химические свойства полученного с помощью заявленного штамма экзополисахарида.

В состав суммы экзополисахарида входят нейтральные моносахариды, глюкоза, манноза, ксилоза, галактоза (следы), уроновые кислоты. Определение осуществляли методом жидкостной хроматографии. Регистрацию разделенных зон (пиков) осуществляли с помощью УФ-детектора. Используемый хроматограф "Милихром-18".

Полученный экзополисахарид осаждают этанолом, ацетоном. На вязкость раствора экзополисахарида рН в интервале 2-11 не влияет. ЭПС термоустойчив до 150^oС, характеризуется биологической стабильностью, устойчив к воздействию микроорганизмов. ЭПС проявляет ярко выраженные свойства полиэлектролитов и имеет повышенную способность к гелеобразованию. Сильно разбавленные растворы ЭПС (0,05%-ный раствор) обладает большой вязкостью при малых скоростях сдвига. Вязкость определялась на ротационном вискозиметре типа "Брукфильд".

Первичный скрининг по базе GenBank показал, что заявленный штамм Rhodobacter antonii принадлежит к α-подклассу протеобактерий. Дальнейший анализ показал, что внутри данного подкласса исследуемый штамм относится к α-3 группе (Rhodobacter-group). Наиболее близкими к исследуемому штамму оказались виды рода Rhodobacter (94,8-96,8% сходства последовательностей 16S рДНК), составляющие с ним единый филогенетический кластер (фиг.1). Однако этот уровень, согласно существующим критериям недостаточен для отнесения штамма Rhodobacter antonii ВКПМ В-8156 к какому-либо описанному виду рода Rhodobacter. Поэтому следует предположить, что заявленный штамм является новым видом рода Rhodobacter.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Бактерии Rhodobacter antonii при росте на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30^oС в течение 48 часов продуцируют 25 г ЭПС, превращая культуральную жидкость в гель. Культивирование штамма осуществляют на жидкой питательной среде состава
Глюкоза - 20,0
К₂НРO₄ - 3,5
MgSO₄•7H₂О - 0,8
FeSO₄•7H₂O - 0,05
NH₄NO₃ - 1,2
NaCl - 1,0
Витаминный комплекс (РР, Н, В₃, В₆) - 0,005
Вода водопроводная, мл - До 1000
В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5% или этанол в количестве 1,5 об.%.

При культивировании на жидкой питательной среде заявленный штамм требует дополнительный фактор роста - ферментализат БВК в количестве 0,2%. Выращивание осуществляют при 28-30^oС в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 мм³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 часов на качалках (220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Rhodobacter antonii 6,8-7,0 и для синтеза ЭПС 6,8-7,2.

Исследовали процесс синтеза ЭПС заявленным штаммом в интервале температур 25-35 град. Для достижения необходимого значения рН приводили подтитровку 10%-ным раствором КаОН. Культивирование осуществляли в условиях согласно примеру 1. Концентрация этанола 2 об.%.

Данные эксперемента приведены в табл.1. Таким образом оптимальное значение рН 6,8-7,2, оптимальное значение температуры для получения максимального выхода ЭПС 28-30 град.

Пример 2.

Периодическое культивирование штамма Rhodobacter antonii осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10 л, рабочий объем 4 л. Используют среду примера 1. В качестве источника углеродного питания применяют этанол в количестве 1 об.%. В качестве инокулята используют штамм, полученный по примеру 1, в колбе на качалке. Количество инокулята 20%.

Условия проведения процесса: температура 28-30 град., рН 6,8-7,2, подача воздуха 0,5 л/л среды в 1 мин, скорость перемешивания 300 об/мин, время культивирования 18-20 час.

Результаты эксперемента представлены в табл.2.

Процесс идет стабильно, ассоциация устойчиво сохраняет свойство синтезировать ЭПС в пяти последовательных ферментациях.

Вязкость раствора ЭПС, синтезируемого заявленным штаммов при малых скоростях сдвига значительно превышает вязкость раствора по прототипу (пат. РФ 2073712), а именно на 43%.

Экзополисахарид, синтезируемый заявленным штаммом использовали при вытеснении нефти из истощенных скважит Сосновского месторождения при минимальных нормах расхода полимера и максимальной эффективности извлечения нефти.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей вязкий экзополисахарид, который может быть использован в различных отраслях промышленности, например в нефтедобывающей. Штамм Rhodobacter antonii ВКПМВ-8156 растет на многих натуральных и синтетических средах, нуждается для роста в витаминах. Штамм продуцирует экзополисахарид с заданными физико-химическими свойствами, а именно высокой вязкостью разбавленных растворов ЭПС при низких скоростях сдвига, что необходимо для их использования при нефтедобыче. 2 табл., 1 ил.

Штамм бактерий Rhodobacter antonii ВКПМ В - 8156 - продуцент экзополисахарида.