ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12P19/00 C12R1/40 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий полисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp. ВКПМ-3243, являющийся продуцентом полисахарида [1], но с использованием дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна возможность получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ-3015 [2]. Экзополисахарид, полученный с его помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известен штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1, продуцирующий экзополисахариды [3]. Недостатком известного штамма, принятого за прототип, является низкий выход экзополисахарида.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента экзополисахаридов.

Поставленная задача решается применением в качестве продуцента экзополисахарида штамма бактерий Pseudomonas putida ИБ 17.

Указанный штамм депонирован в Коллекцию микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером ИБ 17 и первоначально был описан [4] как штамм бактерий Pseudomonas putida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами.

Процесс секреции экзополисахаридов в культуральную жидкость осуществляется при ферментации указанного штамма бактерий на питательной среде Федорова с мелассой.

Состав питательной среды Федорова, г/л: К₂НРО₄ - 0,3; СаНРО₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 40,0; смесь микроэлементов - 1 мл; вода водопроводная до 1 л.

Состав экзополисахарида определен методами ИК-, ¹Н, ¹³С - ЯМР-спектроскопии на спектрофотометре «Specord М-40» и на спектрометре «Bruker AM-300». Было установлено, что выделенный экзополисахарид представляет собой альгинат кальция, содержащий в своем составе фрагменты β-D-маннуроновой (М) и α-L-гулуроновой (G) кислот, находящиеся в пиранозной форме и связанные в линейные цепи 1→4 гликозидными связями (соотношение M/G составляет, в частности, 0,64, содержание кальция 12,8%). Молекулярная масса, определенная при помощи эксклюзионной ВЭЖХ, составляет, в частности, 182 кДа, степень полимеризации доходит до 950. Полученный полисахарид не растворим в холодной воде, хорошо растворим в горячей воде (при температуре от 60°С).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Значительное количество экзополисахарида в количестве 21 г/л штамм Pseudomonas putida ИБ 17 продуцирует при выращивании в течение 48 ч в условиях интенсивной аэрации (200 об./мин) в качалочных колбах Эрленмейера на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода. Инокулят вносили в количестве 3% от объема среды, титр клеток на момент максимальной секреции ЭПС в культуральную жидкость составляет 6·10⁹ КОЕ/мл, при этом культуральная жидкость представляет собой густой гель. Оптимальное значение рН для роста и синтеза полисахарида в данном случае составляет 6,8-7,5; оптимальная температура 25°С.

Пример 2. При использовании высоковязких экзополисахаридов в нефтедобывающей промышленности важной технологической характеристикой является их растворимость в высокоминерализованных нефтепромысловых пластовых водах. При этом расслоение геля при смешении с пластовой водой или образование осадка недопустимо с точки зрения повышения эффективности процесса добычи нефти при закачке экзополисахаридов в продуктивные пласты. Изучали растворимость культуральной жидкости предлагаемого штамма бактерий Pseudomonas putida ИБ 17, полученной по примеру 1, и культуральной жидкости штамма по прототипу в нефтепромысловых пластовых водах. Для этого смешивали 0,1%-ный раствор культуральной жидкости предлагаемого штамма и штамма по прототипу в водопроводной воде с нефтепромысловой пластовой водой, имеющей степень минерализации 140 г/дм³ в различных соотношениях по объему - от 1:1 до 1:15. Результаты экспериментов, приведенные в табл.1, свидетельствуют о хорошей растворимости культуральной жидкости, полученной при ферментации предлагаемого штамма бактерий, в высокоминерализованных пластовых водах, не уступающей растворимости штамма по прототипу. Во всех вариантах эксперимента при смешении культуральной жидкости штамма Pseudomonas putida ИБ 17, содержащей экзополисахарид, с пластовой водой мы получили однородный гель, который не обладал свойством к расслоению.

Таким образом, предлагаемый штамм Pseudomonas putida ИБ 17 обладает высокой продуктивностью при секреции высоковязкого экзополисахарида в среду. Гель, полученный при этом, обладает хорошей растворимостью в минерализованных пластовых водах.

Таблица 1Растворимость культуральной жидкости штамма бактерий Pseudomonas putida ИБ 17 в нефтепромысловой пластовой воде (минерализация - 140 г/дм³)Наименование штамма бактерийОбъемное соотношение 0,1%-ного раствора культуральной жидкости с пластовой водой1:11:31:101:15Pseudomonas putida ИБ 17Однородный гель, не расслаиваетсяОднородный гель, не расслаиваетсяОднородный гель, не расслаиваетсяОднородный гель, не расслаиваетсяШтамм по прототипуОднородный гель, не расслаиваетсяОднородный гель, не расслаиваетсяОднородный гель, не расслаиваетсяОднородный гель, не расслаивается

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1579049, кл. С 12 Р 19/04, 1990.

2. Авторское свидетельство СССР №1698293, кл. С 12 Р 19/04, 1991.

3. Патент РФ №2266324, кл. С 12 N 1/20, 2005.

4. Патент РФ №2213774, кл. С 12 N 1/20, 2003.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм Pseudomonas putida ИБ 17, обладающий высокой продуктивностью экзополисахарида, может быть использован, в частности, в нефтеперерабатывающей промышленности. Изобретение позволяет расширить ассортемент экзополисахаридов, обладающих хорошей растворимостью в высокоминерализованных пластовых водах. 1 табл.

Применение штамма бактерий Pseudomonas putida, ИБ 17 в качестве продуцента экзополисахарида.