ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12N1/20 C12R1/65 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей высоковязкий полисахарид (ЭПС), который может быть использован в частности в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp. ВКПМ В-3243, являющийся продуцентом полисахарида [1], но с использованием дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна возможность получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ В-3015 [2]. Экзополисахарид, полученный с ее помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известен штамм Azotobacter vinelandii BKM В-5933, продуцирующий экзополисахариды [3]. Недостатками известного штамма, принятого за прототип, является то, что экзополисахариды, полученные при его культивировании, недостаточно растворимы в высокоминерализованных пластовых и сточных водах нефтепромыслов, что осложняет использование таких биополимеров в нефтедобывающей промышленности. Кроме того, штамму по прототипу для продуцирования ЭПС необходимы дорогие источники углеродного питания (сусло, этанол, глюкоза) и дополнительное внесение фактора роста (ферментализат БВК).

Решаемая предполагаемым изобретением задача и ожидаемый технический результат заключаются в расширении ассортимента экзополисахаридов, пригодных, в частности, к применению в нефтедобывающей промышленности и обладающих хорошей растворимостью в высокоминерализованных водах и необходимыми регулирующими свойствами при вытеснении нефти из пласта.

Поставленная задача решается применением продуцента экзополисахарида штамма бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 1.

Указанный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером ИБ 1 и первоначально был описан [4] как штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая.

Штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1 выделен из образца пахотных земель, отобранного в Уфимском районе Республики Башкортостан.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: КН₂PO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; К₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции.

На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5-1,5 мкм, подвижные; на 48-72 часу - палочки, есть цисты, встречаются палочки клостридиальной формы.

1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющей состав, г/л: К₂HPO₄ - 0,8; КН₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO₄ - 0,1; Fe₂(MoO₄) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; рН 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.

1.3. На твердой питательной среде с бензойнокислым натрием в качестве единственного источника углерода рост отсутствует. При внесении бензойнокислого натрия в среду в количестве 0,15% рост хороший.

1.4. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; рН 6,8-7,0, выращивание при температуре плюс 28±1°С и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 60 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.5. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.

1.6. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные, диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-48 часу роста клетки - длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные, встречаются палочки клостридиальной формы.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°С.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает манит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол. Слабо растет на МПА.

Хорошо растет на среде с уксуснокислым натрием в качестве единственного источника углерода.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·10¹⁰ кл/мл. Не погибает при нагревании при 50°С в течение 15 мин.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative.

Процесс секреции экзополисахаридов в культуральную жидкость осуществляется при ферментации указанного штамма бактерий, например на питательных средах Федорова с мелассой и картофельно-глюкозной среде.

Состав питательной среды Федорова, г/л: К₂HPO₄ - 0,3; СаН-PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 40,0; смесь микроэлементов - 1 мл, вода водопроводная до 1 л.

Состав картофельно-глюкозной питательной среды, г/л: картофель тертый - 200; глюкоза - 20; вода водопроводная - 1 л.

При культивировании штамма бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 1 на указанных питательных средах нет необходимости во внесении дополнительного фактора роста для синтеза экзополисахаридного комплекса, каким является белково-витаминный концентрат для штамма по прототипу.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Значительное количество экзополисахарида в количестве 16 г/л штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1 продуцирует при выращивании в течение 48 ч в условиях интенсивной аэрации (200 об/мин) на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода. Инокулят вносили в количестве 3% от объема среды, титр клеток на момент максимальной секреции ЭПС в питательную среду составляет 5·10¹ КОЕ/мл, при этом культуральная жидкость представляет собой густой гель. Оптимальное значение рН для роста и синтеза полисахарида в данном случае составляет 6,8-7,5, оптимальная температура 25°С.

Пример 2. При выращивании штамма на жидкой картофельно-глюкозной среде через 48 ч она также превращается в гель. Количество продуцируемого полисахарида в данном случае составляет 12 г/л. Инокулят вносили в количестве 3% от объема среды, титр клеток на момент максимальной секреции ЭПС в питательную среду составляет 8·10⁹ КОЕ/мл. Оптимум рН составляет 6,0-7,2, температура культивирования 25°С.

Синтез полисахарида осуществляется штаммом в интервале рН 6,0-7,8 и температуре в пределах 20-28°С. Необходимое значение рН поддерживается за счет периодической подтитровки 10%-ным раствором NaOH. При соблюдении оптимальных условий культивирования штамм продуцирует ЭПС в шести последовательных ферментациях.

В состав экзополисахарида, полученного с помощью заявляемого штамма, входят нейтральные моносахариды, глюкоза, манноза, ксилоза, галактоза и уроновые кислоты, которые представлены маннуроновой и гулуроновой кислотами. Определение осуществляли методом жидкостной хроматографии на ВЭЖХ в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572Р ("Gasukuro Kogyo", Япония), детектора - рефрактометра ("Du Pont", США).

Пример 3. Изучали растворимость культуральной жидкости предлагаемого штамма бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 1, полученной по примеру 1 и культуральной жидкости штамма по прототипу в нефтепромысловых пластовых водах. Для этого смешивали 0,1%-ный раствор культуральной жидкости предлагаемого штамма и штамма по прототипу в водопроводной воде с нефтепромысловой пластовой водой, имеющей степень минерализации 140 г/дм³, в различных соотношениях по объему - от 1:1 до 1:15. Результаты экспериментов приведены в табл.1. Приведенные в табл.1 результаты свидетельствуют о хорошей растворимости культуральной жидкости, полученной при ферментации предлагаемого штамма бактерий, в высокоминерализованных пластовых водах. Культуральная жидкость штамма по прототипу ограниченно растворима в пластовых водах с высокой степенью минерализации.

Пример 4. Культуральная жидкость, полученная при ферментации штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1 по примеру 1 и содержащая экзополисахариды, использована в лабораторном модельном эксперименте в качестве потокоотклоняющего агента, применяемого на поздней стадии разработки месторождений с целью регулирования заводнения. Эксперимент по фильтрации был проведен на нефтенасыщенных кернах Приобского месторождения в термобарических условиях пласта. Характеристика пористой среды и рабочих жидкостей приведена в табл.2.

Результаты эксперимента приведены в табл. 3, из которых видно, что водный раствор культуральной жидкости, содержащей экзополисахариды, обладает необходимыми регулирующими свойствами. Так, на стадии доотмыва фактор сопротивления составил 117, а фактор остаточного сопротивления оказался равен 9,47, что является весьма высоким результатом для биополимеров. Коэффициент вытеснения при этом увеличился на 3%, а остаточная нефтенасыщенность снижена на 2%.

Таблица 2Характеристика пористой среды и рабочих жидкостейПараметрЗначенияДлина пористой среды, см16,54Диаметр пористой среды, см2,84Пористость, %0,1736Температура, °С87Проницаемость по газу, мкм²0,0463Проницаемость по керосину, мкм²0,029Проницаемость по нефти, мкм²0,028Объем пор пористой среды, см³18,01Начальная нефтенасыщенность, %0,6841Остаточная нефтенасыщенность, %0,2820Скорость вытеснения, м/г231,135Вязкость нефти, мПа·с1,6665Плотность нефти, г/см³0,8068Вязкость сеноманской воды, мПа·с0,3958Плотность сеноманской воды, г/см³0,9890Объем оторочки биополимера, V_п (разбавление культуральной жидкости водой 1:1)0,5

Таблица 3Результаты фильтрационных исследований в стадии вытеснения нефти водой и доотмываполимерным составомВытесняющий агентКоэффициент вытеснения нефти, д.е.Расход воды, V_пРасход полимера, V_пОстаточная нефтенасыщенность, %Градиент давления, мПа/мФактор остаточного сопротивленияза безводный периодконечныйза безводный периодконечныйв момент прорыва водыконечныйПластовая вода0,37600,58780,25703,0671-0,28200,18200,1131-Культуральная жидкость-0,6177-1,37690,50,2615-1,50719,47

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1579059, кл. С 12 Р 19/04, 1990.

2. Авторское свидетельство СССР №1698293, кл. С 12 Р 19/04, 1991.

3. Патент РФ №2073712, кл. С 12 N 1/20, 1997.

4. RU 2002116983 A, 10.02.2004.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования культуры микроорганизмов, продуцирующей высоковязкий полисахарид в нефтедобывающей промышленности. Штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1 способен продуцировать 16 г/л экзополисахарида, тем самым превращая среду в гель. Гель обладает необходимыми регулирующими свойствами для вытеснения нефти из истощенных скважин. 3 табл.

Применение штамма бактерий Azotobacter vinelandii, депонированного в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером ИБ 1, в качестве продуцента экзополисахарида.