Штамм бактерий LастовасILLUS рLаNтаRUм - продуцент рестриктазы LP @ Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молеку- лярно-генетических исследованиях, микробиологической промышленности, в практике научно-исследовательской работы.

Цель изобретения - выявление штамма Lactobacillus plantarum - продуцента ре- стриктазы, обладающей более высоким выходом фермента.

Штамм - продуцент Lactobacillus plantarum BKM В-578 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в анаэробных условиях, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза LpPl, изошизомер эндонук- леазы рестрикции Clal узнает участок АТС G А Т и расщепляет ДНК фага А в 15 участках, аденовируса 2 в двух, pBR322 в одном и не гидролизует ДНК вируса SV40 и0X174.

Рестриктаза LpC I представляет собой ценный инструмент для молекулярно-гене- тических исследований. Фермент имеет один участок расщепления на плазмиде pBR322 в гене, ответственном за устойчивость к тетрациклину. Это обстоятельство

о VJ

00 00

со ю

позволяет использовать вектор pBR322 для клонирования любого фермента ДНК с 5 -pCG - выступающими концами. Такие фрагменты ДНК образуются рестриктазой LpEl, атакжеТар , Нра II, Асу I, HgiD I, ScIN I, Nar , Asu и другими.

Поиск штамма - продуцента проводили при помощи разработанного экспресс-метода определения активности рестриктаз в толуольных экстрактах бактериальных кле- ток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДИК в агарозном геле. Штамм бактерий Lactobacillus piamarum 578 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под № В КМ В-578 ССМ 1845, 1904 АТСС 8014 NCIB 8030, 6376 МСТС 6376. Характеристика штамма. Морфологические свойства. Палочки, часто образуют цепочки, неподвижны, грам- положительны.

Кульгурально-биохимические свойства. На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на агаре мелкие, блестящие, края ровные. На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера - осадок, бульон прозрачный.

Отношение к кислороду - анаэроб. Утилизация углеводов - на глюкозе, лактозе, мальтозе, манните, сахарозе образует кислоту.

Индол и сероводород - не образует. Желатина уколом - разжижения нет, Чувствительность к антибиотикам. Культура чувствительна ко многим антиби- отикам: пенициллину, стрептомицину, кана- мицину, тетрациклину, хлорамфениколу, эритромицину, олеандомицину, неомицину, карбенициллину, линкомицину, гентамици- ну, метициклину, оксациллину, нистатину, ампициллину; резистентна к полимиксину. Оптимальные условия выращивания и хранения. Культура хорошо растет на МПБ, бульоне Хоттингера, среде LB и среде № 7, без аэрации, при 30-37°С.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу LpBl, получают при выращивании на питательной среде, которая содержит а 1 л, г: дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; NazHP04 12 Н20 2,2; NaC 3; MgSO 0,5; 0,25.

Существенным фактором культивирования являются анаэробные условия. В аэробных условиях снижается выход фермента. Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках известными способами.

Пример 1, Культуру LactobaciHus piantarum штамм 578 предварительно адаптируют на основной питательной среде, cpj-

держащей в 1 л i. дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; N32HP04 12Н20 2,2; NaCI з; MgS04 0,5; CaCl2 0,25; при 37°С в течение ночи. Инокулят для ферментации готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10, и размножают в отсутствие аэрации, Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37°С при отсутствии аэрации; рН среды 7,2+0,2. Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,4-7,6. Выращивание продолжают до конца лаг-фазы.

Выход биомассы составляет 7 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы Lpl I 6 х 105 ед./r биомассы.

Определение активности фермента проводят с помощью экспресс-метода в толуольных лизатах бактериальных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле.

Выделение рестриктазы Lpfl. 3 г биомассы Lactobacillus piantarum 578суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2-4°С. После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют 1 %-ным полиэтиленимином и затем подвергают фракционированию в двухста- дийной системе полиэтиленгликоль/де- кстран. Обогащенный рестриктазой экстракт диализуют и хроматографируют в калий-фосфатном буфере на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (DE-52, Ватман), затем на колонке с голубой сефарозой.

Получают 1,7 х 105 ед. фермента на г биомассы в 27,5 мл глицеринового буфера. Препарат рестриктазы Lpl I стабильно сохраняет активность в течение 9-12 мес. Фермент пригоден для анализа структуры ДНК и молекулярного клонирования,

Пример 2. Культивирование штамма Lactobacillus piantarum 578 проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду, которая содержит в 1 л: бульон Хоттингера 250 мл; глюкоза 20 г. Выход биомас- сы 8 г/л культуральной жидкости, Содержание рестриктазы в биомассе 7 х 10 ед./r сырой биомассы.

После проведения очистки, выход рестриктазы LpCl составил 1,6 х 105 ед./r биомассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестри- кацим LpEl,

Биомасса штамма Lactobacillus piantarum 578 содержит новую рестриктазу LpCl, узнающую и расщепляющую нуклео5 16788326

тидную последовательность ДНК - А Gсоставляет 1,6-1,7 х 105ед активности на 1

AT, в количествах, достаточных для получе-г сырой биомассы, что примерно в 400 раз

ния рестриктазы в препаративных масшта-превышает значения, указанные для известбах, Содержание рестриктазы в биомассеной рестриктазы Clal (430 ед.).

6-7 х 10 ед,/г сырой биомассы. Для изоши-5 Формулаизобретения

зомера LpEl - рестриктазы Clal, выход очи-Штамм бактерий Lactobaclllus

щенного фермента на 1 г биомассы околоplantarum ВКМ В-578 - продуцент рестрик430 ед. Выход очищенной рестриктазы Lptlтазы LpBl.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молеку- лярно-генетических исследованиях, микробиологической промышленности, в практике научно-исследовательской работы, Целью изобретения является выявление штамма Lactobacillus plantarum, обладающего более высоким выходом фермента. Штамм - продуцент Lactobacillus plantarum BKM В-578 выращивают в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Lactobacillus plantarum 578 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Lp0l, узнающую и расщепляющую нук- леотидную последовательность ДНК 5 А С G А Т в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Содержание рестриктазы в биомассе 6-7x10 ед./г сырой биомассы. Для изоши- зомера LpBI - рестриктазы Clal выход очищенного фермента около 430 ед./г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Lp6 I 1,6-1,7х105 ед./г сырой биомассы, что примерно в 400 раз превышает известные цифры для рестриктазы Clal (430 ед.) сл с